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基因克隆的载体
载体（vector）是由在细胞中能 够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种 遗传成分，通过实验手段可使其它的 ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行 复制，作为基因工程的载体，必须具 备以下几个性能：
1、分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。
2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。
3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制
主要基因
非接合型质粒 自主复制基因，长生大肠杆菌素基因
按抗性记号分类 Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基因
R质粒(R因子)
自主复制基因，转移基因，细菌染色体区段 F质粒（ F因子）
自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因 自主复制基因，转移基因，抗菌素抗性基因 自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因
流程：
首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠 （SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。
将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的 大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链 的碱基中去。
在EB达到饱和时，进行氯化铯密度 梯度离心。
2.碱变性法：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。
酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。
4、有适合的标记，易于选择。
5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达， 并且尽可能是高效的表达。
6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于 在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。
载体
功能
克隆载体: 克隆一个基因或DNA片断
作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适 当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的 质粒载体。
质粒（plasmid）
是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA 分子。大小约为 数千碱基对。常 有1 ~ 3个抗药 性基因，以利于 筛选。
质粒载体
1. 克隆的质粒载体 允许外源的DNA插入，储存。主要 是DNA水平上的操作。
Pel oBAC系列
100 - 2000 kb
PCYPAC1
100 - 2000 kb
〉 1000 kb
SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体
pSVK3质粒，PBV, Ti质粒
第一节 质粒（plasmid）载体
质粒是一种独立于染色体外的小分子环状 DNA，一般大小约106~108D，可自身复制和表 达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药 性基因，所以质粒经过适当改选后便可成为良 好的载体。
在PH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA 会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变 性。
通过冷却或恢复中性PH值使之复性，线性 染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅 速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有 cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质 粒DNA
3.碱变性法：
1、取1.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在 微量离心管中，离心收集细胞沉淀；
表达载体: 用于一个基因的蛋白表达
整合载体: 把一个基因插入到染色体组中
载体
来源： 质粒载体 噬菌体载体 柯斯质粒载体 真核细胞克隆载体
载体的种类和特征
质粒*
受体细胞 E.coli
λ 噬菌体
E.coli丝状噬菌体及噬菌粒源自E.coli粘粒载体
E.coli
BAC (Bacterial Artificial Chromosome)
2. 基因表达的质粒载体 允许外源DNA的插入、储存和表达。
一、质粒的生物学特性：
1、质粒DNA的构型：
SC型 共价闭合环形DNA（cccDNA） OC型 开环DNA（ocDNA） L 型 线性DNA（cDNA）
2、不同质粒的分子量大小差异相当显著：
106~108D
3、作为载体的质粒都含有三种共同的组分：
Col质粒 R质粒(R因子) Ent质粒
6、质粒DNA的复制类型：
低拷贝的质粒（1～3）：严紧型复制控制的质粒
（接合型） 高拷贝的质粒（10~60）：松弛型复制控制的质粒 （非接合型）
7、质粒的不亲合性
在同一个大肠杆菌细胞，一般不能同时含有两种不 同的。也称为质粒的不相容性。
是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切 的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共 存的现象。
复制基因（replicator）、选择性记号、克隆位点
L OC SC
4、质粒DNA编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。
抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方式的因子都等
5、质粒DNA的类型： 接合型和非接合型；含大肠杆菌素Col质粒和含抗菌 素抗性基因的R质粒；F因子和F`因子等。
按接合转移功能分类
结构 环状 线状 环状 环状 环状 环状 线性染色体
线性染色体 环状 环状
插入片断 〈 8*
9 - 24kb
〈 10 kb 35- 45kb ≈300 kb
举例
pUC18/19 , T-载体 pGEM- 3z等 EMBL系列， Λ gt系列 M13mp系列
pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV
质粒的不亲合性分子基础，主要是由于它们在复制 功能之间的相互干扰造成的。
（二 ） 、质粒DNA的分离与纯化
1、氯化铯密度梯度离心法； 2、碱变性法； 3、微量碱变性法。
1.氯化铯密度梯度离心法
1、质粒DNA占总DNA的1%～2%； 2、在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子
量的细菌染色体易断裂成线性片断，而质 粒DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的 状态； 3、染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA 链的碱基中，导致链的解旋；而且形成的 EB- DNA复合物中，EB含量越高，密度会 越低。
PAC (P1-derived Artificial chromosome)
YAC (Yeast Artificial chromosome )
MAC (Mammalian Artificial Chromosome)
E.coli E.coli 酵母细胞 哺乳类细胞
病毒载体
动物细胞
穿梭载体
动物细胞 和细菌
2、加入100微升冰冷的液，（50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA，4~5mg 溶菌酶）静置5分钟；
3、加入200微升微冷的液（0.2NaOH，1.0%SDS） 缓缓混匀置室温5分钟。
载体（vector）是由在细胞中能 够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种 遗传成分，通过实验手段可使其它的 ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行 复制，作为基因工程的载体，必须具 备以下几个性能：
1、分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。
2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。
3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制
主要基因
非接合型质粒 自主复制基因，长生大肠杆菌素基因
按抗性记号分类 Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基因
R质粒(R因子)
自主复制基因，转移基因，细菌染色体区段 F质粒（ F因子）
自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因 自主复制基因，转移基因，抗菌素抗性基因 自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因
流程：
首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠 （SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。
将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的 大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链 的碱基中去。
在EB达到饱和时，进行氯化铯密度 梯度离心。
2.碱变性法：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。
酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。
4、有适合的标记，易于选择。
5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达， 并且尽可能是高效的表达。
6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于 在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。
载体
功能
克隆载体: 克隆一个基因或DNA片断
作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适 当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的 质粒载体。
质粒（plasmid）
是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA 分子。大小约为 数千碱基对。常 有1 ~ 3个抗药 性基因，以利于 筛选。
质粒载体
1. 克隆的质粒载体 允许外源的DNA插入，储存。主要 是DNA水平上的操作。
Pel oBAC系列
100 - 2000 kb
PCYPAC1
100 - 2000 kb
〉 1000 kb
SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体
pSVK3质粒，PBV, Ti质粒
第一节 质粒（plasmid）载体
质粒是一种独立于染色体外的小分子环状 DNA，一般大小约106~108D，可自身复制和表 达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药 性基因，所以质粒经过适当改选后便可成为良 好的载体。
在PH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA 会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变 性。
通过冷却或恢复中性PH值使之复性，线性 染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅 速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有 cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质 粒DNA
3.碱变性法：
1、取1.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在 微量离心管中，离心收集细胞沉淀；
表达载体: 用于一个基因的蛋白表达
整合载体: 把一个基因插入到染色体组中
载体
来源： 质粒载体 噬菌体载体 柯斯质粒载体 真核细胞克隆载体
载体的种类和特征
质粒*
受体细胞 E.coli
λ 噬菌体
E.coli丝状噬菌体及噬菌粒源自E.coli粘粒载体
E.coli
BAC (Bacterial Artificial Chromosome)
2. 基因表达的质粒载体 允许外源DNA的插入、储存和表达。
一、质粒的生物学特性：
1、质粒DNA的构型：
SC型 共价闭合环形DNA（cccDNA） OC型 开环DNA（ocDNA） L 型 线性DNA（cDNA）
2、不同质粒的分子量大小差异相当显著：
106~108D
3、作为载体的质粒都含有三种共同的组分：
Col质粒 R质粒(R因子) Ent质粒
6、质粒DNA的复制类型：
低拷贝的质粒（1～3）：严紧型复制控制的质粒
（接合型） 高拷贝的质粒（10~60）：松弛型复制控制的质粒 （非接合型）
7、质粒的不亲合性
在同一个大肠杆菌细胞，一般不能同时含有两种不 同的。也称为质粒的不相容性。
是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切 的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共 存的现象。
复制基因（replicator）、选择性记号、克隆位点
L OC SC
4、质粒DNA编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。
抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方式的因子都等
5、质粒DNA的类型： 接合型和非接合型；含大肠杆菌素Col质粒和含抗菌 素抗性基因的R质粒；F因子和F`因子等。
按接合转移功能分类
结构 环状 线状 环状 环状 环状 环状 线性染色体
线性染色体 环状 环状
插入片断 〈 8*
9 - 24kb
〈 10 kb 35- 45kb ≈300 kb
举例
pUC18/19 , T-载体 pGEM- 3z等 EMBL系列， Λ gt系列 M13mp系列
pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV
质粒的不亲合性分子基础，主要是由于它们在复制 功能之间的相互干扰造成的。
（二 ） 、质粒DNA的分离与纯化
1、氯化铯密度梯度离心法； 2、碱变性法； 3、微量碱变性法。
1.氯化铯密度梯度离心法
1、质粒DNA占总DNA的1%～2%； 2、在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子
量的细菌染色体易断裂成线性片断，而质 粒DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的 状态； 3、染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA 链的碱基中，导致链的解旋；而且形成的 EB- DNA复合物中，EB含量越高，密度会 越低。
PAC (P1-derived Artificial chromosome)
YAC (Yeast Artificial chromosome )
MAC (Mammalian Artificial Chromosome)
E.coli E.coli 酵母细胞 哺乳类细胞
病毒载体
动物细胞
穿梭载体
动物细胞 和细菌
2、加入100微升冰冷的液，（50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA，4~5mg 溶菌酶）静置5分钟；
3、加入200微升微冷的液（0.2NaOH，1.0%SDS） 缓缓混匀置室温5分钟。