《基因克隆》PPT课件

4 Ⅱ型酶作用特点
Ⅱ型酶有严格的识别、切割 顺序，以内切方式水解双链DNA 中的磷酸二酯键，产生的DNA片 段5’端为P，3’端为OH。
识别顺序一般为4—6个碱基，通常是反
转重复顺序，具有180°的旋转对称性,也 称回文结构，palindrome,具有对称结构的 DNA片段。一条链上的碱基顺序（例如从 5‘3’）和另一条链上从5‘ 3’的顺 序完全相同。例如，
Herbert Boyer
Stanley N. Cohen
“工程鲫”、“工程 鲤”
多 利 和 它 的 孩 子
沃 尔 小 组 成 功 克 隆 两 只 恒 河
猴
吴明杰小组：5只克 隆猪
第二节 重要的工具酶
• 限制性核酸内切酶； • DNA聚合酶； • DNA连接酶； • T4多核苷酸激酶； • 碱性磷酸酶。
Q: Which of the following 2 DNA sequences is a potentional RE recognition site?
Ⅰ. 5’ AGTTGA 3’
Ⅱ. 5’ GCACGTGC
3’
Q: If show below is ½ of a RE site, what is the DNA sequence for the remaining ½?
5‘ 3‘
5‘ 3‘
5‘ 3‘
3‘
5‘
限制性内切酶
3‘ 5‘
5‘末端突出 的DNA
Klenow DNA聚合酶
[α-32P]dNTP
3‘
5‘
3‘末端标记 的DNA
32P末端标记的单 链DNA探针
32P标记的DNA
利用Klenow片段进行3‘端标记
2 Tag DNA聚合酶 用途：PCR和测序
3 反转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶， RDDP）
Ex. EcoRⅠ
GAATT C C TTAAG
Agarose Gel Electrophoresis
3 命名原则
H．O．Smith和D．Nathams(1973)提 议的命名系统已被公众所接受，其命名 原则如下：
• 限制酶第一个字母(大写，斜体)代表该酶的微 生物(寄主菌)属名；第2、3个字母(小写，斜 体)代表微生物种名。
• 在实验操作中 ，限制酶从冰箱中取出后，应立即置于冰浴中，操作时一般 是将其它试剂加完后，最后加酶，操作迅速。
• 当反应体系中有两种限制酶时，如何处理。
7 少数有特殊性质的Ⅱ型酶
• 异源同工酶（isoschizomer）:是从不同生物中分离出来 的酶，但有相同的识别顺序，切割DNA的位点可以相同， 也可以不同。
5‘
TTTAAA
3’
AhaⅢ
5‘-TTT
3’ AAATTT 5’ 或DraⅠ 3’-AAA
+
AAA-3’ TTT-5’
5‘ GGTACC 3’ KpnⅠ 5‘ GGTAC
3’ CCATGG 5’
3’ C’
+
5‘ GGTACC 3’ Asp718Ⅰ 3’ CCATGG 5’
5‘ G
+
3’ CCATC
用途：
• 从DNA片段上除去5‘磷酸以防自身连 接；
• 在用T4多核苷酸激酶和32P标记5‘末 端前，从RNA或DNA上除去5’磷酸。
感谢下 载
• 给载体或cDNA加上互补的多聚体尾巴，造成便 于重组的人工粘性末端；
• 也可用于DNA片段3’端标记。
ห้องสมุดไป่ตู้
三、DNA连接酶
作用：催化两个独立DNA片断5‘磷酸基与3’羟 基之间形成磷酸二酯键。
作用底物：
• 两个不同片段双链DNA 间存在的互补粘性末 端；
• 两个双链DNA分子间的 平末端；
• 一条带切口的双链DNA 分子；
5’ TCA _ _ _ 3’
从理论上讲，如果DNA链上的A、T、 C和G四种碱基随机分布，根据限制酶识 别碱基的个数可估算限制酶的切割几率， 同时也决定了它切割DNA后产生的DNA片 段的长度。实际上，限制酶对DNA的切 割是“全”或“无”。
识别4个碱基 识别6个碱基 识别8个碱基
1/44=1/256 1/46=1/4096 1/48=1/65536
5‘ GAATTC 3’ 3’ CTTAAC 5’
RE recognition/cleavage site are palindromic DNA sequences, not palidromic as in “ABBA”.
E.x. EcoRⅠ 5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5' These sites are DNA sequence that are identical on both DNA strands.
3‘
5‘
Mg2+
DNA酶Ⅰ
5‘
3‘
3‘
5‘
dATP、dCTP
大肠杆菌聚合酶Ⅰ
dGTP、[α-32P]dTTP
（全酶）
5‘
*T *T
3‘
3‘
5‘
5‘
*T *T *T
*T
3‘
3‘
5‘
用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ进行切口平移
klenow片断的主要用途
• 末端终止法 测序；
• 合成cDNA第 二链；
• 双链DNA3’ 端标记。
三、意义
• 重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟； • 重组DNA技术缩短了进化时间； • 重组DNA技术使人能对生物进行定向改造。
基因工程大事记
• 1973 Cohen第一例成功的克隆实验 • 1978 Genentech公司 人胰岛素 世界上第一种基因工程蛋白药物 • 1982 第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获准使用 • 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 转基因鱼
基因工程及体外表达体 系（1）.酶
心血管病研究所 王佐
基因工程及体外表达体系
•酶 • 载体 • 方法
第一节 概述
• 定义 • 基本步骤 • 意义
定义：应用酶学的方法，在体外将目的
基因与载体DNA结合成一具 有自
我复制能力的DNA分子（复 制
子、重组体），继而通过转 化或
转染宿主细胞、筛选出含有 目的
35kD
N
5‘3’外切酶
76kD
5‘3’聚合酶
3‘5’外切酶
大肠杆菌DNA
C 聚合酶Ⅰ
用枯草杆菌蛋白酶裂解全酶
76kD
5‘3’聚合酶
3‘5’外切酶
klenow片段
C klenow
片段
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的用途
• 催化DNA切 口平移，制 备高比活探 针；
• 对DNA分子 进行末端标 记。
5‘
3‘
2 分类
限制酶可分为3型。
➢I型和Ⅲ型限制酶同时具有限制与修 饰两种功能; ➢I型限制酶没有固定的切割位点，随 机切割产生非专一切口；
➢ Ⅲ型限制酶在DNA链上有特异切割位点，但其切割位点在识别位点以外。
I型和Ⅲ型限制酶在分子克隆中用 途不大。通常所指的限制酶是Ⅱ型酶。
Ⅱ型酶对DNA水解有很强的特异性， 它要求严格的顺序作为切割点。切点顺 序中有一个碱基的变异、缺失或修饰， 便不再被水解，因此在分子克隆中常用， 它被誉为分子生物学家的手术刀。
5‘NN……NGAAGANNNNNNNNNN……N3’
• 可变酶：这类酶是Ⅱ型酶中的一个特例，它们的识别序列中1个或几个核苷 酸是可变的，并且其识别序列一般大于6个碱基对。
E.x.
DraⅢ
CACNNNGTG
二、DNA聚合酶 功能：在体外合成DNA
1 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ及其大片 段（klenow片段）
• 一条带切口的RNA/DNA 杂交体。
四、T4多核苷酸激酶
作用： 催化将ATP的γ-磷酸转移到DNA链的
5‘末端上。
用途：
• 放射性标记DNA链的5‘端，用于DNA 测序等实验中；
• 用于连接反应，使缺少5‘端磷酸的 DNA片段或合成接头磷酸化。
五、碱性磷酸酶
作用：
催化切除DNA、RNA和dNTP上的5‘磷酸基团。
• 1993 基因工程西红柿在美国上市 • 1997 英国罗斯林研究所 多莉羊 • 1999.9 中国获准加入人类基因组计划.
负责测定人类基因组全部序列的1% • 2000.6.26科学家公布人类基因组工作草图 • 2001.2.11 公布人类基因组基本信息 • 生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程、干细胞
• 接下来的字母代表寄主菌的株或型。 • 如果从一种菌株中发现了几种限制酶，则根据
发现和分离的顺序用罗马字母表示。
从大肠杆菌（E.coli）R菌株分离到的 几 种 限 制 酶 ， 分 别 表 示 为 EcoRⅠ 、 EcoRⅡ 、
EcoRⅤ等。
Restriction Endonuclease Enzymes
一、Restriction Endonucleases
1 定义 限制性核酸内切酶（限制酶），是一类能识别和切割双链DNA分子内特
定碱基顺序的核酸水解酶。
Restriction Endonucleases
Made by bacteria and viruses. Over 500 Restriction endonucleases exist. These will cleave over 80 specific sequences.
基因的转化子细胞，再进行
• Recombinant DNA technology • Gene cloning • Molecular cloning • Gene engineering • Genetic engineering
二、基本步骤
• 目的基因的获得； • 目的基因与载体的连接； • 重组DNA分子导入受体细胞； • 筛选出含重组DNA分子的受体细胞克隆； • 克隆基因的表达及表达产物的检测和分离纯化。
5‘ AGATCT 3’ 3’ TCTAGA 5’
• 远距离裂解酶（distant cleavage）:这类酶的识别位点与切割位点不一致， 但其切割位点与识别位点的距离是一定的，一般为10个碱基左右。它们在某 一核苷酸区域与识别序列结合，然后滑行到识别序列以外的另一个位点进行 切割。
E.x.
MboⅡ
• 能以单链RNA或单链DNA为模板，按5’→3’方向合成DNA； • 有5’ →3’和3’ →5’RNA外切酶活性（3’ →5’外切活性又称RNA酶H活
性）。
主要用途：
转录mRNA成为cDNA。
4 末端脱氧核糖核酸转移酶(末端转移 酶)
功能：
催化脱氧核苷酸一个个地依次 加到DNA3’末端。
主要用途：
5 Ⅱ型酶切割双链DNA产生的切口
(1)在识别顺序的对称轴上，对双链DNA同时 切割，产生平头末端(blunt end).
3’53’’--GCGC↓↑CGCG--35’’→ HaeⅢ
5’-GG 3’-＋CC
CCGG-5’
(2)在识别顺序的两个对称点切开DNA双链，产生带 单链尾巴的粘性末端(cohesive end)；
• 对离子强度的要求分为3个级别，即高盐 (100mmol/LNaCl) 、 中 盐 (50mmol/LNaCl) 和 低 盐(0~l0mmol/LNaCl)。
• 星号活力：限制酶在非标准反应条件下，能切 割一些与其识别顺序类似的序列，降低酶切的 特异性。
EcoRI 5’GAATTC3’
EcoRI* 5’NAATTN3’
从5’端切割产生5’端突出的粘性末端。
(3)从3’端切割产生3端突出的粘性末端。
6 限制酶使用中的注意事项
• 酶的活性单位：l小时内在50μl容积中酶解l μg DNA所需要的酶量。 • 一般都要求较纯的底物DNA；都需要Mg2＋和Tris－HCl缓冲体系；通常在
37℃(有些酶需要在50—65℃)反应；
C 3’ CATGG 5’ GTACC 3’
G 5’
• 同尾酶（isocaudarner）：为识别与切割顺序相互有关的 酶。有些限制酶的识别序列包含在另一些限制酶的识别顺 序中。这些酶虽来源不同，但它们能产生相同的粘性末端。
MboⅠ BamHⅠ BglⅡ
5‘ GATC 3’ 3’ CTAG 5’
5‘ GGATC 3’ 3’ CATGG 5’