第一章基因克隆载体

五、多种功能的衍生质粒的组建
（一）、带有不同种类抗性基因的质粒 载体 （二）、高拷贝数质粒pAT153 （三）、正选择质粒 （四）、多功能质粒-PUC质粒

带有不同种类抗性基因的质粒 载体

pBR328是从pBR322改建成的质粒，大小 为4.907kb,它具有Ampr、Tetr和Cmlr基因。 Cmlr基因有EcoRI、PvuⅡ和BalI的单一酶 切位点。除了pBR328外，pBR325也有类 似结构。
三、质粒载体的选择
作为理想的质粒载体，应具备以下几 个条件（1）能自主复制，即本身是复制 子（2）具有一种或多种限制酶的单一切 割位点，并在此位点中插入外源基因片 段，不影响本身的复制功能；（3）在基 因组中有1-2 个筛选标记，为寄主细胞提 供易于检测的表型特征，（4）分子量要 小，多拷贝，易于操作。
第三节

真核细胞的克隆载体
一、在酵母细胞中克隆基因常用的载体 （共同特点） 1.整合型载体（YIP） 2.复制型载体（YRP） 3.附加体型载体（YEP） 二、植物基因克隆的载体——Ti质粒 三、动物细胞基因克隆的载体
整合型载体（YIP）

YIP型载体是由大肠杆菌质粒和酵母的 DNA片段构成的。如Pyeleu10是由ColEI 质粒和酵母DNA提供的亮氨酸基因 （Leu2+）片段构成，在细菌中复制、扩 增，进入酵母后可整合表达。YIP型载体 的特点是转化率低(只有1-10转化子/微克 DNA)，但转化子遗传性稳定稳定，多用 于遗传分析工作。
四、大肠杆菌质粒载体
1． pSC101质粒载体 2．pBR322质粒载体

– 分别由pMB1 (ori)、pSF2124(Ampr ) 和
pSC101(Tetr) 三种质粒通过载体改造后形成， 使之具有松弛型ori和Ampr及Tetr两种抗性 基因的理想的基因克隆载体。 Ampr （Scal、PvuI、PstI切点 ） Tetr （EcoRI、Nhel、BamHI、SphI、 HindIII切点 ）
复制型载体（YRP）

YRP型载体是带有选择标记和复制子的酵母的 DNA片段插入到大肠杆菌质粒中构成的。因为 它同时含有大肠杆菌和酵母的自主复制基因， 所以能在两种细胞中存在和复制。可以在两种 截然不同的生物细胞中复制的载体称为穿梭载 体（Shuttle Vector），（如图3-20）穿梭载体 在基因工程中广泛使用。 YRP型载体转化率高， 拷贝也高，但不稳定，易丢失。


质粒的存在形式：呈共价闭合环状
①超螺旋的SC构型 （cccDNA） ②松弛开环的OC型 （ocDNA） ③松弛线性的L构型（cDNA）
基本步骤： 细菌生长和质粒的扩增 菌体收获和溶菌 质粒纯化
氯化铯浮密度分离法
当各种 DNA 分子在有饱和溴乙锭染料存在 下进行氯化铯密度梯度离心时，与共价闭环状 分子结合的染料要大大少于与开环状或线状 DNA的结合，因此，在氯化铯梯度离心中质粒 DNA与染料相结合后生成的条带是在较高的密 度范围内，而断裂为线状的染色体DNA与溴乙 锭结合较多，生成的条带是低密度范围。所以， 离心后形成 2 条带，上面的条带主要是染色体 DNA及少量开环状质粒DNA，下面的带则是共 价闭合环状质粒DNA。
第二节

噬菌体载体
一、噬菌体的一般生物学特性 二、λ噬菌体载体 三、粘性质粒 四、单链DNA噬菌体载体
烈性噬菌体 温和噬菌体 溶源化细菌 溶源化 原噬菌体

二、λ噬菌体载体
（一） λ DNA分子 (1) λ噬菌体基因结构：如图3-11、3-12 Cos位点（Cohesive-end site）： λDNA为 线状双链分子，两端各有12个碱基的单 链互补粘性末端，通过粘性末端的互补 作用形成双链环形DNA。这种由粘末端 结合形成的双链区段即Cos位点。 (2) λ噬菌体DNA的复制
在酵母细胞中常用的载体的共 同特点

这些载体，它们共同的特点是：（1）能在大 肠杆菌中克隆，并且具有较高的拷贝数。这样 可使外源基因转化到酵母细胞之前先在大肠杆 菌中扩增；（2）含有在酵母中便于选择的遗 传标记。这些标记一般能和大肠杆菌相应的突 变体互补，如Leu2+、His+、Ura3+、Trpl+等。 有些还携带用于大肠杆菌的抗菌素抗性标记； （3）含有合适的限制酶切位点，以便外源基 因的插入。共有三种类型的载体，如图3-19 。

复制类型： ①严紧型：低拷贝 1-3个拷贝/菌 ②松弛型：高拷贝 10-60个拷贝/菌 特性：自主复制、转移、选择标记遗传特性、不相容 性（同者相斥、异着共存）、分配功能（亲代 子代）
特性： CopA和CopB基因 1.复制： 负调控 RI质粒：repA基因表达 复制 PSC101 ：正调控 是由ori复制子向左单向复制 2.不相容性；在同一细胞中，同类质粒不能并 存的现象。PUC18 PUC19 分配功能：质粒复制后，随细胞分裂的进行， 质粒分配到子细胞中。
正选择质粒

pTR262是正选择质粒。在这种质粒中，在四环 素的抗性基因（Tetr）前有λ噬菌体的PR启动子， 同时在这种载体中还带有λ噬菌体编码CI蛋白 质（阻遏物）的基因。没有外源基因插入时， 由于CI蛋白质阻遏从PR进行的转录作用，因此 对四环素不表现抗性。在CI蛋白质基因上有单 一的HindⅢ和BclⅠ切点，若利用其中任何一 个切点插入外源DNA片段，都可以使CI蛋白质 基因功能丧失，结果PR激活Tetr基因表达；表 现出对四环素的抗性，达到正选择的效果。
Triton和PEG化学提取法
Triton和PEG处理法，此法简单，不用昂贵的 氯化铯，不必长时间的超速离心，费用较低， 分离效果也很好，此法大体过程如下： 培养菌体并加入氯霉素使质粒扩增→离心沉淀 菌体。在TE缓冲液中悬浮→加入溶菌酶和去污 剂Triton部分裂解菌体→35000r/min离心除去菌 体，留上清液→上清液用酚处理除去蛋白质→ 用乙醇初步沉淀DNA→将DNA悬浮于TE缓冲 液中→加聚乙二醇（PEG6000），在4℃下过 夜→10000r/min离心15分钟→DNA沉淀悬浮后 再用乙醇沉淀→将DNA沉淀悬浮即得到提纯的 质粒DNA。

三、粘性质粒
粘 性 质 粒 （ Cosmid ） 带 有 λ 噬 菌 体 的 Cos位点和整个pBR322的DNA顺序。经感 染进入细菌细胞以后，它就好象质粒那样 在细胞中进行复制。易环化和扩增。分子 量 小 ， 可 包 装 30-45kb 外 源 基 因 ， 可 由 Ampr抗性筛选，常用于构建基因文库。

种类：

F质粒：使宿主染色体上的基因通过性菌 毛随其一起转移到原先不存在该质粒的 受体细胞中。 R质粒：抗性因子，携有一种或多种抗生 素抗性基因转移到原先不存在该质粒的 受体细胞中。 Col质粒：有编码大肠杆菌素基因


质粒的类型和特性
传递类型： ①接合型：含有自主转移基因，使质粒从一个细胞转 移到另一个细胞。如： F质粒、部分R、Col质粒 ②非接合型：不含有自主转移基因，质粒不能自主从 一个细胞转移到另一个细胞。如：部分R、Col质粒 （安全常用）
一、质粒的基本特性
1．质粒及其命名 2．质粒的种类 3．质粒的复制类型 4．质粒的分子生物学特征

二、质粒的分离纯化方法
1．氯化铯溴乙锭浮密度超速离心密度梯 度分离法 （图3-3） 2. Triton和PEG化学提取法 3．煮沸裂解菌体，异丙醇沉淀质粒DNA 4．碱变性法抽提质粒DNA
附加体型载体（YEP）

YEP型载体一般由大肠杆菌质粒、2µm质粒以 及酵母染色体的选择标记构成。2µm质粒含有 自主复制起始区（Ori）和STB区,STB序列能够 使质粒在供体细胞中维持稳定。利用2µ m质粒， 人们已经构建出许多YEP型载体。YEP型载体 PYF92（如图3-21）就是由酵母的2µ m质粒、 pBR322质粒和酵母的His3+(组氨酸)基因构成 的。YEP型载体对酵母具有很高的转化活性， 一般为103-105转化子/微克DNA。比YRP型载 体更稳定，拷贝数也高（25-100个/细胞），是 基因克隆中的常用载体。

煮沸裂解菌体，异丙醇沉淀质 粒DNA
Leabharlann Baidu
该法简便迅速，是实验室中制备小量质粒DNA 时常用的一种方法。将菌液移入1.5ml塑料管， 离心去上清，先用Triton和新鲜配制的溶菌酶 处理细胞，100℃加热60秒种裂解细菌细胞。 将裂解液放置冰浴2分钟，离心5分钟，根据不 同的复性特性，从而去除染色体DNA及细胞碎 片。然后用酚氯仿抽提上清去除蛋白质，再加 入异丙醇，置于室温20-30分钟，离心取沉淀， 70%乙醇洗两次，最后悬浮于TE，即为提纯的 质粒DNA。根据实验要求，亦可省去酚：氯仿 抽提步骤，使实验在2小时内完成。
碱变性法抽提质粒DNA
该法也是一种快速抽提质料DNA的方法。 其分离原理，大肠杆菌的染色体约有4700KB 长，在处理细胞过程中都断裂成不同长度的双 链DNA片段。当溶液的PH调到大于12时双链 DNA中的氢键被破坏，于是染色体DNA的双链 便分离成单链，而超螺旋状态的质粒DNA仅仅 是氢链被破坏，并只发生部分双链解离成单链 的变化。再当PH调回中性时单链DNA互相缠 绕且与蛋白质结合生成网络状大分子，而超螺 旋的质粒发生复性反应后仍是小分子，通过离 心的方法很容易将二者分开，达到分离的目的。
载
体
载体（Vector）：能携带外源基因导入受 体细胞，这种运载工具称载体。 1.克隆载体: 具组装、复制、扩增功能。如： pBR322、pUC18/19等。 2.表达载体: 不仅具组装、复制、扩增功能， 还有转录表达功能。如：pBV220、pKK223-3
3.载体的种类：质粒、噬菌体衍生物（COS、 M13）、动物病毒。
共同特征： ①自主复制 ②易于扩增分离纯化 ③有非必需区 ④有单一酶切位点（多克隆位点） 单一酶切位点：一种酶在一个载体上只有一个酶切位点 多克隆位点：一个载体上的某一个区域含有多个单一酶 切位点 ⑤有选择标记基因 ⑥表达载体还应有表达调控元件（启动子、增强子、终 止子,SD序列）
质粒
本质是细菌染色体以外的遗传物质，是 一种简单的，环状DNA分子，能自主复 制。 命名：前一个小写p代表质粒，后两个大 写英文字母代表发现者或实验室，数字 代表编号，如pBR322质粒。
Cloning Vectors
二、基因工程的基本程序 a b 剪切 b
载体质粒
A 外源DNA片段 A b 引入宿 主细胞 选出含有重 组DNA的细 胞扩增表达
外源DNA插入
第三章
第一节 第二节 第三节
基因克隆载体
质粒载体 噬菌体载体 真核细胞的克隆载体
第一节

质粒载体
一、质粒的基本特性 二、质粒的分离纯化方法 三、质粒载体的选择 四、大肠杆菌质粒载体 五、多种功能的衍生质粒的组建

（二）λ噬菌体的类型 插入型载体 替换型载体 ( 三 ) λ噬菌体载体的应用 1.转染作用 转染：由宿主细胞捕获噬菌体或病毒DNA的过程。 转导：以噬菌体为媒介转移遗传物质的过程。 转化：质粒等外源DNA引入细胞的过程。 2. λ DNA的体外包装

（四） 常用λ噬菌体 凯伦噬菌体载体 这类载体有插入型的，如Charon2；也有 替换型的，如Charon30。在基因操作中 用途很广。 Charon 载体上具有适当数量的限制酶切 位点，带有来自大肠杆菌的 β- 半乳糖苷 酶基因lacZ（中央区段）。插入基因经包 装后，可通过蓝/白斑筛选阳性克隆。 Charon载体的特点是容量大，对研究大 范围内的染色体结构很有用处。

pAT153是由pBR322 质粒改造而成，这种 质粒的拷贝数比 pBR322高1.5～3倍。 它的大小是3.6kb,选 择标记有氨苄青霉素 抗性基因Ampr和四环 素抗性基因Tetr、单 一切点的限制性内切 核酸酶有PvuⅠ、 PstⅠ、BamHⅠ、 ScaⅠ、SalⅠ、 EcoRⅠ、HindⅢ。