第四章基因克隆的质粒载体详解

质粒绝大多数是环形双链的DNA
但也存在有线形质粒 、RNA质粒（酵母的杀伤质粒） 质粒DNA分子可以稳定存在于染色体外，呈游离状态,有 一些质粒在一定条件下能可逆地整合到寄主染色体上，随 染色体的复制而复制,称为附加体。
3.环形双链DNA质粒分子组成与构型 多数为双链环状DNA分子. 分子量从不足2kb 到100kb以上,多数为10kb左右.
•常常含有一些编码对细菌宿主有利的基因。 这些基因可赋予宿主迥然不同的特征，其中不少具 有重要的医学和商业价值。由质粒产生的表型包括产生 抗生素、大肠杆菌素、肠毒素、限制酶与修饰酶，以及 降解复杂的有机化合物等。
质粒通过合成长 效致死物和短效 解毒剂得以在细 菌中生存.
2.质粒的生物学特征
只能在在寄主细胞内独立增殖，随寄主分裂而遗传。 自然界中，无论是真核生物还是原核生物细胞，甚至真菌的 线粒体中都发现有质粒的存在。
质粒的转移与迁移.
转移一般指一个质粒独立地从一个细胞转移到另一个细胞. 迁移则指本身不能转移,在另一个接合型质粒存在下,从一个细 胞移至另一种细胞.
质粒迁移的条件（自身编码） ①bom位点(col E1) nic 位点. ②mob基因.结合动员基因.编码迁移蛋白,实质是一种核酸酶, 切割nic位点.
4.必须是安全的。
五、克隆载体的种类
根据来源可分为：
质粒载体
病毒或噬菌体载体 质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的克隆载体 质粒DNA与染色体DNA片段组成的克隆载体等
根据用途可分为： 表达克隆载体 启动子探针型载体 cDNA克隆载体等
根据应用对象可分为： 原核生物克隆载体、植物克隆载体和动物克隆载体等。
迁移作用(mobiligation): 由共存接合型质粒引发的非接合型质粒的迁移过程.
从基因工程安全角度考虑，接合型质粒不宜作为克隆载体。
因为从理论上存在着发生使ＤＮＡ跨越生物种间遗传屏障 的潜在危险.
而利用迁移作用可能将非接合型质粒从一种细胞转移至另 一种细胞,这种方法叫三亲杂交法.
一般将受体菌、供体菌及辅助转移菌 三者共培养过夜.
正超螺旋(positive supercoil) 盘绕方向与DNA双螺旋方同相同 负超螺旋(negative supercoil) 盘绕方向与DNA双螺旋方向相反
4. 作为克隆载体质粒的条件
适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必须包括 三种共同的组分： 复制子 选择性标记基因 克隆位点 基因克隆载体还需要满足具有较小的分子量和较高的拷贝数
在基因工程中得到大量的应用.
重 组 质 粒
受 体 细 胞
接 合
供 体 细 胞
辅 助 质 粒 D N A 转 移
三亲杂交法
•根据质粒的性状特征，可分为五种不同的类型：
F(Fertility)质粒: Ｒ(Resistance)质粒 Col质粒 降解质粒（Degradative plasmids） 致瘤质粒（Virulence plasmids）农杆菌Ti质粒
具有三种不同的构型：
共价闭合环形DNA(cccDNA):两条多核苷酸链均保持完整的 环形结构。DNA呈超螺旋的SC构型。 开环DNA(ocDNA)：有一条保持完整的环形结构，另一条链 出现有一至数个缺口。即OC构型。 线性分子（lDNA)：经限制性内切酶切割之后，双链断裂而 形成。称L构型。
什么是超螺旋(superhelix 或supercoil) ？ DNA是以双螺旋的形式围绕着同一轴缠绕的，当双螺 旋DNA的这个轴再弯曲缠绕时，DNA就处于超螺旋状态， DNA超螺旋状态是结构张力的表现。超螺旋是DNA三级结构 的一个重要特征。
5、 质粒的类型
•根据分子特性，革兰氏阴性细菌的质粒可分为两种
接合型 又叫自主转移的质粒 具有自主复制所必须的遗传信息之外，还带有一套 控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
可以在不同细胞间转移。
非接合型的质粒 不能自我转移的质粒，失去控制细菌配对和质粒接合 转移的基因。 不能自主转移。
F质粒的tra区包含细菌接合所需的基因
根据质粒的转移功能分类
按接合转移功能分 类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因 自主复制基因，抗菌素抗性基因
按抗性Fra Baidu bibliotek号分类
Col质粒 R质粒(R因子)
接合型质粒
自主复制基因，转移基因，细菌染色体区 F质粒（ F因子） 段 自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基 Col质粒 因 自主复制基因，转移基因，抗菌素抗性基 R质粒(R因子) 因 自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基 Ent质粒 因
1. 质粒的特点： •已在形形色色的细菌类群中发现，大多数质粒的宿主范围 较窄，只能生存于亲缘关系很近的少数细菌种类中。 •是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。 •已进化出多种机制以维持其在细菌宿主中的稳定的拷贝 并将质粒分子精确地分配给子代细胞。
•其复制和转录或多或少依赖于宿主编码的酶和蛋白质。
根据其复制或存在 方式可分为:
自主复制型载体和
附加载体
第四章 基因克隆的质粒载体
一、与构建克隆载体相关的质粒性质
质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制 的遗传成份. Plasmid一词由Joshua Lederberg于1952年提出。
质粒的命名:
例:pBR322 p代表质粒; “BR”代表两位研究者 Bolivar和Rogigerus 姓氏的字首,“322”是实验编号 .
载体具有如下功能:
1.运送外源基因高效转入受体细胞
2.为外源基因提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供条件
四、作为克隆载体的DNA分子必须具备主要条件：
1.有1至多个克隆位点，供外源DNA片段组入克隆载体DNA分子。 2.能自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而 同步复制。 3.必须具有用于选择克隆子的标记基因。
基因克隆载体系统
•质粒载体
•噬菌体载体
•柯斯质粒载体
•单链噬菌体载体
•噬菌粒载体
•染色体定位整合载体
•人工染色体载体
•其它特殊用途载体
一、基因工程四大要素：
目的基因
工具酶
克隆载体 受体系统
二、为什么要用克隆载体？
• 单独的基因不易进入细胞 • 进入后不能维持. 三、什么是克隆载体？
vector 通过不同途径能将承载的外源DNA片段带 入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分 子称为DNA克隆载体或基因克隆载体。