实验四、PCR产物的T载体克隆和转化
T载体连接获得重组DNA实验报告
T载体连接获得重组DNA实验报告引言在分子生物学研究中，重组DNA技术是一项十分重要的技术手段。
通过将不同来源的DNA片段组装到载体中，可以构建出具有特定功能的重组DNA。
本实验旨在通过T载体连接方法，将目标基因片段与T载体连接，进而获得重组DNA。
实验材料•T载体（已线性化）•目标基因片段DNA•T4 DNA连接酶•T4 DNA连接酶缓冲液•ATP酶活化缓冲液•DNA酶切酶•DNA酶切缓冲液•PCR扩增反应体系实验步骤1.提取目标基因片段DNA。
可通过基于PCR的方法扩增该基因片段，然后进行酶切，获取所需的DNA片段。
2.线性化T载体。
将T载体进行酶切，使其线性化以便与目标基因片段连接。
3.准备连接反应体系。
将线性化的T载体与目标基因片段DNA以1:3的摩尔比加入到连接反应中。
加入适量的T4 DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲液和ATP酶活化缓冲液。
4.进行连接反应。
在适当的温度下，进行连接反应，使T载体与目标基因片段DNA发生连接。
5.酶切验证。
取连反应体系的一部分进行酶切验证，使用适当的限制性内切酶，如EcoRI等，将连接后的T载体和目标基因片段DNA进行酶切。
通过琼脂糖凝胶电泳，验证连接反应的成功与否。
6.验证重组DNA。
将连接后的T载体与目标基因片段DNA进行测序验证，确定重组DNA的正确性。
实验结果通过酶切验证，确认连接反应成功，目标基因片段与T载体成功连接。
通过测序分析，确认重组DNA的正确性和完整性。
实验讨论通过T载体连接方法，在本次实验中成功将目标基因片段与T载体连接，获得重组DNA。
实验中需要注意的是，选取适当的酶切酶和连接酶，以及优化反应条件，能够提高连接反应的效率和成功率。
结论本实验通过T载体连接方法，成功将目标基因片段与T载体连接，获得重组DNA。
该方法可以应用于分子生物学研究中的基因克隆、基因工程等领域。
参考文献待补充以上实验报告以Markdown文本格式输出，满足1200字的要求。
分子生物学实验技术实验内容讲解
2006年《分子生物学实验技术》实验内容一、RT-PCR（一）总RNA的提取实验安排：每两人抽提一管。
为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。
操作步骤：1、将100μl液体样品加入1.5ml Ep管中，再加入900μl冰预冷的LS-Biotragents TM（苯酚和异硫氰酸胍的混合物）。
2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。
3、加入200μl氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和10s。
4、在4℃条件下，以10000×g离心15min。
5、将上层水相转移到一个新的Ep管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。
6、在4℃条件下，以10000×g离心15min后，小心并尽可能地去除全部上清夜。
7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀和管壁。
8、将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl无RNase污染的水（RNase-Free Water）将RNA溶解并于-20℃保存。
注意事项：1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC水浸泡过夜。
3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。
然后用高压灭菌除去残留的DEPC。
不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。
（二）反转录实验安排：每人做一管。
反应体系（20μl）：按下列顺序加样反应条件：42℃ 1h注意事项：1、加样时，一般从体积大的开始加，样品最后加。
如在一般的PCR反应体系中，应先加水、Buffer、dNTPs、引物，最后加酶和模板。
2、液体应直接加到管底，且每加一种试剂后应更换新的吸头。
3、加完所有试剂后，应用手指轻弹混匀，然后低速离心数秒以收集管壁上沾有的液体。
pcr产物连接t载体
pcr产物连接t载体PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，可在体外迅速扩增特定DNA片段。
常见的应用之一是将PCR产物连接到T载体上，以便进一步研究和分析。
本文将介绍PCR产物连接T载体的步骤和注意事项。
一、材料准备1. PCR产物：经PCR扩增得到的目标DNA片段。
2. T载体：一种载体，其末端具有“T”碱基（胸腺嘧啶）的一对互补序列，可与PCR产物进行连接。
3. T4 DNA连接酶：用于催化连接反应的酶。
二、PCR产物连接T载体步骤1. 酶切T载体：将T载体进行线性化，以便与PCR产物进行连接。
按照酶切酶厂商提供的酶切条件，在适当的缓冲液中进行酶切反应。
2. 纯化线性化的T载体：通过凝胶电泳等方法纯化线性化的T载体，以去除酶切剂和副产物。
3. PCR产物末端处理：将PCR产物进行末端处理，以便与T载体连接。
这一步骤通常使用多聚核苷酸添入酶（如T4 DNA聚合酶）对PCR产物末端进行A尾化处理。
4. T载体与PCR产物连接：将线性化的T载体与末端处理后的PCR产物进行连接，通常在适当的缓冲液中，加入T4 DNA连接酶，进行连接反应。
5. 进一步处理：将连接反应混合液经过适当的热处理或其他方法，以便降低非特异性连接和副产物的生成。
6. 转化大肠杆菌：将连接后的混合物转化到大肠杆菌中，通过培养和筛选，获得含有PCR产物的重组质粒。
三、注意事项1. 杂交温度：连接反应中的杂交温度需根据T载体末端的“T”碱基特性来确定。
一般而言，约为55-65°C。
2. 酶切反应时间：酶切T载体的时间需根据酶切剂的推荐时间来确定，过长或过短的酶切时间都会影响连接效率。
3. 转化菌株的选择：应选择适合的大肠杆菌菌株进行转化，以获得较高的转化效率和选择性。
4. 正负对照：在进行PCR产物连接T载体时，可以设置正负对照实验，以确保连接结果的准确性。
总结：PCR产物连接T载体是一种常用的分子生物学技术，它为后续的DNA克隆和遗传工程研究提供了重要的工具和平台。
实验四_T_A_克隆及转化
PCR产物的连接及转化
一、实验目的
• • • • 弄清T载体的结构和T-A克隆的原理； 弄清蓝白斑筛选的原理； 学会PCR产物连接方法； 学会连接产物转化大肠杆菌感受态方法。
二、实验原理
• 1、T-A克隆原理
通过PCR的方法扩增目的基因片断，为了后续实验的需要，
往往需要将获得的目的片断通过TA克隆的方法，重组到T-载体 中。外源DNA与载体分子的连接称之为DNA重组，这样重新组 合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在T4 DNA连 接酶作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将载体分 子与外源DNA分子进行连接。
• • • • • • （低温、加温）水浴锅 离心机 PCR扩增仪 恒温培养箱 摇床 超净工作台等
主要试剂
• • • • pMD 18-T Vector试剂盒 PCR扩增回收纯化的片段 200 mg/ml的IPTG 过滤除菌 20 mg/ml的X-gal 溶于二甲基甲 酰胺，避光保存。（低温、加 温）水浴锅 • LB培养基（ 含IPTG，X-gal， 50mg/ml 氨苄青霉素)
四、实验步骤
• 1、
产生不同末端的DNA聚合酶
• α互补 原理
许多载体（包括pMD18-T）都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子和编码 其N端氨基酸（α肽链）的片断基因。宿主具有编码β半乳糖苷酶的C端基因。当 二者产物组合在一起，就具有活性酶的产生，此现象称为α互补。由α互补形成 的具有功能活性的β半乳糖苷酶,可以用X-gal显色测定出来，它能将无色的化合 物X-gal切割成半乳糖和蓝色底物。当外源DNA片断插入到多克隆位点后，就会
破坏α肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽
TA克隆简述
生物秀论坛『中国生物科学论坛』PCR产物的T载体克隆（一）重组T质粒的构建一．原理外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。
重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。
DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。
但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。
连接反应通常将两个不同大小的片断相连。
因为DNA片断有两个端点，所以切割时出现两种可能，一种是单酶切，另一种是双酶切，这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。
对于单酶切来说，载体与供体的末端都相同，连接可以在任何末端之间进行，这样就导致了大量的自连接产物。
为了减少自环的高本底，可对载体进行5’除磷酸处理，原理是连接酶只能连接DNA片断的3’OH末端与5’端，所以除磷后载体不会自环。
一旦有外源片断插入时，由外源片断提供5’端就能与载体进行连接。
通过这种方法可大大减少由载体的自环造成的高本底。
对于双酶切来说，无论载体与供体同一片段上都有不同的末端，这样就避免了载体与供体的自环，能使有效连接产物大大增加。
双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。
但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。
实验十三、PCR产物的纯化与克隆
三、载体加dT尾方法：
实验步骤：
1. 将1ul pUC19用Sma I全酶切。 2. 在小管中按上述PCR反应，加入各种混合物，其中4ul4种dNTP改 为4ul 25 mmol/L dTTP. 3. 加入1ul（5单位）的Taq DNA聚合酶在72℃下加热2小时。 4. 用酚：氯仿：异戊醇抽提两次。 5. 加入两倍体积无水乙醇，在-20℃下沉淀1小时。 6. 离心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10 ul ddH2O中。
目前一些公司已开发出可直接用于克隆PCR产CR产物与载体粘末端连接
1. 在7ul PCR产物中加1ul带dT尾的pUC质粒 (T-Vector)。 2. 加1ul T4DNA连接酶，1ul 10X连接缓冲 液，混匀，16℃连接过夜。 3. 取5ul连接产物转化感受态细胞并筛选重 组子。
实验十三、PCR产物的纯化与克隆
一、概述
扩增的PCR产物如利用T-Vector可直接进行克隆。如用自 备的平末端或粘性末端载体连接，往往需要将产物纯化。克 隆的主要方法有： 1、平末端连接： 由于TaqDNA聚合酶往往在PCR产物3’端加 上多余的非模块依赖碱基，在用平末端连接克隆PCR产物前， 可用Klenow片段或T4DNA聚合酶处理补平末端。 2、在PCR产物尾部加dT或ddT：TaqDNA聚合酶会在3’端加 上多余的非模块依赖碱基，而且对A优先聚合，所以PCR产 物末端的多余碱基大部分都是A。利用这一特点，载体平末 端用酶加上dT或ddT，使载体在PCR产物末端互补并进行连 接。载体末端加dT尾可直接用TaqDNA聚合酶和dTTP或 ddTTP。 3．粘性末端连接：利用引物中附加在5’端的限制酶位点，直 接将PCR产物经适当的限制性内切酶切割后产生粘性末端， 与载体连接，产生重组DNA。
PCR产物的TA克隆(DNA的胶回收和连接) PCR实验技术
PCR产物的TA克隆(DNA的胶回收和连接)
【实验原理】
1.DNA片段回收方法：DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳，不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分离开。
切下带有所需DNA片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。
2.利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，可用于PCR产物的克隆和测序。
商品化的T载体有很多。
本实验采用TaKaRa公司的pMDTM18-T Simple Vector。
这个载体以pUC19载体为基础，消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，经EcoRⅤ酶切后在两侧的3＇端添上“T”制备而成（见附录1）。
由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。
【试剂与器材】
（一）试剂
1.pMDTM18-T Simple Vector Kit（Takara公司）。
2.TAE电泳缓冲液
3.琼脂糖（Agarose）
4.6×电泳加样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4℃。
1 / 9。
T载体克隆连接原理、制备及载体序列
T载体克隆连接原理、制备及载体序列T载体的定义：T载体（T-Vector）是一种髙效克隆PCR产物（TA克隆）的专用质粒载体，为线性化载体，无需酶切可直接与具有A末端的PCR产物连接，属于非定向克隆。
T载体的作用原理：大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都具有在PCR产物的3'末端添加一个“A”的特性（下图红色框内所示位置）。
因此，人们在线性化平末端载体的两端分别又人工加上一个额外的T碱基（下图两个红色箭头所示），从而可与PCR克隆产物的A末端互补配对，提髙了PCR产物连接和克隆的效率。
T载体进行TA克隆的优势：相对于另一种非定向克隆平末端克隆，使用T载体进行TA克隆是一种快速、髙效、一步到位的非定向克隆法。
有研究曾证明，平末端克隆的连接效率仅为粘端连接的1/50，且自身环化率髙。
T载体的制备：1商业化T载体：一般来说，商业化的T载体多是先使用平端限制性内切酶（如EcoRV）将克隆载体进行线性化，然后再单独加入dTTP和Taq酶72〜751反应，进行末端的加T。
2自制T载体：一种常见的自制方法是利用限制性内切酶制造出具有单个T末端突出的片段,最常用的内切酶为Xcml,其识别和切割特点如下：其中XcmI的识别序列分别为两端的CCA和TGG，而切割序列则为中间三角箭头所指的N（N代表任意碱基）。
由于N可以是任意碱基，所以如果将切割位置的N设置为T，那么在该酶的切割下，就可以产生一个3'T末端。
相似的，在其互补链上设置另一个相同或者类似的XcmI酶切位点（保证切割位点为T即可）就可以产生另一个T末端。
一般可以在商业化的T载体基础上进行改造，通过PCR或者合成Oligo的方式插入上述两个XcmI位点。
连接成功的质粒可按需要自行扩增和保存，使用时用XcmI进行完全酶切（这里的酶切必须保证完全，否则载体易自连，所以XcmI酶最好过量，或者适当延长消化时间），就可以制备得到T载体。
[3]常见T载体及序列：虽然上面提到可以自制T-Vector，但实际上现在的商业化载体已经做到比较便宜，而且批次间稳定性保持的不错。
PCR产物的T载体连接和转化
将阳性克隆扩大培养，用灭菌的甘 油按比例与培养液混合，保存于80℃低温冰箱中。
04 PCR产物的应用
克隆基因的表达
克隆基因的表达是PCR产物应用的重要领域之一。通过将目的基因克隆到表达载 体中，可以实现在宿主细胞中的高效表达，从而获得大量的重组蛋白。
克隆基因的表达有助于研究基因的功能、蛋白质的结构和性质，以及开发新的药 物和治疗方法。
03
04
使用高质量的感受态细胞，确保其处于良 好的生长状态。
优化连接条件，如连接时间、温度、酶产物浓度，可以提高转化效率。
克隆基因表达不理想的问题及解决方案
问题：克隆基因表达量低 或未表达。
确认目的基因的ORF是否 正确，是否有基因缺陷或
突变。
优化表达条件，如温度、 pH、诱导剂浓度等。
02
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解决方案
对PCR产物进行测序验证， 确保目的基因的序列正确。
对于关键突变，可以通过 定点诱变技术进行精确的 基因改造。
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解决方案
选择合适的宿主菌，有些 基因在特定的宿主菌中表
达较好。
添加基因表达增强剂，如 使用稀有密码子或增强子
序列。
基因突变研究中的问题及解决方案
问题：基因突变导致功能 丧失或表达异常。
使用高保真酶进行PCR扩 增，减少突变的发生。
在突变研究中，考虑使用 互补DNA（cDNA）代替 基因组DNA。
01
基因突变的研究
基因突变是生物多样性和进化的重要 驱动力。通过PCR技术，可以快速、 准确地检测和鉴定基因突变，研究其 产生机制和生物学意义。
基因突变的研究有助于了解人类遗传 性疾病的发病机制、药物抵抗和癌症 发生等生物学过程，为疾病诊断和治 疗提供依据。
pcr扩增后t载体
pcr扩增后t载体PCR扩增后的T载体是一种常用的分子生物学工具，用于在实验室中进行DNA片段的克隆和基因的表达研究。
本文将详细介绍PCR扩增后T载体的概念、构建方法以及在科研中的应用。
一、PCR扩增后T载体的概念PCR扩增后T载体是一种用于克隆PCR产物的载体，它通过连接PCR扩增产物的末端与T载体的末端序列相互匹配，实现PCR产物的快速克隆。
PCR扩增后的T载体通常包含T载体的启动子和选择标记，方便后续对克隆产物的筛选和表达。
二、PCR扩增后T载体的构建方法PCR扩增后T载体的构建通常包括以下几个步骤：1.设计引物首先根据需要克隆的PCR产物设计引物，使其在扩增产物的末端含有T载体的末端序列。
T载体的末端序列通常为5'-AATTGGGAAAA-3'。
2.进行PCR扩增使用设计好的引物进行PCR扩增，获取所需的DNA片段。
在PCR反应中，可以根据需要添加引物的Pfu酶切位点，便于后续的克隆步骤。
3.准备PCR产物将PCR产物进行电泳检测，确认目标片段的大小和纯度。
如有必要，可进行片段纯化和测序验证。
4.连接T载体序列将PCR产物与线性化的T载体进行连接。
连接反应中，需将PCR产物和T载体按一定比例混合，加入连接酶和缓冲液，进行高效连接。
5.转化宿主细胞将连接产物与宿主细胞（如大肠杆菌）进行转化。
转化后，将转化产物接种到含有选择抗生素的琼脂平板上，筛选并培养阳性克隆。
6.验证克隆基因通过PCR或限制酶切等方法验证克隆基因的存在，并进行测序分析。
确保克隆基因的准确性和完整性。
三、PCR扩增后T载体的应用PCR扩增后的T载体在科研中有着广泛的应用，主要包括以下几个方面：1.基因克隆通过PCR扩增后T载体的使用，可以高效地克隆和表达目标基因。
这为基因功能研究和蛋白质表达提供了方便和快捷的工具。
2.基因组库构建PCR扩增后T载体可以用于构建基因组文库，提供了大规模筛选和鉴定目标基因的手段。
目的基因T载体克隆实验步骤
目的基因T载体克隆实验步骤pcr产物的t载体克隆一.重组质粒的构建：重组的dna分子就是在dna连接酶的促进作用下，存有mg切的载体分子与外源dna分子进行连接。
dna连接酶存有两种：t4噬菌体dna连接酶和大肠杆菌dna连接酶。
两种dna连接酶都存有将两个具有相同粘性末端的dna分子连在一起的功能，而且t4噬菌体dna连接酶除了一种大肠杆菌dna连接酶没的特性，即为能够并使两个平末端的双链dna分子连接起来。
但这种相连接的效率比粘性末端的相连接率为高，通常可以通过提升t4噬菌体dna 连接酶浓度或减少dna浓度去提升平末端的相连接效率。
t4噬菌体dna连接酶催化剂dna 连接反应分成3步：首先，t4dna连接酶与辅因子atp构成酶-atp复合物；然后，酶-atp 复合物再融合至具备5’磷酸基和3’羟基切口的dna上，并使dna腺苷化；最后产生一个代莱磷酸二酯键，把切口封出来。
连接反应通常将两个相同大小的片断相连。
很多dna聚合酶在进行pcr扩增时会在pcr产物双链dna每条链的3’端加上一个突出的碱基a。
pucm-t载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的t。
这样，pucm-t载体的两端就可以和pcr产物的两端进行正确的at配对，在连接酶的催化下，就可以把pcr产物连接到pucm-t载体中，形成含有目的片断的重组载体。
连接反应的温度在37℃时有助于连接酶的活性。
但是在这个温度下黏末端的氢键融合就是不稳定的。
因此实行折衷的温度，即12-16℃，相连接12-16h（过夜），这样既可以最大限度地充分发挥连接酶的活性，又兼具至较长时间接合结构的平衡。
2、atp存有的相连接缓冲器系统中，将分别经酶二.感受态制备原理细菌在0ccacl2低渗溶液中胀变成球形，遗失部分膜蛋白，沦为难稀释外源dna的状态。
三.β-半乳糖甘酶显色反应选择法（蓝白筛选）原理lacz基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。
实验四、PCR产物的T载体克隆和转化
Ligase
1μl
10×Ligas10 μL
• 备注：瞬时离心，混合均匀。4℃连接4—16
•
小时，-20储存或直接用于转化。
说明
• 1. 回收DNA片段可以用沉淀法，但是只 适用于PCR扩增产物为单一片段，而且需 要检测PCR扩增结果后进行；
• 2. 此种连接方法是根据普通Taq酶会在3´ 末端加一个A的原理发明的；注意不同的 酶的性能不同，保真性强的Taq酶会自动 切除末端的A，所以，这种酶的扩增产物 需要补加A后再连接。
• T+a t t+t a+a t+a+T+A
pGM－T 载体的结构
pMD18－T 载体的结构
实验步骤
• （1）目的片段的制备——胶回收法回收PCR产物：
• (2)连接实验：
• 反应体系如下：
• 在0.5mlEppendorf 管加入以下试剂：
目的片段（0.1ug/ul） 7μl
载体DNA（0.1ug/ul） 1μl
• 3. T－载体的阳性克隆筛选同样可以使 用“兰白斑”法，方便，快捷。
•
（Invitrigen公司） ， ddH2O
实验原理
• 普通Taq酶会在3´末端加一个A，这样所有 PCR产物都会在双链DNA的3´端均有一个单链 状态的A；
• T－载体是线状DNA片段，在DNA双链的3´ 端均有一个单链状态的T；
• 二者在连接酶的作用下连接为一个重组的环状 分子，从而达到克隆的目的。
实验四 PCR产物的T载体克隆和转化
实验目的：学习T载体的特点和PCR产物的克隆 方法。 实验要求：掌握利用T载体克隆PCR产物的方法； 复习连接实验流程。 技术应用：方便、易行的克隆PCR产物，使目 的基因片段与T载体DNA连接，达到克隆基因 的目的。
PCR产物的克隆
PCR产物的克隆PCR产物克隆大致分为两类，即平头连接和粘头连接。
平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR产物直接进行连接。
载体可用EcoR V 或Sma I切成平头；PCR产物纯化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。
如果要求不高，PCR产物也可不加处理。
如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶，这两种酶有5’→3’校对能力，扩增出来的PCR产物已经是平头，可以不作平端处理。
平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下，即使使用很高单位的连接酶，或在反应体系中加入PEG 8000，也只能很有限地提高效率。
粘头连接也可以大致分为两类，一类粘头连接是用某种方法，在载体和PCR产物上产生长的可互补的粘性末端。
最普遍的方法是在引物的5’端加入一段某种限制酶的识别序列。
如果两个引物选用不同的限制性内切酶识别序列，就可以做到定向连接。
另一类利用部分PCR产物3’端带有一个凸出的dAMP的特性，构建3’端带有凸出的dTMP的载体。
一般采用的方法是先把载体用某种限制性内切酶消化成平头，在70℃或72℃下在只加入一种dNTP、即dTTP的反应体系中用Taq DNA聚合酶处理半小时（也有人报道处理1～2小时能提高克隆效率，这样加T反应会更彻底）。
也可以用末端转移酶来完成加T反应。
载体自连、PCR产物串连可以忽略。
如果使用ddTTP，效果会更好。
这种方法一般称为加T/A法克隆，比平头连接效率高50～100倍。
一、PCR产物的TA克隆1. TA克隆构建原理：TA克隆系统由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产物的克隆和测序。
其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。
TA克隆-T载体
TA 克隆概述TA 克隆载体即 T 载体，是目前克隆 PCR 产物最简便、快捷的方法。
随着基因组计划的进行，以及分子生物学技术、基因芯片技术在生命科学研究、生物工程和医学等领域的应用，对 TA 载体的需求量会逐步扩大TA 克隆方法（ Original TA Cloning Kit ）即利用 Taq 聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，在每条 PCR 扩增产物的3` 端自动添加一个 3`-A 突出端。
利用 TaKaRa 的 T 载体，直接高效地连接 PCR 产物。
所以 TA 克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需将 PCR 产物进行优化，不需把 PCR 产物做平端处理，不需在 PCR 扩增产物上加接头，即可直接进行克隆。
原理如下：TA克隆的策略摘要：对于亚克隆来说，酶切-连接可谓是最经典的方式。
虽说效果不错，可着实有些麻烦。
载体和片段分别酶切、跑胶、回收，再加上连接和转化，一星期转眼就过去了。
新的克隆方法也在不断涌现。
速度更快，片段更长。
生物通近期就将盘点一下市场上一些非一般的克隆。
从TA克隆开始，我们着重于一些容易忽视的问题。
TA 克隆的idea 最初来自1994 年。
几位学者发现Taq DNA 聚合酶会在PCR 产物的3’末端加上一个脱氧腺苷（A），而且这种特性与模板无关。
之后，Invitrogen 公司发明了TA 克隆技术，并拥有全球TA cloning 商标的专利权，直至2013 年。
（这个就够他们赚得盆满钵满了。
）线性化的T 载体在3’末端拥有一个脱氧胸苷（T），与PCR 产物的 A 尾巴互补。
原理就是这么简单。
不过由于价格的原因，Invitrogen 的T 载体在国内却不是销量最好的。
Promega 的pGEM-T（easy）和Takara的pMD18-T 因性价比高，更加深入人心。
TA 克隆的步骤无需赘述，相信大家都很清楚。
无非就是PCR、连接、转化、鉴定这几个步骤，不过还有一些不得不说的问题，值得大家注意。
分子克隆技术课程教学大纲
分子克隆技术课程教学大纲课程名称：分子克隆技术（Molecular Cloning Technology）课程编号：1313080216课程类别：专业课总学时数：30 课内实验时数：30学分：1开课单位：生命科学学院生物技术教研室适用专业：生物技术适用对象：本科（四年）一、课程的性质、类型、目的和任务分子克隆技术是生物技术专业的专业必修课，是在分子生物学和基因操作原理等理论课的基础上开设的一门以实验为主的课程，它的任务是全面训练学生掌握分子克隆的常用技术。
本课程要求学生在掌握相关原理的基础上，通过利用质粒载体克隆拟南芥DNA片段、转化及PCR鉴定等综合性实验，学习、训练分子克隆技术的基本操作方法及操作技巧，掌握DNA重组及重组子的筛选和鉴定技术、RNA的操作、Southern杂交技术等，培养学生设计实验、观察实验现象、分析问题和解决问题的能力。
二、本课程与其它课程的联系与分工生物化学、分子生物学、基因工程原理是其先修课程。
三、课程内容及教学基本要求[1]表示“了解”；[2]表示“理解”或“熟悉”；[3]表示“掌握”实验一PCR产物的T载体克隆一、PCR引物设计二、基因克隆三、PCR产物回收四、PCR产物与载体连接五、蓝白斑筛选PCR引物设计原则[3]；T载体的特点[3]；T载体克隆PCR产物的方法[3]；PCR产物的回收[2]；蓝白斑筛选原理[3]实验二植物目的基因的转化一、农杆菌单菌落的分离与保存二、农杆菌的活化三、Forial Dipl法转化拟南芥农杆菌单菌落的分离与保存[3]；根瘤农杆菌的生物学特性[2]；Forial Dipl法转化拟南芥原理与方法[3]实验三转基因植物的检测技术一、植物基因组DNA提取二、转基因植物在含抗生素筛选培养基中的筛选三、转基因植物的PCR检测植物基因组DNA提取原理与方法[3]；引物的设计与合成[2]；反应体系[3]；循环参数[3]；扩增产物的检测[3]四、实验方式与要求1．实验前学生必须进行预习后，方可进入实验室进行实验。
(pEC-T)克隆及鉴定试剂盒 说明书
(pEC-T) 克隆及鉴定试剂盒地址：上海市浦东张江高科技园区蔡伦路720号2号楼电话：************传真：************-13主页： email ：****************保存温度：-20o C SinoBio 目录号：T003产品组成：质量控制：Control Insert克隆后的白色菌落中，有90%以上含有Insert DNA片段。
Control Insert经克隆后，经测序确认“T” 突出的存在。
产品描述：SinoBio Easy Clone T-vector是一种PCR产物高效TA克隆的专用T载体。
它由pBluescript II KS载体改造而成：保留了pBluescript II KS载体全部的酶切位点；PCR产物插入位点处于多克隆酶切位点的中间，其两侧都有众多的酶切位点可供选择。
由于本载体以pBluescript II KS载体为基础构建而成，所以它具有同pBluescript II KS载体相同的功能：PCR产物插入后可以利用a -互补性进行蓝白斑筛选，挑选阳性克隆。
可以用M13通用引物和T7，T3启动子引物对PCR产物进行测序。
含有T7 及T3 RNA聚合酶的启动子，可以对插入片段进行体外转录。
15分钟快速连接：l 随酶提供独特配方的2×快速及10×普通T4 DNA Ligation Buffer; l 使用2X 快速buffer在室温(25°C)下，仅需15分钟即可完成连接反应;自带超快PCR 鉴定2×Fast Taq Master Mix 及DNA Marke ：2×Fast Taq Master Mix (Quick Load型)已含有PCR反应所需的快速型PCR聚合酶、dNTP混合物、MgCl2、上样染料以及反应缓冲液预先，使用时只需再加入模板和引物并稀释到1倍浓度即可进行PCR反应。
其扩增速度为普通Taq酶的数倍，因此可大幅度缩短PCR鉴定过程所需要的时间， 试剂盒自带预混1×Loading Buffer的DL2,000 Plus DNA Marker，能满足绝大部分PCR产物电泳的需要。
PCR产物的TA克隆
PCR产物的TA克隆(DNA的胶回收和连接)【实验原理】1.DNA片段回收方法：DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳，不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分离开。
切下带有所需DNA片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。
2.利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，可用于PCR产物的克隆和测序。
商品化的T载体有很多。
本实验采用TaKaRa公司的pMDTM18-T Simple Vector。
这个载体以pUC19载体为基础，消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，经EcoRⅤ酶切后在两侧的3＇端添上“T”制备而成（见附录1）。
由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。
【试剂与器材】（一）试剂1.pMDTM18-T Simple Vector Kit（Takara公司）。
2.TAE电泳缓冲液3.琼脂糖（Agarose）4.6×电泳加样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4℃。
5.溴化乙锭(EB)溶液母液：配制成10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。
6.70%乙醇7.胶回收试剂盒（Omega公司）（二）器材水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪, 凝胶成像系统或其它照相设备。
【操作方法】（一）胶回收试剂盒回收PCR产物（以Omega公司Gel Extraction Kit为例）1.当目的片段DNA完全分离时，转移凝胶至紫外灯上尽可能快地切下目的片段。
2.凝胶块转移至1.5ml离心管(离心管已经称重了)中，称重得出凝胶块的重量。
近似地确定其体积（假设其密度为1g/ml）。
t载体克隆原理
t载体克隆原理
T载体克隆的原理主要基于DNA连接酶的作用。
在连接缓冲系统中，当Mg2+和ATP存在时，DNA连接酶能够将经过酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接，形成重组的DNA分子。
这个过程是将两个不同大小的DNA片段相连，通常用于克隆和基因工程中的DNA操作。
T载体，也称为T化物载体，是聚合酶链反应产物的克隆运载体。
这种载体在经过线性化后，其两侧的3′端各多出一个脱氧胸苷酸(T)。
由于PCR产物两侧的3′端通常含有单个脱氧腺苷酸(A)，因此PCR产物与T化物载体之间的A-T互补性可以大大提高PCR产物克隆的效率。
在这个过程中，T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶都起到了关键作用。
这两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能。
特别是T4噬菌体DNA连接酶，它还能将两个平末端的双链DNA分子连接起来，尽管这种连接的效率比粘性末端的连接率低。
为了提高平末端的连接效率，可以通过增加T4噬菌体DNA连接酶的浓度或增加DNA的浓度来实现。
总的来说，T载体克隆的原理是基于DNA连接酶的作用，通过将PCR产物与线性化的T载体进行连接，从而实现高效、准确的基因克隆和克隆基因的操作。
T载体-B载体与PCR克隆困扰
T载体-B载体与PCR克隆困扰盘古基因李万波PCR技术给基因工程带来了巨大的变革，生物学家可以配合DNA内切酶随意放大、克隆基因。
一、T-载体与B-载体PCR产物的克隆技术也得到了长足发展，T/A克隆载体（简称“T载体”）就是上世纪末发展起来的。
Taq酶是第一个被克隆的嗜热菌DNA聚合酶，由于发现了Taq酶具有不依赖DNA模板的核苷酸末端转移酶活性，能够给双链DNA 的3’-末端添加1个碱基，所以T/A克隆技术应运而生。
Taq酶在dNTP俱全的情况下，优先添加1个A碱基（3’-A Protruding）, 当只有其它某个碱基时，她就退而求其次，也能加上1个其它碱基，比如“dTTP”。
PCR产物的平端连接效率本来很低，这是因为常规合成的寡核苷酸引物5’-端不带磷酸，T4 DNA连接酶只能将DNA链的3’-OH和另一DNA链的5’-P(磷酸基团)相连。
DNA内切酶切开的平末端5’带有磷酸基，只有这条链能与PCR产物的3’-OH发生连接反应，另一条链没有粘性。
T/A克隆时也一样，只能连接单链，另一条链上的缺口（Nick）需要受体菌（Host Bacteria）体内的激酶和连接酶帮助修补，才能成为完整的环状质粒，完成滚环复制，抵抗筛选压（抗生素毒性）。
所以，如果质粒转化感受态菌后的37℃温育不够1小时，菌落数是会减少的。
上世纪80年代，拓扑异构酶1B的发现使得PCR产物的平端克隆技术（Blunt-end cloning vector, B-载体）取得了巨大改进。
拓扑异构载体对平末端的连接速度和效率至今无可匹敌。
这类载体有盘古基因的pACK4a系列、原核表达载体Topoied系列、哺乳类载体Topoied系列，此外还有Invitrogen 和全式金的相应载体。
该类载体由于Topoisomerase Ib的微弱的记忆功能，需要PCR引物的5’第一个碱基尽量与载体处理前切除的5’端碱基相同，这样才能获得近乎100%的克隆率。
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3´
3´ A(A)nA
5´
5´ 3´ 末端转移酶 + dATP 5´ 3´A(A)nA 3´ T(T)nT 5´
5´
T(T)nT 3´
T4 DNA连接酶 15º C
重组体
四、外源DNA导入宿主细胞——转
受体菌条件： 安全宿主菌
限制酶和重组酶缺陷
处于感受态(competent) 导入方式： 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection)
志比昆仑
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一、目
（三）PCR扩增特定基因
（四）人工合成
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从基因组DNA文 库获取目的基因
组织或细胞染色体DNA
限带的所 有基因组DNA的集合
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青海大学医学硕士研究生课程
医用分子生物学 实验技术
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重组DNA技术操作步骤
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基本原理
目的基因的获取 克隆载体的选择和构建 DNA导入受体细胞
外源基因与载体的连接 重组体的筛选
五、目的基因的筛选和鉴定——筛
外源基因导入宿主细胞后，筛选含有 目的基因的阳性克隆并加以扩增。
所用的方法主要有遗传学方法、免疫
学方法、核酸杂交法、PCR等。
1. 借助载体上的遗传标志进行筛选 (1) 利用抗生素抗性标志筛选 (2) 利用基因的插入失活/插入表达 特性筛选 (3) 利用标志补救筛选 (4)利用噬菌体的包装特性进行筛选 2. 序列特异性筛选
1.克隆的质粒载体 允许外源的DNA插入，储存。主要是
DNA水平上的操作。
2.基因表达的质粒载体 允许外源DNA的插入、储存和表达。
实验原理
• 普通Taq酶会在3´末端加一个A，这样所有PCR产 物都会在双链DNA的3´端均有一个单链状态的A； • T-载体是线状DNA片段，在DNA双链的3´端均有 一个单链状态的T；
克隆基因的表达
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主要步骤： ① 制备目的基因和选择相关载体 ② 目的基因和有关载体进行连接 ③ 重组的DNA导入受体细胞
④ DNA重组体的筛选和鉴定
⑤ DNA重组体的扩增、表达和其他研究
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以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程
克隆载体 重组DNA分子 受体菌 含重组分子的转化菌
限制酶切位点
cos L R cos
真核生物染 色体DNA
限制酶消化
cos L 左臂
限制酶部分消化
除去中间片段
R cos 右臂
~20 Kb DNA 片段
外源DNA与载体DNA混合
cos L ~20 Kb 外源 DNA 片段 R cos
连接反应
体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌
目的基因片段与 T载体 DNA连接，达到克隆基因
的目的。
• 材料：目的基因片段（回收的PCR产物） • 药品：pEMG T-Vector (Promega公司)
质粒（plasmid）
是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA
分子。大小约为
数千碱基对。常
有1 ~ 3个抗药
性基因，以利于 筛选。
质粒载体
基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点。 这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主 细胞。宿主和载体编码的片段各自半乳糖苷酶，使人工底物X-gal转 化成蓝色的代谢产物，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位 点上插入外源DNA片段，将使lac Z基因灭活，不能生成有
目的片段（100ng/ul） pGEM-T Easy（50ng/ul） T4 DNA Ligase 2×Rapid Ligation Buffer Total • 备注：混合均匀，瞬时离心。 4℃连接16小时，-20储存或直接用于转化。 3μl 1μl 1μl 5μl 10 μL
说 明
1. 回收 DNA 片段可以用沉淀法，但是只适用于 PCR 扩增 产物为单一片段，而且需要检测PCR扩增结果后进行；
（一）黏性末端 （二）人工接头的使用
（三）加入同聚体尾 （四）平端连接
（一）黏性末端
（二）人工接头
（三）加入同聚体尾
待克隆DNA片段
混合、退火
重组质粒
空白质粒
（四）平端连接
目的基因
5´ 3´ 5´ 限制酶或机械剪切 3´ 5´ λ-核酸外切酶 3´ 5´ 3´ 5´
载体DNA
限制酶 3´ 5´ λ-核酸外切酶 5´ 末端转移酶 + dTTP 3´
(1) RE酶切法
(4) DNA测序法
(2) PCR法
(3) 核酸杂交法
（一） 遗传学方法
1. 插入灭活法
插入失活筛选带有重组载体的克隆
志比昆仑
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2. 蓝-白筛选（α互补）
许多载体（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含
有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和氨基端145个氨
活性的β-半乳糖苷酶，结果菌落呈现白色。
α互补筛选（蓝-白筛选）
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PCR产物的T载体 克隆和转化
青海大学 Qinghai University
实验目的： 学习T载体的特点和PCR产物的克隆方法。 实验要求：
掌握利用 T 载体克隆 PCR 产物的方法；复习连接
实验流程。
技术应用：
2.此种连接方法是根据普通 Taq酶会在3´末端加一个A的
原理发明的；注意不同的酶的性能不同，保真性强的
Taq酶会自动切除末端的 A，所以，这种酶的扩增产物
需要补加A后再连接。 3.T- 载体的阳性克隆筛选同样可以使用录酶 cDNA
AAAA
逆转录酶
AAAA TTTT
复制
双链cDNA 载体
碱水解
TTTT
DNA聚合酶Ⅰ
重组DNA分子受体菌 cDNASI核酸酶化学合成法获取目的基因
由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。
二、载体的选择与准备——选
几种常用克隆载体的比较
比较内容 质 粒 λ噬菌体 黏性质粒 M13噬
+
<22 kb
+ +
40～50 kb
+ -
<1 kb
-
亚克隆
序列分析 E.coli表达
+
+ +
+ +
-
+
+ -
注：+表示可用；-表示不可用
三、DNA分子的体外连接——接
• 二者在连接酶的作用下连接为一个重组的环状分子，
从而达到克隆的目的。
载体结构的三大要素： 多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ） 独立的复制单位
pGEM-T 载体的结构
pGEM-T Easy 载体的结构
实验步骤
（1）目的片段的制备--胶回收法回收PCR产物：
(2)连接实验：
在0.2ml PCR管加入以下试剂：