实验四、PCR产物的T载体克隆和转化

克隆基因的表达
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主要步骤： ① 制备目的基因和选择相关载体 ② 目的基因和有关载体进行连接 ③ 重组的DNA导入受体细胞
④ DNA重组体的筛选和鉴定
⑤ DNA重组体的扩增、表达和其他研究
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以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程
3´
3´ A(A)nA
5´
5´ 3´ 末端转移酶 + dATP 5´ 3´A(A)nA 3´ T(T)nT 5´
5´
T(T)nT 3´
T4 DNA连接酶 15º C
重组体
四、外源DNA导入宿主细胞——转
受体菌条件： 安全宿主菌
限制酶和重组酶缺陷
处于感受态(competent) 导入方式： 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection)
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一、目的基因的获得——分
（一）从基因组文库中获得
（二）从cDNA文库中获得
（三）PCR扩增特定基因
（四）人工合成
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从基因组DNA文 库获取目的基因
组织或细胞染色体DNA
限制性内切酶 基因片断
基因组DNA文库
存在于转化细胞内 由克隆载体所携带的所 有基因组DNA的集合
基因文库 用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库
从cDNA文库获取目的基因
mRNA
反转录酶 cDNA
AAAA
逆转录酶
AAAA TTTT
复制
双链cDNA 载体
碱水解
TTTT
DNA聚合酶Ⅰ
重组DNA分子
受体菌 cDNA文库
SI核酸酶
化学合成法获取目的基因
由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。
克隆载体 重组DNA分子 受体菌 含重组分子的转化菌
限制酶切位点
cos L R cos
真核生物染 色体DNA
限制酶消化
cos L 左臂
限制酶部分消化
除去中间片段
R cos 右臂
~20 Kb DNA 片段
外源DNA与载体DNA混合
cos L ~20 Kb 外源 DNA 片段 R cos
连接反应
体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌
五、目的基因的筛选和鉴定——筛
外源基因导入宿主细胞后，筛选含有 目的基因的阳性克隆并加以扩增。
所用的方法主要有遗传学方法、免疫
学方法、核酸杂交法、PCR等。
1. 借助载体上的遗传标志进行筛选 (1) 利用抗生素抗性标志筛选 (2) 利用基因的插入失活/插入表达 特性筛选 (3) 利用标志补救筛选 (4)利用噬菌体的包装特性进行筛选 2. 序列特异性筛选
(1) RE酶切法
(4) DNA测序法
(2) PCR法
(3) 核酸杂交法
（一） 遗传学方法
1. 插入灭活法
插入失活筛选带有重组载体的克隆
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2. 蓝-白筛选（α互补）
许多载体（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含
有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和氨基端145个氨
（一）黏性末端 （二）人工接头的使用
（三）加入同聚体尾 （四）平端连接
（一）黏性末端
（二）人工接头
（三）加入同聚体尾
待克隆DNA片段
混合、退火
重组质粒
空白质粒
（四）平端连接
目的基因
5´ 3´ 5´ 限制酶或机械剪切 3´ 5´ λ-核酸外切酶 3´wk.baidu.com5´ 3´ 5´
载体DNA
限制酶 3´ 5´ λ-核酸外切酶 5´ 末端转移酶 + dTTP 3´
• 二者在连接酶的作用下连接为一个重组的环状分子，
从而达到克隆的目的。
载体结构的三大要素： 多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ） 独立的复制单位
pGEM-T 载体的结构
pGEM-T Easy 载体的结构
实验步骤
（1）目的片段的制备--胶回收法回收PCR产物：
(2)连接实验：
在0.2ml PCR管加入以下试剂：
2.此种连接方法是根据普通 Taq酶会在3´末端加一个A的
原理发明的；注意不同的酶的性能不同，保真性强的
Taq酶会自动切除末端的 A，所以，这种酶的扩增产物
需要补加A后再连接。 3.T- 载体的阳性克隆筛选同样可以使用“蓝白斑”法， 方便，快捷。
1.克隆的质粒载体 允许外源的DNA插入，储存。主要是
DNA水平上的操作。
2.基因表达的质粒载体 允许外源DNA的插入、储存和表达。
实验原理
• 普通Taq酶会在3´末端加一个A，这样所有PCR产 物都会在双链DNA的3´端均有一个单链状态的A； • T-载体是线状DNA片段，在DNA双链的3´端均有 一个单链状态的T；
目的基因片段与 T载体 DNA连接，达到克隆基因
的目的。
• 材料：目的基因片段（回收的PCR产物） • 药品：pEMG T-Vector (Promega公司)
质粒（plasmid）
是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA
分子。大小约为
数千碱基对。常
有1 ~ 3个抗药
性基因，以利于 筛选。
质粒载体
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医用分子生物学 实验技术
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重组DNA技术操作步骤
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基本原理
目的基因的获取 克隆载体的选择和构建 DNA导入受体细胞
外源基因与载体的连接 重组体的筛选
基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点。 这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主 细胞。宿主和载体编码的片段各自均无酶活性，但它们可 以互补形成具有活性的β-半乳糖苷酶，使人工底物X-gal转 化成蓝色的代谢产物，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位 点上插入外源DNA片段，将使lac Z基因灭活，不能生成有
二、载体的选择与准备——选
几种常用克隆载体的比较
比较内容 质 粒 λ噬菌体 黏性质粒 M13噬菌体
克隆容量
基因组DNA文库 cDNA文库
<10 kb
+
<22 kb
+ +
40～50 kb
+ -
<1 kb
-
亚克隆
序列分析 E.coli表达
+
+ +
+ +
-
+
+ -
注：+表示可用；-表示不可用
三、DNA分子的体外连接——接
活性的β-半乳糖苷酶，结果菌落呈现白色。
α互补筛选（蓝-白筛选）
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PCR产物的T载体 克隆和转化
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实验目的： 学习T载体的特点和PCR产物的克隆方法。 实验要求：
掌握利用 T 载体克隆 PCR 产物的方法；复习连接
实验流程。
技术应用：
目的片段（100ng/ul） pGEM-T Easy（50ng/ul） T4 DNA Ligase 2×Rapid Ligation Buffer Total • 备注：混合均匀，瞬时离心。 4℃连接16小时，-20储存或直接用于转化。 3μl 1μl 1μl 5μl 10 μL
说 明
1. 回收 DNA 片段可以用沉淀法，但是只适用于 PCR 扩增 产物为单一片段，而且需要检测PCR扩增结果后进行；