分子诊断学重点1

分子诊断：应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化而做出诊断的技术，称为分子诊断。

分子诊断学：是临床检验诊断学的一个重要分支，它利用分子生物学技术来研究机体外源性和内源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的改变，从而为疾病的预测、预防、诊治和转归提供分子水平信息。

基因：基因是一段携带功能产物（多肽、蛋白质、tRNA、rRNA和某些小分子RNA）信息的片段基因组：是指生物体的一套完整的单倍体遗传信息，包括所有基因和基因间的区域。

基因组学：指对所有基因进行基因组作图（包括遗传图谱、物理图谱、转录图谱）、核苷酸序列分析、基因定位和基因功能分析的一门科学。

人类基因组多样性：即人类基因组的个体差异。

生物大分子：指分子体内由分子量较低的基本结构单位首位相连形成的多聚化合物。

CsCl-EB密度梯度超速离心法：CsCl-EB法是一种沉降平衡离心法，经超速离心，离心介质CsCl形成一连续的密度梯度，在过量EB存在的条件下，各种不同密度的物质经离心平衡后得以分开。

(CsCl-EB法分离质粒和染色体DNA就取决于溴化乙锭与线状及闭环DNA分子的结合量有所不同)。

Western印迹：蛋白质印迹，又称免疫印迹，是一种通过标记的抗体检测经SDS-PAGE分离的特定蛋白质的技术。

克隆载体：能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA分子，用于在宿主细胞中克隆和扩增外援DNA片段
表达载体：能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA分子，用于在宿主细胞中获得外援基因的表达产物。

重组DNA技术：是指在基因水平上，将目的DNA在体外重组于能自我复制的载体DNA分子上，然后将重组DNA导入宿主细胞中进行增生，以获得大量的目的DNA片段，或以此为基础，通过基因的诱导表达，得到大量相应蛋白质产物的过程。

基因组文库：将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞进行克隆。

这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。

cDNA文库：提取组织细胞的mRNA，逆转录成Cdna, 与适当载体连接后转化受体细胞，得到含重组DNA的噬菌体或细菌克隆，从而构建成某种生物的cDNA 文库。

基因工程:又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因(DNA分子)，按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品
PCR即聚合酶链反应，是利用DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）等在体外条件下，催化一对引物间的特异DNA片断合成的基因体外扩增技术。

核酸分子杂交：不同来源的单链核酸分子在适合的温度和离子强度下，通过碱基互补形成双链杂交体的过程
生物芯片:是采用类似集成电路制作中的微加工技术，将生命科学研究中的若干不连续过程集成到一块几平方厘米大小的芯片上，并使这些分散的过程连续化与微型化，以此来实现对大量生物样品中各数据的快速自动和并行处理。

基因芯片：将大量的基因片段有序地，高密度的排列在玻璃片或纤维膜等载体上，称之为基因芯片。

第二章
1分子诊断的主要特点是什么？
主要特点：直接以疾病基因及其表型为检测对象，特异性高，属于病因
学诊断，其检测结果不仅具有描述性，且具有准确预测性;分子诊断不仅可
准确诊断有基因表型异常的疾病，更重要的是其可对疾病基因型的变异作
出判断。

2、分子诊断学经历了哪几个发展阶段？每个阶段各有什么特征性技术得到建立及应用？
第一阶段：主要利用DNA分子杂交方法进行遗传病的基因诊断。

第二阶段：创建并利用PCR技术。

第三阶段：以生物芯片为代表的高通量密集型技术。

4、真核生物基因组结构特点有哪些？与原核比较，主要区别是什么？
真核生物基因结构特点：1）基因组庞大
2）线状双链DNA和二倍体
3）非编码区远多于编码区
4）功能基因大多不连续
5）重复序列
5、真核生物线粒体基因组有何特点？
①非孟德尔的母性遗传②高突变率③异质性和复制分离④阈值效应⑤半保留复制与协调作用
6、什么是人类基因组多样性？产生多态性的方式主要是什么？
人类基因组多样性：即人类基因组的个体差异。

产生的主要方式：（1）重复序列单元的拷贝数变异
（2）可转座元件导致的分子多态
（3）单个核苷酸的变异
第三章
2、酚抽提法制备真核基因组DNA的原理及相关试剂的作用。

酚抽提法：主要利用基因组DNA较长的特性，将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。

首先在含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶的条件下裂解细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA,加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团漂浮其中，可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。

相关试剂作用：EDTA为二价金属离子螯合剂，可用螯合DNA酶激活所需要的Mg2+ Ca2+等二价金属离子，从而抑制DNA酶的活性，并具有降低细胞膜稳定性的作用；SDS 为阴离子去垢剂，其作用是降解细胞膜及乳化脂质和蛋白质，使与其结合的物质沉淀从而达到分离作用，另外SDS具有使蛋白质变形、解聚和降解DNA酶的作用；RNA酶主要有效水解RNA；蛋白酶K则可水解各种蛋白质及裂解细胞酚使一种强蛋白变性剂，可使蛋白质变性沉淀，也可抑制DNA酶的活性；pH8.0的Tris溶液主要是使DNA能顺利进入水相，而避免其滞留于蛋白质层。

3、碱裂解法制备质粒DNA的原理。

碱裂解法主要利用在NaOH提供的高碱性（12.0—12.6）条件下，强阴离子去垢剂SDS 破坏细胞膜，使细胞裂解，经处理后使宿主细胞染色体DNA缠绕在细胞膜碎片上形成的大分子复合物，在高钾盐条件下形成沉淀，而质粒DNA保留于上清中容易通过离心将其分离，当PH调至中性时，宿主染色体DNA片段也不能再复性。

而质粒DNA链重新恢复其天然状态。

通过无水乙醇沉淀质粒DNA，并用70%的乙醇洗涤，得到的质粒DNA可用于限制酶图的绘制、细菌转化、特定DNA片段的分离、DNA测序和PCR等试验。

第三章生物大分子的分离纯化
4在对真和细胞RNA进行分离纯化时，如何避免和取出Rnase的污染？酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法分离总RNA的原理。

一要全力避免细胞外RNase的污染并抑制其活性，二要尽快地抑制细胞内RNase的活性并极力地去除RNase。

对广泛存在的细胞外RNase，应在RNA制备的全过程中保持高度的警惕，并采取严格的措施以避免其污染和抑制其活性。

空气中弥漫的烟雾与飞扬的灰尘都可能因携带细菌、真菌等微生物而带来RNA酶的污染，应选择一个洁净的实验室进行操作。

操作者是RNA酶污染的一个重要来源，全部试验过程中均需戴手套与口罩操作并经常更换，所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200°C烘烤2h 以上。

凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦炭酸二乙酯（DEPC）水溶液处理。

除DEPC外，其他RNA酶如钒氧核苷酸复合物，这种由氧钒离子和4种核糖核苷之中的任意一种所形成的复合物，能与多种RNA酶结合并几乎能完全抑制RNA酶的活性。

原理：以4mm/L的异硫氰酸胍为蛋白变形剂，0.14mol/L的β-巯基乙醇可切断蛋白分子内二硫键来提高蛋白变形，然后在pH4.0的酸性条件下，经酚/氯仿抽提裂解溶液，通过异丙醇沉淀RNA与75%的乙醇洗涤来制备RNA。

、
5.蛋白质分离纯化的方法、含量的测定及纯度的鉴定
蛋白质分离:二维凝胶电泳（1等电聚焦凝胶电泳2SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳3图像分析技术）
第四章分子克隆
克隆载体必须具有四个条件：①具备复制能力，保证重组DNA在宿主细胞内独立复制②有一个或多个限制性内切酶的单一识别点，便于目的基因的插入③具备多个拷贝数，易与宿主细胞的染色体分开，便于分离提纯④有一定的标记基因，便于进行筛选⑤有较高的遗传稳定性
基因克隆的载体类型：质粒载体，噬菌体载体，黏粒载体，人工染色体载体，噬菌粒载体
质粒特点如下：１、分子相对较小（３∽１０kb）；２、松驰型复制；３、具有适当的多克隆位点以便外源DNA 插入；４、具有插入失活筛选标志，便于从平板上直接筛选阳性重组子；５、质粒能携带的外源DNA 片段一般较小（<15kb
基因克隆过程包括以下步骤：１、获得待克隆的DNA 片段（基因）；２、载体的选择３、目的基因与载体连接成重组DNA４、重组DNA导入受体细胞５、重组体的筛选
酶主要用途
限制性核酸内切酶识别DNA特定序列，
DNA聚合酶I或其大片段（1）缺口平移制作标记DNA探针
（2）合成cDNA第二链
（3）填补双链DNA3′凹端
（4）DNA序列分析
逆转录酶将mRNA转录成cDNA以制备基因片段
DNA连接酶连接两个DNA分子或片段
2. ColE1：天然质粒，属高拷贝型。

特点是在培养基中加入氯霉素抑制细菌蛋白质合成后，质粒仍然能复制达到每个细胞1000-3000拷贝之多。

选择标记：大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫的基因（immE1）
3. pBR322
该质粒具有以下优点：
1）分子大小4363bp，容易纯化。

2）含有2个抗生素抗性基因，可以作为选择标记。

而且每一个标记基因都含有单一的酶切位点，可以插入DNA，amp基因内可被Pst I, Pvu I, Sac I切开，而四环素抗性基因可被BamH I, Hind III切开，通过插入失活筛选重组子。

3）受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到15个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，可达到1000-3000拷贝，如氯霉素。

可以产生大量的重组pBR322分子4. pUC系列
pUC8的优点：
1）突变位点位于复制起点，复制前可以使细胞中质粒的拷贝数达到500-700个，可以提高载体的产量。

2)重组子的鉴定可一步完成，固体培养基中添加amp和X-gal, IPTG，节约了一半的时间。

3）pUC8的多克隆位点，可以使具有不同粘端的DNA片段插入载体，而不必连接linker。

4）载体中的多克隆位点与M13mp系列的载体是相同的，因此，插入pUC系列的克隆DNA 可以直接转入M13mp载体，可以进行DNA测序和体外定点突变。

DNA链末端合成终止法也称为Sanger法，它的基本原理是将2ˊ,3ˊ﹣双脱氧核苷酸（ddNTP）参入到合成的DNA链中，由于脱氧核糖的3ˊ位碳原子上没有羟基，因此不能与下一位核苷酸反应形成磷酸二酯键，DNA合成反应即终止。

在测定时，首先将模板分为四个反应管，分别加入引物和DNA聚合酶，将32P或35S标记的dNTP（仅标记一种即可）作为底物参入到新合成的DNA链中。

反应一定时间后，每一管内加入四种ddNTP 中的一种，就可获得一系列在不同部位终止的、大小不同的DNA片段。

经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离这些片段，再通过放射自显影就可以读出DNA的序列。

第七章
影响DNA变性和复性的因素有哪些？加热使DNA变性是实验室最常用的方法，成为热变性。

通常将DNA变性达到50%时的温度称为解链温度，用Tm表示。

Tm受许多因素影响：（1）DNA的碱基组成。

DNA的G C 含量越高，TM越大；A T含量越多，TM越低。

TM=69.3+0.41（G+C）%（2）溶液的离子强度离子强度越高，TM越大，解链温度范围变窄。

（3）溶液的PH。

PH在5—9范围内，TM变化不明显。

PH小于4或大于11时，均不利于氢键的形成。

（4）变性剂。

各种变性剂主要是干扰碱基堆积力和氢键的形成而降低TM
探针种类和优缺点（1）基因组DNA探针可以将目的基因DNA片断再次亚克隆到大
肠埃希菌质粒中保存，以便需要时扩增，还可以通过PCR扩增基因组DNA的特定片段，然后将其克隆到大肠埃希菌质粒中保存。

由于真核基因组含有不编码的内含子序列，因此真核基因组DNA探针用于检测基因表达时杂交效率要明显低于CDNA探针（2）cDNA 探针用这种技术获得的DNA探针不含有内含子序列，尤其适用于基因表达的检测。

（3）RNA探针优点是效率高灵敏度高稳定性高特异性高，缺点是不稳定，易被降解。

（4）寡核苷酸探针寡核苷酸探针制备方便，但灵敏度稍差。

所用探针标记方法和原理（1）酶促法标记核酸探针A缺口平移法利用大肠埃希菌DNA 聚合酶I同时具有5’→3’的核酸外切酶活性和5’→3’聚合酶活性，将已被放射性核素或非放射性标志物修饰的dNTP掺入到新和成的DNA探针中去的一种核酸探针标记方法。

（2）随机引物法人工合成的含有各种可能排列顺序的六核苷酸片段的混合物，，可以与任何核酸片段杂交，并作为聚合酶反应的引物，在DNA聚合酶和dNTP存在的条件下，按碱基互补原则不断在DNA的3’OH端添加标记的单核苷酸。

（3）DNA探针的末端标记
A Klenow大片段的3’末端标记法用限制性内切酶将模板DNA笑话，产生5’粘性末端，
然后在KlenowDNA聚合酶作用下，以突出的一条链为模板将DNA3’凹端补平。

B T4噬菌体多核苷酸激酶的5’末端标记法用碱性磷酸酶取出DNA双链的5’末端磷酸集团，以标记的【r-32P】--ATP为底物，在T4多核苷酸激酶的作用下，对DNA片段进行5’末端标记（4）聚合酶链反应标记DNA探针利用TAQDNA聚合酶和标记的DNTP，以少量的起始模板合成高比活的双链或单链DNA探针。

（5）RNA探针的标记RNA聚合酶体外转录法制备（6）寡核苷酸链探针的标记通过在寡核苷酸合成时加入特定的标记的核苷酸来实现；也可以通过DNA探针标记法对其3’或5’末端进行标记。

化学法标记核酸探针（1）光敏生物素标记核酸探针光敏基团在光照射下可以与DNA 或RNA的碱基发生公价交联反应从而使核酸探针被标记。

（2）酶标记核酸探针将碱性磷酸酶或HRP通过化学方法直接交联到核酸探针上对核酸探针进行标记
第九章
生物芯片的种类（1）微阵列芯片包括基因芯片蛋白质芯片细胞芯片和组织芯片等（2）微流芯片包括毛细管电泳芯片PCR芯片介电电泳芯片等。

基因诊断的主要技术有核酸分子杂交、聚合酶链反应和生物芯片技术。

第六章PCR
PCR的原理。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”
PCR反应体系的五要素包含DNA模板寡核苷酸引物DNA聚合酶dNTP及含有必须离子的缓冲液，这些因素都对PCR反应产生影响。

PCR引物设计的原则：（1）引物的长度每条引物的长度可以在18—40bp之间，但以20—24BP最佳。

引物过短，会降低引物的特异性；引物过长，会使反应中退火不完全，模板结合不充分，导致扩增产物的减少。

（2）引物的末端3’末端的第一个和第二个碱基影响DNA聚合酶的延伸效率，影响PCR反应的扩增效率及特异性。

5’端的碱基无严格要求（3）引物的位置（4）引物的GC含量两条引物要有匹配的GC含量和相似的退火温度，否则会影响扩增的效率和特异性。

引物的G+C含量也应适当，一般在40%--75%之间。

5引物扩增跨度⑦引物的特异性
PCR的一般方案 1 50uLPCR反应体系的组成（1）组成：A样品DNA0.1--1ug：B：正链引物（25umol/L）
1.0uL;C:负链引物（25umol/L）1.0uL;D:脱氧核苷三磷酸（dNTP各
2.5mmol/L）4.0uL；E：10*PCR缓冲
液5.0uL；F：MgCl2(25mmol/L)3.0uL;G:TaqDNA聚合酶1--2.5U；H：蒸馏的去离子水补至50uL。

加入30uL 液状石蜡，短暂离心混匀。

（2）对照：阳性对照空白对照分别以阳性模板DNA 蒸馏去离子水取代样品DNA
2：PCR仪工作参数的设置：94C 30--60S 55C 30--60S 72C30--60S ，循环30次，最后72C延伸5分钟。

逆转录PCR（RT-PCR）RNA经逆转录后可作为PCR的模板.逆转录PCR（RT－PCR）常用于基因表达研究（定量PCR）和逆病毒检测.设计RT－PCR引物时，应使引物分别位于不同的外显子中，以便区别cDNA和gDNA扩增产物。

多重PCR（Multiple?PCR）在同一PCR反应体系中用多对引物（覆盖不同长度的靶序列）同时扩增。

例如用多重PCR进行DNA缺失筛选
巢式PCR（n- PCR）用第一次PCR扩增区域内部的第二对（套式）引物对第一次PCR产物再次扩增,可以增加特异性和灵敏度。

不对称PCR在PCR反应体系中，限制引物之一的浓度（50－100:1）进行扩增，可得到单链PCR产物,可用于制备单链测序模板或单链DNA杂交探针。

锚定PCR帮助克服序列未知或序列未全知带来的障碍。

在未知序列未端添加同聚物尾序，将互补的引物连接于一段带限制性内切酶位点的锚上，在锚引物和基因另一侧特异性引物的作用下，将未知序列扩增出来。

荧光PCR原理是用不同荧光染粒，分别标记于不同寡核苷酸引物上，同时扩增多个DNA片段，反应完毕后，利用分子筛选去多余的引物。

用紫外线照射扩增产物，就能显示某一DNA区带荧光染料颜色的组合，如果某一DNA区带荧光染色料颜色的组合，如果某一DNA区带缺失，则会缺乏相应的颜色
原位PCR技术：它可使扩增的特定DNA片段在分离细胞和组织切片中定位
（1）限制性内切酶酶谱分析法：
此方法是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因变异。

所示为β珠蛋白的基因。

当该基因第六个密码子发生A→T突变时，所编码的氨基酸从谷氨酸被改变为缬氨酸，因而导致镰状细胞贫血症。

该突变同时也造成DNA序列中的一个 MstⅡ限制性酶切位点丢失，利用这一特定可进行基因诊断。

将正常人和带有突变基因个体的基因组DNA分别用Mst Ⅱ酶消化后，凡是基因组上具有MstⅡ位点的地方都会被切断，酶切后得到大小不等的片段。

所有这些片段可通过电泳进行分离。

在电泳过程中，各个片段可按大小分离开来。

这种方法不仅可以诊断出是正常人还是患者，而且还可以诊断出是纯合突变还是杂合突变。

（2）DNA限制性片段长度多态性（ restriction fragment length polymorphism, RFLP）
在人类基因组中，平均约200对碱基可发生一对变异（称为中性突变，）中性突变导致个体间核苷酸序列的差异，称为DNA多态性。

突变、重排、单个核苷酸的插入或缺失可使DNA顺序发生改变。

其中有些可能造成限制酶切位点的增加、缺失或易位，致使DNA分子的限制酶切位点数目、位置发生改变。

用限制酶切割基因组时，所产生的限制性片段的数目和每个片段的长度就不同，这就是限制性片段长度多态性。

在某一特定家族中，如果某一致病基因与某一特异的多态性片段（ DNA多态性或限制性片段长度多态性）紧密连锁，就可以用这一多态性片段作为一种“遗传标志”，来判断家庭成员或胎儿是否为致病基因的携带者。

用“遗传标志”基因作为探针，进行杂交检测就可判断致病基因的存在与否。

2. PCR/单链构象多态性分析 (single strand conformation polymorphism， SSCP)
PCR/SSCP是一种快速检测基因突变的方法，其基本的原理是：单链DNA呈现复杂的构象，而这种立体构象主要是依靠单链内碱基配对等分子内相互作用维系的。

相同长度的单链DNA因碱基序列不同，甚至只是一个碱基不同，都可以形成不同的空间构象，在电泳时泳动的速率不同。

进行该项检测，首先是利用PCR技
术对待测基因片段进行扩增，分别获得正常对照DNA的PCR产物和待测DNA的PCR产物，然后将DNA变性成单链，采用非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离。

单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中形成不同的构像。

在电泳过程中，长度相同而构像不同的单链DNA分子在凝胶中的泳动速率不同。

如果待测DNA没有发生突变，其序列与正常对照DNA一致，电泳后在凝胶中的位置就会与正常对照组DNA的每一条带的位置完全一致。

如果待测DNA中有突变，电泳后就会出现位置不同的条带。

借此分析是否有致病基因的存在。