第四章 人工染色体载体
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14×106bp 14Mb 具真核mRNA的加工活性
yeast
一、YAC载体的复制元件和标记基因
1.复制必须成分
➢ 复制起点ori，自主复制序列ARS (autonomously replicating sequence)
➢ 着丝粒（CEN） 使染色体(chromosome)在分裂过程中能正确分配 到子细胞中有丝分裂(mitosis)中与纺锤丝 (spindle fiber)联系的那段DNA
4.感染E. coli：线状的重组DNA被注入细胞并通过cos 位点的环化，形成黏粒载体，象质粒(plasmid)一样 复制
在“染色体步查(chromosome walking)”过程 中染色体步查：chromosome walking 采用一段分离自某一重组体一端的非重复 DNA片段作为探针以鉴定含有相邻序列的重 组克隆。
mcs COS
BamHI酶切 CIP去磷酸
连接
包装 感染 铺平板 筛选 阳性克隆
大小：6.8 kb 可容纳35～45 kb的外源DNA片段
组成：含两个cos位点、抗性标记（ampr kanr）、 ori （ColE1复制起点）和4个多克隆位点(MCS)。
三、黏粒克隆载体
1.pJB8
简单黏粒
组成：抗性标记（ampr ）、 ori （ColE1复制起点） 、
cos位点和4个多克隆位点
大小：5.4kb 可容纳33-46.5kb外源DNA片段
➢对载体进行去磷酸化(dephosphorylation)处理， 否则易形成多联载体 ➢定向克隆(directed clone)
2. 混菌保存
混合单菌落，15%甘油，-70 C
生长平衡问题
3. 体内包装
重组缺陷噬菌体超感染，重新包装重组cosmid， 收集裂解混合物，在含少量氯仿 SM(0.3%)溶液中， 4C可贮存几年，或含7%二甲基亚砜(DMSO)ligate)、多个外源插入等问题 已解决 但仍不足以作为常规克隆，不如 噬菌体收获量相差悬殊 5．尽管似乎全面，但也许不能获得目的克隆，限
制酶位点(restriction sites)的非随机分布，污染限制 酶，重组缺失，扩增时目的克隆可能被淘汰。
第二节 酵母人工染色体载体 yeast artificial chromosome
酵母的生物学特征 Saccharomyces cerevisiae 酿洒酵母 扁圆形和卵形 3m 代时90min 16条染色体 30 用噬菌体颗粒感染recA+ E.coli（pUC18∷探针） ④ 发生重组 ⑤ 再次包装 ⑥ 再次感染，宿主为recA- E.coli(ampr, kanr)pWE15四、黏粒的扩增和贮存1. 滤膜影印
25%甘油 TB平板， -70 C
3.克隆与分析组成某一基因家族的真核DNA区段 如哺乳动物珠蛋白基因遍布于至少70 kb的DNA片段 中甚至有数十万个bp（几百kb）
二、黏粒载体的工作原理
1.分离外源DNA片段35～45 kb
2.外源DNA与两个黏粒(cosmid)相连，且cos方向相同
3.体外包装 在噬菌体A蛋白的terminase功能作用下 切割cos位点并将其中的外源DNA包装到成熟的噬 菌体颗粒中去
一般高浓度ATP存在下（5 mmol/L）抑制平端连接， 但对粘端没有影响。 35～45 kb (MobI/经CIP处理)的外源DNA片段与载 体的连接产物，可包装进入噬菌体颗粒，感染大3.pCOS1 E隆38～47 kb片段 包括噬菌体（38～52 kb）
N=ln(1-p)/ln(1-f)
哺乳动物 3x入片段占总 DNA的比值
N=ln(1-0.99)/ln(1-(1.7x104/3x109)Байду номын сангаас8.1x105
第四章 人工染色体载体 artificial chromosome vector
第一节 黏粒载体
一、黏粒(cosmid)的结构特征和用途
1.黏粒实际是质粒(plasmid)的衍生物，带有将DNA包 装到噬菌体颗粒中所需的DNA序列(cos序列)
2.组成：质粒复制起点(replication origin)（colE1）、 抗性标记ampr和cos位点，能象质粒一样转化 (transform)和增殖(multiplication)
从染色体上DNA克隆，亦即与该 DNA一端相邻接的DNA片段一步一步地达到靶DNA序列。
Sau3A1
经连接转化，可得到含已知片断两侧序列 的克隆子，杂交筛选，可进一步得到目标 基因两侧的序列。
Hu, et al., MM, 1992
如果 克隆片段平均大小为40 kb
N=ln(1-0.99)/ln(1-(4.0x104/3x109)=3.45x1中重组体 的数目
2.在单个重组体中克隆和增殖完整的（较大的）真核 基因。 如鸡前2胶原、鼠三氢叶酸还原酶（DHFR）的基 因至少为40kb，要克隆这些片断，需利用黏粒载体。 质粒载体虽可携带大片段，但转化率低。
1．提取的基因组DNA长度小于200 kb 2．提取的总DNA纯度不高，酶解受到抑制，须梯度离
心(gradient centrifugation) 3．无外源DNA，单个cos位点载体 → 5%空，双cos低
得多，charomid 高→ 20% 4．重组质粒(recombinant plasmid)拷贝数差异大，导致
yeast
一、YAC载体的复制元件和标记基因
1.复制必须成分
➢ 复制起点ori，自主复制序列ARS (autonomously replicating sequence)
➢ 着丝粒（CEN） 使染色体(chromosome)在分裂过程中能正确分配 到子细胞中有丝分裂(mitosis)中与纺锤丝 (spindle fiber)联系的那段DNA
4.感染E. coli：线状的重组DNA被注入细胞并通过cos 位点的环化，形成黏粒载体，象质粒(plasmid)一样 复制
在“染色体步查(chromosome walking)”过程 中染色体步查：chromosome walking 采用一段分离自某一重组体一端的非重复 DNA片段作为探针以鉴定含有相邻序列的重 组克隆。
mcs COS
BamHI酶切 CIP去磷酸
连接
包装 感染 铺平板 筛选 阳性克隆
大小：6.8 kb 可容纳35～45 kb的外源DNA片段
组成：含两个cos位点、抗性标记（ampr kanr）、 ori （ColE1复制起点）和4个多克隆位点(MCS)。
三、黏粒克隆载体
1.pJB8
简单黏粒
组成：抗性标记（ampr ）、 ori （ColE1复制起点） 、
cos位点和4个多克隆位点
大小：5.4kb 可容纳33-46.5kb外源DNA片段
➢对载体进行去磷酸化(dephosphorylation)处理， 否则易形成多联载体 ➢定向克隆(directed clone)
2. 混菌保存
混合单菌落，15%甘油，-70 C
生长平衡问题
3. 体内包装
重组缺陷噬菌体超感染，重新包装重组cosmid， 收集裂解混合物，在含少量氯仿 SM(0.3%)溶液中， 4C可贮存几年，或含7%二甲基亚砜(DMSO)ligate)、多个外源插入等问题 已解决 但仍不足以作为常规克隆，不如 噬菌体收获量相差悬殊 5．尽管似乎全面，但也许不能获得目的克隆，限
制酶位点(restriction sites)的非随机分布，污染限制 酶，重组缺失，扩增时目的克隆可能被淘汰。
第二节 酵母人工染色体载体 yeast artificial chromosome
酵母的生物学特征 Saccharomyces cerevisiae 酿洒酵母 扁圆形和卵形 3m 代时90min 16条染色体 30 用噬菌体颗粒感染recA+ E.coli（pUC18∷探针） ④ 发生重组 ⑤ 再次包装 ⑥ 再次感染，宿主为recA- E.coli(ampr, kanr)pWE15四、黏粒的扩增和贮存1. 滤膜影印
25%甘油 TB平板， -70 C
3.克隆与分析组成某一基因家族的真核DNA区段 如哺乳动物珠蛋白基因遍布于至少70 kb的DNA片段 中甚至有数十万个bp（几百kb）
二、黏粒载体的工作原理
1.分离外源DNA片段35～45 kb
2.外源DNA与两个黏粒(cosmid)相连，且cos方向相同
3.体外包装 在噬菌体A蛋白的terminase功能作用下 切割cos位点并将其中的外源DNA包装到成熟的噬 菌体颗粒中去
一般高浓度ATP存在下（5 mmol/L）抑制平端连接， 但对粘端没有影响。 35～45 kb (MobI/经CIP处理)的外源DNA片段与载 体的连接产物，可包装进入噬菌体颗粒，感染大3.pCOS1 E隆38～47 kb片段 包括噬菌体（38～52 kb）
N=ln(1-p)/ln(1-f)
哺乳动物 3x入片段占总 DNA的比值
N=ln(1-0.99)/ln(1-(1.7x104/3x109)Байду номын сангаас8.1x105
第四章 人工染色体载体 artificial chromosome vector
第一节 黏粒载体
一、黏粒(cosmid)的结构特征和用途
1.黏粒实际是质粒(plasmid)的衍生物，带有将DNA包 装到噬菌体颗粒中所需的DNA序列(cos序列)
2.组成：质粒复制起点(replication origin)（colE1）、 抗性标记ampr和cos位点，能象质粒一样转化 (transform)和增殖(multiplication)
从染色体上DNA克隆，亦即与该 DNA一端相邻接的DNA片段一步一步地达到靶DNA序列。
Sau3A1
经连接转化，可得到含已知片断两侧序列 的克隆子，杂交筛选，可进一步得到目标 基因两侧的序列。
Hu, et al., MM, 1992
如果 克隆片段平均大小为40 kb
N=ln(1-0.99)/ln(1-(4.0x104/3x109)=3.45x1中重组体 的数目
2.在单个重组体中克隆和增殖完整的（较大的）真核 基因。 如鸡前2胶原、鼠三氢叶酸还原酶（DHFR）的基 因至少为40kb，要克隆这些片断，需利用黏粒载体。 质粒载体虽可携带大片段，但转化率低。
1．提取的基因组DNA长度小于200 kb 2．提取的总DNA纯度不高，酶解受到抑制，须梯度离
心(gradient centrifugation) 3．无外源DNA，单个cos位点载体 → 5%空，双cos低
得多，charomid 高→ 20% 4．重组质粒(recombinant plasmid)拷贝数差异大，导致