第四章 人工染色体载体
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第四章 人工染色体载体
第4章 人工染色体载体黏粒载体 酵母人工染色体载体 细菌人工染色体载体 P1噬菌体载体和P1人工染色体载体表4-1 5种常见高容量克隆载体及其基本特性载体黏粒 P1 PAC BAC YAC容量（kb） 复制子30-45 70-100 130-150 120-300 250-400 ColE1 P1 P1 F ARS宿主拷贝数重组DNA导入 宿主的方式转导 转导 电转化 电转化 转化筛选标记— sacB sacB α-互补 ade2克隆DNA 获取方法 碱抽提大肠杆菌 高 大肠杆菌 1 大肠杆菌 1 大肠杆菌 1 酵母菌 1脉冲场电 泳14.1 黏粒载体4.1.1 黏粒的结构特征和用途o 黏粒（cosmid）是质粒的衍生物，是带有cos序 列的质粒。
cos序列是λ噬菌体DNA中将DNA包装 到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。
o 黏粒的组成包括质粒复制起点（ColE1）、抗性 标记（ampr）、cos位点，因而能像质粒一样转 化和增殖。
o 它的大小一般5-7kb左右，用来克隆大片段 DNA，克隆的最大DNA片段可达45kb。
4.1.2 黏粒载体的 工作原理图4-1 黏粒载体 克隆 DNA的 一般原 理和步 骤24.1.3 黏粒克隆载体1．黏粒pJB8o 大小为5.4kb，由 ampr，ColE1复制 起点（ori）， cos位点，多克隆 位点组成，可容 纳33-46.5kb外源 DNA片段，主要用 来在细菌中克隆 真核DNA。
2．含双cos位点的黏粒载体o c2RB和 Supercos-1是 含双cos位点的 黏粒载体， c2RB大小为 6.8kb，含两个 cos位点，在 cos位点之间有 Kanr（图4-3）。
o 装载容量3346.5kb图4-3 黏粒载体c2RB图谱3图4-4 Supercos-1克隆 的原理和步骤o Supercos-1 大小为 7.94kb，含 有在真核细 胞中起作用 的来自猿猴 病毒SV40的 复制起点 ori-SV40和 新霉素抗性 基因 （neor）。
酵母人工染色体载体
3.ARS1顺序，来源于酵母第4号染色 体，可保证YAC在酵母细胞中自主 复制
YAC载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵 母中复制的必须元件包括复制起点序列即自主复制序 列、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒（CEN） 和两个端粒（TEL）。这些元件能满足自主复制、染 色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要。
7.HIS3EL)、DNA的复制起点 (ARS)和着丝粒(CEN)，以及必要的选择标记(TRP1等)基 因序列克隆到大肠杆菌质粒pBR322中，获得的重组质粒 就是YAC载体。
常用的YAC载体有3种，即pYAC3、pYAC4和pYAC5， 其差别主要是sup4基因上的克隆位点不同，分别为SnaBI、 EcoRI和NotI位点。
工作原理：
用BamH Ι酶切去除载体上的HIS3顺序，再用EcoR Ι 切开克隆位点，形成YAC的左右两臂，与外源大片段 DNA在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，转 化到酵母细胞后可像染色体一样复制，并随细胞分裂到 子细胞中去，达到克隆大片段DNA的目的。外源DNA 的转载导致抑制基因SUP4插入失活，从而使重组菌形成 红色菌落，而载体自身连接转入到酵母细胞后所形成的 菌落为白色。
酵母人工染色体pYAC4上的基本功能单位有：
1.CEN4顺序，来源于酵母第4号染色 体的着丝粒顺序，它提供酵母着丝 粒正常功能的所有顺式调控信息， 可保证YAC在酵母细胞分裂时向两 极运动；
2.TEL顺序，来源于四膜虫大核中的 rDNA分子的末端，提供端粒形成顺 序，可保证YAC末端不被降解和重 组，且能够稳定地复制；
利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称 为人工染色体载体。其装载外源DNA片段的容量就可以与染色 体的大小媲美。
如酵母人工染色体载体，它将酵母菌染色体上的复制区、 分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当 大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人 造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制 并遗传。
YAC载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵 母中复制的必须元件包括复制起点序列即自主复制序 列、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒（CEN） 和两个端粒（TEL）。这些元件能满足自主复制、染 色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要。
7.HIS3EL)、DNA的复制起点 (ARS)和着丝粒(CEN)，以及必要的选择标记(TRP1等)基 因序列克隆到大肠杆菌质粒pBR322中，获得的重组质粒 就是YAC载体。
常用的YAC载体有3种，即pYAC3、pYAC4和pYAC5， 其差别主要是sup4基因上的克隆位点不同，分别为SnaBI、 EcoRI和NotI位点。
工作原理：
用BamH Ι酶切去除载体上的HIS3顺序，再用EcoR Ι 切开克隆位点，形成YAC的左右两臂，与外源大片段 DNA在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，转 化到酵母细胞后可像染色体一样复制，并随细胞分裂到 子细胞中去，达到克隆大片段DNA的目的。外源DNA 的转载导致抑制基因SUP4插入失活，从而使重组菌形成 红色菌落，而载体自身连接转入到酵母细胞后所形成的 菌落为白色。
酵母人工染色体pYAC4上的基本功能单位有：
1.CEN4顺序，来源于酵母第4号染色 体的着丝粒顺序，它提供酵母着丝 粒正常功能的所有顺式调控信息， 可保证YAC在酵母细胞分裂时向两 极运动；
2.TEL顺序，来源于四膜虫大核中的 rDNA分子的末端，提供端粒形成顺 序，可保证YAC末端不被降解和重 组，且能够稳定地复制；
利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称 为人工染色体载体。其装载外源DNA片段的容量就可以与染色 体的大小媲美。
如酵母人工染色体载体，它将酵母菌染色体上的复制区、 分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当 大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人 造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制 并遗传。
第四章 基因工程的质粒载体
（a）表示位于F-细胞中的ColE1质粒的状，它的mob基因进行了转录，其产物 使bom位点发生单链断裂而出现缺口，于是ColE1 DNA 便从超盘旋的的结构 转变成为缺口环状的构型。但ColE1质粒缺乏形成性须的能力，无力进行结合 配对，所以它的DNA也就不能从一个细胞转移到另一个细胞。正是由于不能 够发生转移，这种从超盘旋到缺口环状的构型转变过程，就有可能被回复， 所以就出现这两种构型之间的平衡状态。
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
基因工程-第四章
（4） 插入失活型质粒载体 载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。
抗菌素抗性
外源DNA 无抗菌素抗性
（5）正选择的质粒载体（Direct selection vectors）
直接选择转化后的细胞。只有带有选择标记基因的转化 菌细胞才能在选择培养基上生长。
目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。
各类载体
pBR322 外源基因Pst I
Tet中存活 但在Amp中死亡
外源基因BamH I Amp中存活 但在Tet中死亡
pBR322 外源基因Pst I
Tet中存活 但在Amp中死亡
外源基因BamH I Amp中存活 但在Tet中死亡
3. pUC系列
•University of California 的 J. Messing 和 J. Vieria 于1978年，在pBR322 的基础上改造而成，如 pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、 pUC19。 • 元件来源
• 质粒空间构型与电泳速率
分子量相同的，scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最 慢。
OC L
SC
质粒的生物学基本特性
1.自主复制性
• 质粒复制子是质粒 DNA 中能自主复制并维持正常拷贝数的 一段最小的核酸序列单位。
• 两部分组成：复制起始区（ori）及其相关的调控元件。 • 质粒能利用寄主细胞的 DNA 复制系统进行自主复制。 • 质粒 DNA 上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系
必要的条件能力。
理想载体至少必备的条件
① 能在宿主细胞中自主复制 ②容易进入宿主细胞 ③ 容易插入外来核酸片段 ④ 容易从宿主细胞中分离纯化，便于重组操作 ⑤ 具有合适的筛选标记 ⑥ 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性
人工染色体克隆载体
人工染色体克隆载体：是一种“穿梭”载体，含有质立载体所必备的第一受体内原质立复制起始位点，还含有第二受体染色体DNA着丝点、端粒和复制起始点的序列，以及合速的选择标记基因。
固体发酵：某些微生物升长需水很上少，可利用疏松而含有必需营养物的固体培养基进行发酵生产。
蛋白质工程：基因工程的基础上，结合蛋白质结晶学计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识，通过对基因的人工定向改造等手段，从而达到对蛋白质进行修饰改造拼接以生产能满足人类需要的新型蛋白质技术。
DNA疫苗：是利用可隆于载体上的抗原基因直接注射机体，被细胞摄取并在细胞内表达相应的抗原，通过不同途径诱导机体的特异免疫应答。
人工种子：它是一种含有植物胚状体或芽营养成分激素以及其他成分的人工胶囊。
发酵工程：利用微生物生长速度快生长条件简单以及代谢过程特殊等特点，再合适条件下，通过现代化工程技术手段，由微生物的某中特定功能生产出人类所需的产品。
生物传感器：是用生物活性物质做敏感器件，配以适当的换能器所构成的分析工具。
载体：把能够承载外源基因，并将其带人受体细胞得以稳定维持的DNA分子。
胚胎移植：是由产生胚胎的供体和养育胚胎的受体分工合作共同繁殖后代。
基因治疗：是利用遗传学的原理治疗人类的疾病。
细胞融合：两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并染色体等遗传物质重组的过程。
花药培养：经过适当的诱导，花粉囊中的花粉可能去分化而发育成单倍体胚或愈伤组织，最终生产花粉植株。
原生质的融合概念：从同一个种或不同种分离得到的原生质体在适当的条件下融合得到细胞核物质和细胞质物质的混和。
固定化酶：指经物理或化学的方法处理,使酶变成不易随水流失即运动受限制,而又能发挥催化作用的酶制剂.基因克隆；是指在分子(DNA)水平上开展研究工作以获得大量的相同基因及其表达产物。
⊙生物技术有基因工程细胞工程酶工程发酵工程蛋白质工程基因工程包括目的基因分离与可隆载体重组转人受体细胞筛选和鉴定可隆子。
基因工程载体人工染色体载体
I
A
A
GTCACGTG
II 78-86bp
III
T TGTTTCTGNTTTCCGAAA
基因工程载体人工染色体载体
（2）端粒（TEL） 两个端粒序列Tel。 酵母端粒保守序列是(G4T2)n 重复序列。
（3）复制起点（ORI）
约100bp的自主复制序列（ARS）。 （真核生物中只有酵母菌有ARS）
基因工程载体人工染色体载体
• T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所 以 将 致 瘤 基 因 全 部 缺 失 即 卸 甲 (disarmed) 后，将细菌抗生素的抗性基因或其它序列 插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB 至LB内的序列转移并整合到植物基因组。
• Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的， 毒 性 基 因 可 以 顺 式 及 反 式 两 种 方 式 控 制 TDNA转移。
基因工程载体人工染色体载体
Triparental mating
• An E.coli strain A carrying a helper plasmid able to mobilize the intermediate vector in trans
• The E.coli strain B carrying the recombinant intermediate vector
基因工程载体人工染色体载体
基因工程载体人工染色体载体
Structure of a bacterial artificial chromosome (BAC), used for cloning large fragments of donor DNA. CMR is a selectable marker for chloramphenicol resistance. oriS, repE, parA, and parB are F genes for replication and regulation of copy number. cosN is the cos site from l phage. HindIII and BamHI are cloning sites at which foreign DNA is inserted. The two promoters are for transcribing the inserted fragment. The NotI sites are used for cutting out the inserted fragment.
第4章人工染色体载体
西南大学生物技术专业 基因工程
3
二、粘粒载体的工作原理
粘粒载体的主要工作原理类似l噬菌体 载体。在外源片段与载体连接时，粘粒载体 相当于l噬菌体载体的左右臂， cos位点通过 粘段退火后，再于外源片段相间连接成多联 体。当多联体与l噬菌体包装的蛋白质混合时 l噬菌体A基因蛋白的末端酶功能将切割成两 个cos位点，并将两个同方cos位点之间的片 段包装到l噬菌体颗粒中去。
第四章 人工染色体载体
第一节 第二节 第三节 第四节
粘粒载体 酵母人工染色体载体 细菌人工染色体载体 P1噬菌体载体和P1人工染色体载体
本课件是在网络资源基西础南大上学改生物进技而术成专业，基在因此工程对有关人士特致感谢！ 1
常规载体在工作时都是在不影响质粒或 噬菌体复制功能的基础上装载外源DNA片段的， 同时保持质粒或噬菌体的基本特性。这样一 来，这些载体所装载的容量就受到限制。利 用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段的载 体称为人工染色体载体，其装载外源DNA片段 的容量可以与 多个外源片段串联进入载体中 原料DNA片段短于200kb时，制备的目的DNA中相当一部分
的末端的一端不带酶切位点
总DNA纯度影响目的DNA的制备 西南大学生物技术专业 基因工程
12
第节 细菌人工染色体载体
细菌人工染色体载体（bacterial artificial chromosome，BAC）：就是基于大肠杆菌的F 质粒构建的高容量低拷贝质粒载体。
F质粒：是一个约100kb的质粒，编码60多种参 与复制、分配和结合过程的蛋白质。
西南大学生物技术专业 基因工程
片段的装载导致抑制基因sup4插入失活，从而使重组菌形成
红色菌落；而载体自身连接转入到酵母细胞后所形成的菌落 为白色。
酵母人工染色体载体
工作原理：
用BamH Ι酶切去除载体上的HIS3顺序，再用EcoR Ι切 开克隆位点，形成YAC的左右两臂，与外源大片段DNA在 该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，转化到酵母 细胞后可像染色体一样复制，并随细胞分裂到子细胞中去， 达到克隆大片段DNA的目的。外源DNA的转载导致抑制 基因SUP4插入失活，从而使重组菌形成红色菌落，而载体 自身连接转入到酵母细胞后所形成的菌落为白色。
酵母人工染色体pYAC4上的基本功能单位有：
1.CEN4顺序，来源于酵母第4号染色 体的着丝粒顺序，它提供酵母着丝粒 正常功能的所有顺式调控信息，可保 证YAC在酵母细胞分裂时向两极运动；
2.TEL顺序，来源于四膜虫大核中的 rDNA分子的末端，提供端粒形成顺 序，可保证YAC末端不被降解和重组， 且能够稳定地复制；
7.HIS3顺序。
酵母人工染色体载体的构建：
将酵母染色体DNA的端粒(TEL)、DNA的复制起点 (ARS)和着丝粒(CEN)，以及必要的选择标记(TRP1等)基因 序列克隆到大肠杆菌质粒pBR322中，获得的重组质粒就是 YAC载体。
常用的YAC载体有3种，即pYAC3、pYAC4和pYAC5， 其差别主要是sup4基因上的克隆位点不同，分别为SnaBI、 EcoRI和NotI位点。
优缺点
概念
酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome,YAC) 是利用酿酒酵母染色体的复制元件构建的载体，是最早 构建成功的人工染色体载体，其工作环境也是在酿酒酵 母中。
酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长代时为90min， 含16条染色体，其大小为225~1900kb，总计有14×106bp。
1.YAC载体在酵母中复制的必需元件包括：
人工染色体载体的研究和应用
】 。 述 ・
基 因 【 技 术 的 迅 速 发 埏 ，他 人 类 埘 ： 体 基 冈 的 结 Ｉ 物 卡 功 能 、 达及 其 捌拧 的 研 究 深 入 钊 分 子水 平 。而对 特 定 基 勾、 表 片段 的分 离和 获 ， ｌ 【 足上 述研 究 的筛 选 和 扶 得 均 为 可能 因 使 Ａ 此， 艇 纽 丈库 是 进 行 分 子兜 隆 和 基冈 组 结 构 功 能 研 究 的 撼 础 ： ０年 代 人 们 就 已提 …臧 阏 组 文 库 的概 念 Ｉ １ ７ ７ ９８ ．
隆 效 率 有 ｒ很 大 改 善 。 所 谓 人 ｌ染 色体 ． 指 一 类 能 在 生 物 细 胞 叶 独 立 、 定 ｒ 是 １ 稳 仔 往 和 遗传 的人 丁晕 组 Ｄ Ａ分 子， 至 少 应 具染 色 体 系 统 ， 哺 乳 动 物 人 Ｔ 染 色 体 ｆ ｍｍ ｌ ｎ ａ ｉｃａ ｍａ ａｉ ｒｆ ｉ ａ ｔ ｉ ｌ ｃ ｒｍ ｓ ｍ ， Ｃ ， 大 能 容 纳 ２ ０ ｋ ｈｏ ｏ ｏ ｅ ＭＡ ）最 ０ ０ ｐ的外 源 Ｄ Ａ， 以携 Ｎ 可 带 足 够 长 的 包 括 编码 顺 序 和 可 以 有 效 调 控 治 疗 基 因 表达 的
得 多种 类 型 ＨＡＣ 。ＨＡＣ ｓ ｓ可 以携 带 大 片段 基 因 组 ＤＮＡ， 建 是 立 转 基 因动 物 模 型 的重 要 手 段 ， 基 因 治疗 方 面 也 有 着 广 阔 在 的应 用 前 景 为 方 便 从 各 种 文 库 筛 选 到 的 一 新 基 进 行 功 能 研 究
什 的 类 似组 份 ：复 制 原 点 ｆ ｉｉ ｏ ｐｉ ｔｎ 、着 丝 ｃｎ ｏ ｇｎ ｆｅ ｌａｉ １ ｒ ｒ ｃ ｏ ￣（ — ｅ ｔ ｍ ｒ）Ｈ 粒 ＂ｅｍｅｅ。 ｌ８ ｒ ｅｅ￣ 端 ｏ ｆｔｈ ｌ ） ９ ３年 ， ｒ Ｉ 酵 母 染 色体 的 （ ｒ Ｍｕｒ ｙ１ 把
4.人工染色体载体
是一类酵母穿梭载体。 ARS1 TRP1 Apr ori TEL BamHI TEL
38
YAC具有自主复制
序列、克隆位点以及可在
细菌和酵母菌中选择的标 记基因。此外，YAC还具
pYAC4
EcoRI CEN4
URA3
有酵母菌染色体的一些特
点。可以接受100-1000kb 的外源DNA片段。
2014-3-22
写而成的，其原意是
指带cos位点的质粒。
2014-3-22
l fragment
10
考斯质粒（cosmid）= 质粒+ cos序列。
它是用正常的质粒同λ
Apr
PstI
BamHI
Tcr SalI
噬菌体的cos位点构成。
pHC79
cos序列是l噬菌体DNA
ori
6400 bp
中将DNA包装到噬菌体 颗粒中所需的DNA序列。
配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色
体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体 载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然 染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。
细菌人造染色体（BAC）
酵母人造染色体（YAC）
37
2014-3-22
第二节 酵母人工染色体载体
酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)
当外源DNA片段组入二联体线形DNA分子，
并且两个cos位点之间的DNA核苷酸序列达到足
够长时，两个cos位点可被A蛋白切割，产生具 有两个cos末端的重组λDNA分子，就能进行有 效的体外包装。
使用cosmid克隆载体的基本程序是：
先用一种限制性核酸内切酶切割cosmid克隆载体
38
YAC具有自主复制
序列、克隆位点以及可在
细菌和酵母菌中选择的标 记基因。此外，YAC还具
pYAC4
EcoRI CEN4
URA3
有酵母菌染色体的一些特
点。可以接受100-1000kb 的外源DNA片段。
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写而成的，其原意是
指带cos位点的质粒。
2014-3-22
l fragment
10
考斯质粒（cosmid）= 质粒+ cos序列。
它是用正常的质粒同λ
Apr
PstI
BamHI
Tcr SalI
噬菌体的cos位点构成。
pHC79
cos序列是l噬菌体DNA
ori
6400 bp
中将DNA包装到噬菌体 颗粒中所需的DNA序列。
配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色
体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体 载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然 染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。
细菌人造染色体（BAC）
酵母人造染色体（YAC）
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第二节 酵母人工染色体载体
酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)
当外源DNA片段组入二联体线形DNA分子，
并且两个cos位点之间的DNA核苷酸序列达到足
够长时，两个cos位点可被A蛋白切割，产生具 有两个cos末端的重组λDNA分子，就能进行有 效的体外包装。
使用cosmid克隆载体的基本程序是：
先用一种限制性核酸内切酶切割cosmid克隆载体
第四章 人工染色体载体
P1噬菌体载体
P1噬菌体DNA多联体与包装的关系
三、P1人工染色体载体
➢ PAC系由pAd10sacBⅡ 衍化而来，除去了腺病毒(adenovirus) 的填充片段，插入了基于pUC质粒的序列
F质粒
➢ Cavalli-Sforza(1950)和Hayes（1952） ➢ 大肠杆菌(E.coli)接合交配期染色体标记的单向转移 ➢ 大小约100kb，编码60多种参与复制、分配和接合过程的
蛋白质
➢ 可以整合到宿主染色体中，在大肠杆菌 ➢ 染色体中有30多个位点进行随机整合(random intergration)
3.大小：一般5 kb左右，可克隆38～47 kb片段 包括噬菌体（38～52 kb）
N=ln(1-p)/ln(1-f)
哺乳动物 3x入片段占总 DNA的比值
N=ln(1-0.99)/ln(1-(1.7x104/3x109) 用噬菌体颗粒感染recA+ E.coli（pUC18∷探针） ④ 发生重组 ⑤ 再次包装 ⑥ 再次感染，宿主为recA- E.coli(ampr, kanr)pWE15四、黏粒的扩增和贮存1. 滤膜影印
25%甘油 TB平板， -70 C
cosN：来自 phage，可 被 phage 的 terminase特异切割
LoxP：类似 phage 的 cosN，来自P1 phage，其Cre蛋白 特异性切割该位 点
制备平均大小100kb的外源片段
未酶切 Hindlll酶切2hrs Hindlll酶切4hrs
切胶回收后检测
97.0kb
23kb
cI 溶源(lysogenic)：R 复制子 RepA par 裂解(lytic)：162bp pac
二、P1噬菌体载体
人工染色体载体PPT课件
人工染色体载体PPT 课件
目录
• 人工染色体载体概述 • 人工染色体载体的构建 • 人工染色体载体的功能与特性 • 人工染色体载体的应用实例 • 人工染色体载体的未来展望
01
人工染色体载体概述
定义与特点
定义
人工染色体载体是一种通过生物 技术手段构建的染色体，用于基 因治疗、基因克隆和基因组编辑 等领域。
特点
具有可调控的复制子、可选择的 标记基因、可变化的染色体长度 和结构等。
人工染色体载体的应用领域
01
02
03
基因治疗
用于将正常基因导入病变 细胞，替代缺陷基因，治 疗遗传性疾病和癌症等疾 组学和转录组学 研究。
基因组编辑
用于对细胞或生物体的基 因组进行定点、定向的改 造和修饰。
挑战
人工染色体载体的构建和改造需 要较高的技术要求，同时需要解 决基因表达的效率和特异性问题
。
人工染色体载体在基因克隆中的应用
01
基因克隆
人工染色体载体可以用于克隆和保存珍贵的基支持。
02
优势
人工染色体载体具有大容量和高稳定性，能够容纳大型基因组片段，保
拓展应用范围
探索人工染色体在农业、工业和医 学等领域的应用，开发更多具有实 用价值的基因工程产品。
人工染色体载体在其他领域的应用拓展
生物制药
利用人工染色体载体将药物基因导入细胞，实现药物的定点、定 量和定时释放，提高药物的疗效和降低副作用。
生物能源
将人工染色体载体用于基因工程微生物的改造，提高微生物的产氢 、产乙醇等生物能源的产量和效率。
持基因组的完整性。
03
挑战
人工染色体载体的构建需要克服技术难题，如大片段DNA的获取、组
目录
• 人工染色体载体概述 • 人工染色体载体的构建 • 人工染色体载体的功能与特性 • 人工染色体载体的应用实例 • 人工染色体载体的未来展望
01
人工染色体载体概述
定义与特点
定义
人工染色体载体是一种通过生物 技术手段构建的染色体，用于基 因治疗、基因克隆和基因组编辑 等领域。
特点
具有可调控的复制子、可选择的 标记基因、可变化的染色体长度 和结构等。
人工染色体载体的应用领域
01
02
03
基因治疗
用于将正常基因导入病变 细胞，替代缺陷基因，治 疗遗传性疾病和癌症等疾 组学和转录组学 研究。
基因组编辑
用于对细胞或生物体的基 因组进行定点、定向的改 造和修饰。
挑战
人工染色体载体的构建和改造需 要较高的技术要求，同时需要解 决基因表达的效率和特异性问题
。
人工染色体载体在基因克隆中的应用
01
基因克隆
人工染色体载体可以用于克隆和保存珍贵的基支持。
02
优势
人工染色体载体具有大容量和高稳定性，能够容纳大型基因组片段，保
拓展应用范围
探索人工染色体在农业、工业和医 学等领域的应用，开发更多具有实 用价值的基因工程产品。
人工染色体载体在其他领域的应用拓展
生物制药
利用人工染色体载体将药物基因导入细胞，实现药物的定点、定 量和定时释放，提高药物的疗效和降低副作用。
生物能源
将人工染色体载体用于基因工程微生物的改造，提高微生物的产氢 、产乙醇等生物能源的产量和效率。
持基因组的完整性。
03
挑战
人工染色体载体的构建需要克服技术难题，如大片段DNA的获取、组
基因工程载体人工染色体载体XX09
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基因工程载体人工染色体载体XX09
• T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所 以 将 致 瘤 基 因 全 部 缺 失 即 卸 甲 (disarmed) 后，将细菌抗生素的抗性基因或其它序列 插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB 至LB内的序列转移并整合到植物基因组。
• Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的， 毒 性 基 因 可 以 顺 式 及 反 式 两 种 方 式 控 制 TDNA转移。
•◆ YAC可以接受100-1000 kb的外源DNA片 段，这一特点使YAC成为人类基因组计划及 图位克隆分离基因的重要工具，并促进了发 展人类人工染色体(human artificial chromosome，HAC)的研究。
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基因工程载体人工染色体载体XX09
•YAC载体
•正常酵母人工染色体含有： •* 四膜虫端粒（tel) •* 酵母自主复制序列 （ARS) •* 酵母着丝点 (CEN) •* 酵母的选择标记 (TRP1、 URA1)
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基因工程载体人工染色体载体XX09
1） Disarmed Ti vectors
• 去除T-DNA中 的肿瘤基因
• 在T-DNA中插 入用于转化植 株筛选的遗传 标记基因
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基因工程载体人工染色体载体XX09
Intermediate vectors
• A small portion of T-DNA was subcloned in a conventional E.coli plasmid vector (i.e. pBR322) for easy manipulation, producing intermediate vectors
4-人工染色体载体
二、12/14/2构019 建cosmid克隆载体的策略
根据λ噬菌体克隆载体和 质• 粒克隆载体两者 的这些性质，取长去短，设计由质粒和含有cos位 点的这种λDNA片段组装成一类新的克隆载体， 即cosmid克隆载体。
cosmid载体 ---- pHC79
12/14/2019
•
由λDNA片段和pBR322 质粒DNA联合组成的。
pHC79 6400 bp
l fragment cos
第一节 黏粒（cosmid）载体
12/14/2019
黏粒克隆载体 （柯斯质粒载体） 实际上是质粒的衍 生物，是由英文 “ cos site-carrying plasmid”缩写而成 的，其原意是指带 cos位点的质粒。
BamHI A pr •PstI
使用cosmid克隆载体的程序与使用λ噬菌 体克隆载体的程序有所不同 。
12/14作/201为9 λ噬菌体克隆载体，线形重组λDNA分 子两端必须各有一个cos末端•。而cosmid克隆载 体只有一个cos位点，因此必须先对cosmid克隆 载体进行适当处理，构成具有两个cos位点的二 联体线形DNA分子。
λDNA片段除了cos 位点之外，在其两侧还 具有与1噬2/14菌/20体19 包装有关 的DNA短序列；
•
质粒DNA部 分则是一个完整的 复制子。
克隆能力为31～ 45kb，而且能够被包 装成为具有感染性能 的噬菌体颗粒。
三、 cosmid克隆载体的特征
12/14/2019
包括以下4个方面
•
①构建的cosmid克隆载体是一种环形双链 DNA分子，—般在5--7kb。
②cosmid克隆载体具有质粒的性质。
12/c14o/2s0m19 id克隆载体具有质粒的复制子，在大肠 杆菌细胞内按质粒复制的方 式• 进行复制，具有转 化大肠杆菌的功能，并且在氨苄青霉素作用下， 同样也会获得扩增。
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14×106bp 14Mb 具真核mRNA的加工活性
yeast
一、YAC载体的复制元件和标记基因
1.复制必须成分
➢ 复制起点ori，自主复制序列ARS (autonomously replicating sequence)
➢ 着丝粒（CEN） 使染色体(chromosome)在分裂过程中能正确分配 到子细胞中有丝分裂(mitosis)中与纺锤丝 (spindle fiber)联系的那段DNA
4.感染E. coli：线状的重组DNA被注入细胞并通过cos 位点的环化，形成黏粒载体，象质粒(plasmid)一样 复制
在“染色体步查(chromosome walking)”过程 中染色体步查：chromosome walking 采用一段分离自某一重组体一端的非重复 DNA片段作为探针以鉴定含有相邻序列的重 组克隆。
mcs COS
BamHI酶切 CIP去磷酸
连接
包装 感染 铺平板 筛选 阳性克隆
大小：6.8 kb 可容纳35～45 kb的外源DNA片段
组成：含两个cos位点、抗性标记（ampr kanr）、 ori （ColE1复制起点）和4个多克隆位点(MCS)。
三、黏粒克隆载体
1.pJB8
简单黏粒
组成：抗性标记（ampr ）、 ori （ColE1复制起点） 、
cos位点和4个多克隆位点
大小：5.4kb 可容纳33-46.5kb外源DNA片段
➢对载体进行去磷酸化(dephosphorylation)处理， 否则易形成多联载体 ➢定向克隆(directed clone)
2. 混菌保存
混合单菌落，15%甘油，-70 C
生长平衡问题
3. 体内包装
重组缺陷噬菌体超感染，重新包装重组cosmid， 收集裂解混合物，在含少量氯仿 SM(0.3%)溶液中， 4C可贮存几年，或含7%二甲基亚砜(DMSO)ligate)、多个外源插入等问题 已解决 但仍不足以作为常规克隆，不如 噬菌体收获量相差悬殊 5．尽管似乎全面，但也许不能获得目的克隆，限
制酶位点(restriction sites)的非随机分布，污染限制 酶，重组缺失，扩增时目的克隆可能被淘汰。
第二节 酵母人工染色体载体 yeast artificial chromosome
酵母的生物学特征 Saccharomyces cerevisiae 酿洒酵母 扁圆形和卵形 3m 代时90min 16条染色体 30 用噬菌体颗粒感染recA+ E.coli（pUC18∷探针） ④ 发生重组 ⑤ 再次包装 ⑥ 再次感染，宿主为recA- E.coli(ampr, kanr)pWE15四、黏粒的扩增和贮存1. 滤膜影印
25%甘油 TB平板， -70 C
3.克隆与分析组成某一基因家族的真核DNA区段 如哺乳动物珠蛋白基因遍布于至少70 kb的DNA片段 中甚至有数十万个bp（几百kb）
二、黏粒载体的工作原理
1.分离外源DNA片段35～45 kb
2.外源DNA与两个黏粒(cosmid)相连，且cos方向相同
3.体外包装 在噬菌体A蛋白的terminase功能作用下 切割cos位点并将其中的外源DNA包装到成熟的噬 菌体颗粒中去
一般高浓度ATP存在下（5 mmol/L）抑制平端连接， 但对粘端没有影响。 35～45 kb (MobI/经CIP处理)的外源DNA片段与载 体的连接产物，可包装进入噬菌体颗粒，感染大3.pCOS1 E隆38～47 kb片段 包括噬菌体（38～52 kb）
N=ln(1-p)/ln(1-f)
哺乳动物 3x入片段占总 DNA的比值
N=ln(1-0.99)/ln(1-(1.7x104/3x109)Байду номын сангаас8.1x105
第四章 人工染色体载体 artificial chromosome vector
第一节 黏粒载体
一、黏粒(cosmid)的结构特征和用途
1.黏粒实际是质粒(plasmid)的衍生物，带有将DNA包 装到噬菌体颗粒中所需的DNA序列(cos序列)
2.组成：质粒复制起点(replication origin)（colE1）、 抗性标记ampr和cos位点，能象质粒一样转化 (transform)和增殖(multiplication)
从染色体上DNA克隆，亦即与该 DNA一端相邻接的DNA片段一步一步地达到靶DNA序列。
Sau3A1
经连接转化，可得到含已知片断两侧序列 的克隆子，杂交筛选，可进一步得到目标 基因两侧的序列。
Hu, et al., MM, 1992
如果 克隆片段平均大小为40 kb
N=ln(1-0.99)/ln(1-(4.0x104/3x109)=3.45x1中重组体 的数目
2.在单个重组体中克隆和增殖完整的（较大的）真核 基因。 如鸡前2胶原、鼠三氢叶酸还原酶（DHFR）的基 因至少为40kb，要克隆这些片断，需利用黏粒载体。 质粒载体虽可携带大片段，但转化率低。
1．提取的基因组DNA长度小于200 kb 2．提取的总DNA纯度不高，酶解受到抑制，须梯度离
心(gradient centrifugation) 3．无外源DNA，单个cos位点载体 → 5%空，双cos低
得多，charomid 高→ 20% 4．重组质粒(recombinant plasmid)拷贝数差异大，导致
yeast
一、YAC载体的复制元件和标记基因
1.复制必须成分
➢ 复制起点ori，自主复制序列ARS (autonomously replicating sequence)
➢ 着丝粒（CEN） 使染色体(chromosome)在分裂过程中能正确分配 到子细胞中有丝分裂(mitosis)中与纺锤丝 (spindle fiber)联系的那段DNA
4.感染E. coli：线状的重组DNA被注入细胞并通过cos 位点的环化，形成黏粒载体，象质粒(plasmid)一样 复制
在“染色体步查(chromosome walking)”过程 中染色体步查：chromosome walking 采用一段分离自某一重组体一端的非重复 DNA片段作为探针以鉴定含有相邻序列的重 组克隆。
mcs COS
BamHI酶切 CIP去磷酸
连接
包装 感染 铺平板 筛选 阳性克隆
大小：6.8 kb 可容纳35～45 kb的外源DNA片段
组成：含两个cos位点、抗性标记（ampr kanr）、 ori （ColE1复制起点）和4个多克隆位点(MCS)。
三、黏粒克隆载体
1.pJB8
简单黏粒
组成：抗性标记（ampr ）、 ori （ColE1复制起点） 、
cos位点和4个多克隆位点
大小：5.4kb 可容纳33-46.5kb外源DNA片段
➢对载体进行去磷酸化(dephosphorylation)处理， 否则易形成多联载体 ➢定向克隆(directed clone)
2. 混菌保存
混合单菌落，15%甘油，-70 C
生长平衡问题
3. 体内包装
重组缺陷噬菌体超感染，重新包装重组cosmid， 收集裂解混合物，在含少量氯仿 SM(0.3%)溶液中， 4C可贮存几年，或含7%二甲基亚砜(DMSO)ligate)、多个外源插入等问题 已解决 但仍不足以作为常规克隆，不如 噬菌体收获量相差悬殊 5．尽管似乎全面，但也许不能获得目的克隆，限
制酶位点(restriction sites)的非随机分布，污染限制 酶，重组缺失，扩增时目的克隆可能被淘汰。
第二节 酵母人工染色体载体 yeast artificial chromosome
酵母的生物学特征 Saccharomyces cerevisiae 酿洒酵母 扁圆形和卵形 3m 代时90min 16条染色体 30 用噬菌体颗粒感染recA+ E.coli（pUC18∷探针） ④ 发生重组 ⑤ 再次包装 ⑥ 再次感染，宿主为recA- E.coli(ampr, kanr)pWE15四、黏粒的扩增和贮存1. 滤膜影印
25%甘油 TB平板， -70 C
3.克隆与分析组成某一基因家族的真核DNA区段 如哺乳动物珠蛋白基因遍布于至少70 kb的DNA片段 中甚至有数十万个bp（几百kb）
二、黏粒载体的工作原理
1.分离外源DNA片段35～45 kb
2.外源DNA与两个黏粒(cosmid)相连，且cos方向相同
3.体外包装 在噬菌体A蛋白的terminase功能作用下 切割cos位点并将其中的外源DNA包装到成熟的噬 菌体颗粒中去
一般高浓度ATP存在下（5 mmol/L）抑制平端连接， 但对粘端没有影响。 35～45 kb (MobI/经CIP处理)的外源DNA片段与载 体的连接产物，可包装进入噬菌体颗粒，感染大3.pCOS1 E隆38～47 kb片段 包括噬菌体（38～52 kb）
N=ln(1-p)/ln(1-f)
哺乳动物 3x入片段占总 DNA的比值
N=ln(1-0.99)/ln(1-(1.7x104/3x109)Байду номын сангаас8.1x105
第四章 人工染色体载体 artificial chromosome vector
第一节 黏粒载体
一、黏粒(cosmid)的结构特征和用途
1.黏粒实际是质粒(plasmid)的衍生物，带有将DNA包 装到噬菌体颗粒中所需的DNA序列(cos序列)
2.组成：质粒复制起点(replication origin)（colE1）、 抗性标记ampr和cos位点，能象质粒一样转化 (transform)和增殖(multiplication)
从染色体上DNA克隆，亦即与该 DNA一端相邻接的DNA片段一步一步地达到靶DNA序列。
Sau3A1
经连接转化，可得到含已知片断两侧序列 的克隆子，杂交筛选，可进一步得到目标 基因两侧的序列。
Hu, et al., MM, 1992
如果 克隆片段平均大小为40 kb
N=ln(1-0.99)/ln(1-(4.0x104/3x109)=3.45x1中重组体 的数目
2.在单个重组体中克隆和增殖完整的（较大的）真核 基因。 如鸡前2胶原、鼠三氢叶酸还原酶（DHFR）的基 因至少为40kb，要克隆这些片断，需利用黏粒载体。 质粒载体虽可携带大片段，但转化率低。
1．提取的基因组DNA长度小于200 kb 2．提取的总DNA纯度不高，酶解受到抑制，须梯度离
心(gradient centrifugation) 3．无外源DNA，单个cos位点载体 → 5%空，双cos低
得多，charomid 高→ 20% 4．重组质粒(recombinant plasmid)拷贝数差异大，导致