4 人工染色体载体
人造染色体载体是什么？
人造染色体载体是什么？对一些大型染色体组的序列分析往往需要克隆具有数十万甚至上百万个碱基对的DNA片段，为了满足克隆大片段外源基因的需要，科研工作者构建了人造染色体载体，如酵母人工染色体克隆载体、细菌人工染色体克隆载体等。
酵母人工染色载体(YAC)是利用酿酒酵母的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。
酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长的代时为90min。
YAC载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵母中复制的必需元件包括复制起点序列即自主复制序列、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒和两个端粒(TEL)。
YAC载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因。
细菌人工染色体载体(BAC)是基于大肠杆菌的F质粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体。
每个环状DNA分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来源于大肠杆菌F因子(致育因子)的严谨型控制的复制子oriS，一个易于DNA复制的由ATP驱动的解旋酶。
BAC载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生，减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。
新型的BAC载体可以通过α互补的原理筛选含有插入片段的重组子，并设计了用于回收克隆DNA的Not工酶切位点和用于克隆DNA测序的Sp6启动子、T7启动子。
Not Ⅰ识别序列，位点十分稀少。
重组子通过Not Ⅰ消化后，可以得到完整的插入片段。
Sp6、T7是来源于噬菌体的启动子，用于插入片段末端测序。
P1人工染色体载体(PAC)结合了P1载体和BAC载体的最佳特性，包括阳性选择标记sacB及噬菌体P1的质粒复制子和裂解性复制子。
然而除了将连接产物包装进λ噬菌体颗粒以及在cre—loxP位点使用位点特异性重组产生质粒分子以外，在载体连接过程中产生的环状重组PAC也可能用电穿孔的方法导入大肠杆菌中，并且以单拷贝质粒状态维持。
基于PAC的人类基因组文库插入片段的大小在60～150kb之间。
第四章 人工染色体载体
第4章 人工染色体载体黏粒载体 酵母人工染色体载体 细菌人工染色体载体 P1噬菌体载体和P1人工染色体载体表4-1 5种常见高容量克隆载体及其基本特性载体黏粒 P1 PAC BAC YAC容量（kb） 复制子30-45 70-100 130-150 120-300 250-400 ColE1 P1 P1 F ARS宿主拷贝数重组DNA导入 宿主的方式转导 转导 电转化 电转化 转化筛选标记— sacB sacB α-互补 ade2克隆DNA 获取方法 碱抽提大肠杆菌 高 大肠杆菌 1 大肠杆菌 1 大肠杆菌 1 酵母菌 1脉冲场电 泳14.1 黏粒载体4.1.1 黏粒的结构特征和用途o 黏粒（cosmid）是质粒的衍生物，是带有cos序 列的质粒。
cos序列是λ噬菌体DNA中将DNA包装 到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。
o 黏粒的组成包括质粒复制起点（ColE1）、抗性 标记（ampr）、cos位点，因而能像质粒一样转 化和增殖。
o 它的大小一般5-7kb左右，用来克隆大片段 DNA，克隆的最大DNA片段可达45kb。
4.1.2 黏粒载体的 工作原理图4-1 黏粒载体 克隆 DNA的 一般原 理和步 骤24.1.3 黏粒克隆载体1．黏粒pJB8o 大小为5.4kb，由 ampr，ColE1复制 起点（ori）， cos位点，多克隆 位点组成，可容 纳33-46.5kb外源 DNA片段，主要用 来在细菌中克隆 真核DNA。
2．含双cos位点的黏粒载体o c2RB和 Supercos-1是 含双cos位点的 黏粒载体， c2RB大小为 6.8kb，含两个 cos位点，在 cos位点之间有 Kanr（图4-3）。
o 装载容量3346.5kb图4-3 黏粒载体c2RB图谱3图4-4 Supercos-1克隆 的原理和步骤o Supercos-1 大小为 7.94kb，含 有在真核细 胞中起作用 的来自猿猴 病毒SV40的 复制起点 ori-SV40和 新霉素抗性 基因 （neor）。
酵母人工染色体载体
YAC载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵 母中复制的必须元件包括复制起点序列即自主复制序 列、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒（CEN） 和两个端粒（TEL）。这些元件能满足自主复制、染 色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要。
7.HIS3EL)、DNA的复制起点 (ARS)和着丝粒(CEN)，以及必要的选择标记(TRP1等)基 因序列克隆到大肠杆菌质粒pBR322中，获得的重组质粒 就是YAC载体。
常用的YAC载体有3种，即pYAC3、pYAC4和pYAC5， 其差别主要是sup4基因上的克隆位点不同，分别为SnaBI、 EcoRI和NotI位点。
工作原理：
用BamH Ι酶切去除载体上的HIS3顺序，再用EcoR Ι 切开克隆位点，形成YAC的左右两臂，与外源大片段 DNA在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，转 化到酵母细胞后可像染色体一样复制，并随细胞分裂到 子细胞中去，达到克隆大片段DNA的目的。外源DNA 的转载导致抑制基因SUP4插入失活，从而使重组菌形成 红色菌落，而载体自身连接转入到酵母细胞后所形成的 菌落为白色。
酵母人工染色体pYAC4上的基本功能单位有：
1.CEN4顺序，来源于酵母第4号染色 体的着丝粒顺序，它提供酵母着丝 粒正常功能的所有顺式调控信息， 可保证YAC在酵母细胞分裂时向两 极运动；
2.TEL顺序，来源于四膜虫大核中的 rDNA分子的末端，提供端粒形成顺 序，可保证YAC末端不被降解和重 组，且能够稳定地复制；
利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称 为人工染色体载体。其装载外源DNA片段的容量就可以与染色 体的大小媲美。
如酵母人工染色体载体，它将酵母菌染色体上的复制区、 分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当 大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人 造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制 并遗传。
大学基因工程复习归纳重点复习资料
基因工程复习归纳第一章绪论1.基因工程的定义：是指按照人们的愿望，经过严密的设计，将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体/宿主）内，使之按照人们的意愿稳定遗传、并表达出新的性状的技术。
2.基因工程概念的发展：遗传工程→DNA重组技术→分子/基因克隆（Molecular/Gene→基因工程→基因操作。
应用领域以“基因工程”、“DNA重组”为主基因工程基因工程的历史性事件1973：Boyer和Cohen建立DNA重组技术1978：Genetech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素1982：世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素上市1988：PCR技术诞生1989：我国第一个基因工程药物rhIFNα1b上市2003: 世界上第一个基因治疗药物重组腺病毒-p53上市3.基因工程的三大关键元件基因（供体）：外源基因、目的基因载体：能将外源基因带入受体细胞，并能稳定遗传的DNA分子（克隆载体、表达载体）。
宿主（受体）：，能摄取外源DNA、并能使其稳定维持的细胞（组织、器官或个体）。
4.基因工程的基本步骤（切、接、转、增、检（大肠杆菌是中心角色）（1）目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。
（2）重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。
（3）重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。
（4）克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。
（5）目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。
第二章 DNA重组克隆的单元操作一、用于核酸操作的工具酶1.限制性核酸内切酶(主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵)。
限制性核酸内切酶的功能与类型其中II型限制性核酸内切酶：切割位点专一，适于DNA重组，是DNA重组中最常用工具酶。
第四章 人工染色体载体
yeast
一、YAC载体的复制元件和标记基因
1.复制必须成分
➢ 复制起点ori，自主复制序列ARS (autonomously replicating sequence)
➢ 着丝粒（CEN） 使染色体(chromosome)在分裂过程中能正确分配 到子细胞中有丝分裂(mitosis)中与纺锤丝 (spindle fiber)联系的那段DNA
4.感染E. coli：线状的重组DNA被注入细胞并通过cos 位点的环化，形成黏粒载体，象质粒(plasmid)一样 复制
在“染色体步查(chromosome walking)”过程 中染色体步查：chromosome walking 采用一段分离自某一重组体一端的非重复 DNA片段作为探针以鉴定含有相邻序列的重 组克隆。
mcs COS
BamHI酶切 CIP去磷酸
连接
包装 感染 铺平板 筛选 阳性克隆
大小：6.8 kb 可容纳35～45 kb的外源DNA片段
组成：含两个cos位点、抗性标记（ampr kanr）、 ori （ColE1复制起点）和4个多克隆位点(MCS)。
三、黏粒克隆载体
1.pJB8
简单黏粒
组成：抗性标记（ampr ）、 ori （ColE1复制起点） 、
cos位点和4个多克隆位点
大小：5.4kb 可容纳33-46.5kb外源DNA片段
➢对载体进行去磷酸化(dephosphorylation)处理， 否则易形成多联载体 ➢定向克隆(directed clone)
2. 混菌保存
混合单菌落，15%甘油，-70 C
生长平衡问题
3. 体内包装
人工染色体克隆载体
人工染色体克隆载体：是一种“穿梭”载体，含有质立载体所必备的第一受体内原质立复制起始位点，还含有第二受体染色体DNA着丝点、端粒和复制起始点的序列，以及合速的选择标记基因。
固体发酵：某些微生物升长需水很上少，可利用疏松而含有必需营养物的固体培养基进行发酵生产。
蛋白质工程：基因工程的基础上，结合蛋白质结晶学计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识，通过对基因的人工定向改造等手段，从而达到对蛋白质进行修饰改造拼接以生产能满足人类需要的新型蛋白质技术。
DNA疫苗：是利用可隆于载体上的抗原基因直接注射机体，被细胞摄取并在细胞内表达相应的抗原，通过不同途径诱导机体的特异免疫应答。
人工种子：它是一种含有植物胚状体或芽营养成分激素以及其他成分的人工胶囊。
发酵工程：利用微生物生长速度快生长条件简单以及代谢过程特殊等特点，再合适条件下，通过现代化工程技术手段，由微生物的某中特定功能生产出人类所需的产品。
生物传感器：是用生物活性物质做敏感器件，配以适当的换能器所构成的分析工具。
载体：把能够承载外源基因，并将其带人受体细胞得以稳定维持的DNA分子。
胚胎移植：是由产生胚胎的供体和养育胚胎的受体分工合作共同繁殖后代。
基因治疗：是利用遗传学的原理治疗人类的疾病。
细胞融合：两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并染色体等遗传物质重组的过程。
花药培养：经过适当的诱导，花粉囊中的花粉可能去分化而发育成单倍体胚或愈伤组织，最终生产花粉植株。
原生质的融合概念：从同一个种或不同种分离得到的原生质体在适当的条件下融合得到细胞核物质和细胞质物质的混和。
固定化酶：指经物理或化学的方法处理,使酶变成不易随水流失即运动受限制,而又能发挥催化作用的酶制剂.基因克隆；是指在分子(DNA)水平上开展研究工作以获得大量的相同基因及其表达产物。
⊙生物技术有基因工程细胞工程酶工程发酵工程蛋白质工程基因工程包括目的基因分离与可隆载体重组转人受体细胞筛选和鉴定可隆子。
基因工程载体人工染色体载体
I
A
A
GTCACGTG
II 78-86bp
III
T TGTTTCTGNTTTCCGAAA
基因工程载体人工染色体载体
（2）端粒（TEL） 两个端粒序列Tel。 酵母端粒保守序列是(G4T2)n 重复序列。
（3）复制起点（ORI）
约100bp的自主复制序列（ARS）。 （真核生物中只有酵母菌有ARS）
基因工程载体人工染色体载体
• T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所 以 将 致 瘤 基 因 全 部 缺 失 即 卸 甲 (disarmed) 后，将细菌抗生素的抗性基因或其它序列 插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB 至LB内的序列转移并整合到植物基因组。
• Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的， 毒 性 基 因 可 以 顺 式 及 反 式 两 种 方 式 控 制 TDNA转移。
基因工程载体人工染色体载体
Triparental mating
• An E.coli strain A carrying a helper plasmid able to mobilize the intermediate vector in trans
• The E.coli strain B carrying the recombinant intermediate vector
基因工程载体人工染色体载体
基因工程载体人工染色体载体
Structure of a bacterial artificial chromosome (BAC), used for cloning large fragments of donor DNA. CMR is a selectable marker for chloramphenicol resistance. oriS, repE, parA, and parB are F genes for replication and regulation of copy number. cosN is the cos site from l phage. HindIII and BamHI are cloning sites at which foreign DNA is inserted. The two promoters are for transcribing the inserted fragment. The NotI sites are used for cutting out the inserted fragment.
人工染色体载体名词解释
人工染色体载体名词解释
人工染色体载体是一种带有特定功能的DNA分子，用于在实验室中携带和传递外源基因或其他遗传物质。
它是通过基因工程技术构建的，通常由一段核酸序列组成，包括宿主微生物所需的基本元素，如起始子、启动子、终止子以及复制和稳定性元件。
人工染色体载体可以在细胞中自主复制和传递，并能够稳定地继承和表达携带的外源基因。
不同类型的人工染色体载体具有不同的设计目的和特点，可以用于基因治疗、基因组编辑、产生转基因动物、研究基因组功能等领域。
酵母人工染色体载体
工作原理：
用BamH Ι酶切去除载体上的HIS3顺序，再用EcoR Ι切 开克隆位点，形成YAC的左右两臂，与外源大片段DNA在 该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，转化到酵母 细胞后可像染色体一样复制，并随细胞分裂到子细胞中去， 达到克隆大片段DNA的目的。外源DNA的转载导致抑制 基因SUP4插入失活，从而使重组菌形成红色菌落，而载体 自身连接转入到酵母细胞后所形成的菌落为白色。
酵母人工染色体pYAC4上的基本功能单位有：
1.CEN4顺序，来源于酵母第4号染色 体的着丝粒顺序，它提供酵母着丝粒 正常功能的所有顺式调控信息，可保 证YAC在酵母细胞分裂时向两极运动；
2.TEL顺序，来源于四膜虫大核中的 rDNA分子的末端，提供端粒形成顺 序，可保证YAC末端不被降解和重组， 且能够稳定地复制；
7.HIS3顺序。
酵母人工染色体载体的构建：
将酵母染色体DNA的端粒(TEL)、DNA的复制起点 (ARS)和着丝粒(CEN)，以及必要的选择标记(TRP1等)基因 序列克隆到大肠杆菌质粒pBR322中，获得的重组质粒就是 YAC载体。
常用的YAC载体有3种，即pYAC3、pYAC4和pYAC5， 其差别主要是sup4基因上的克隆位点不同，分别为SnaBI、 EcoRI和NotI位点。
优缺点
概念
酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome,YAC) 是利用酿酒酵母染色体的复制元件构建的载体，是最早 构建成功的人工染色体载体，其工作环境也是在酿酒酵 母中。
酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长代时为90min， 含16条染色体，其大小为225~1900kb，总计有14×106bp。
1.YAC载体在酵母中复制的必需元件包括：
人工染色体载体的研究和应用
】 。 述 ・
基 因 【 技 术 的 迅 速 发 埏 ，他 人 类 埘 ： 体 基 冈 的 结 Ｉ 物 卡 功 能 、 达及 其 捌拧 的 研 究 深 入 钊 分 子水 平 。而对 特 定 基 勾、 表 片段 的分 离和 获 ， ｌ 【 足上 述研 究 的筛 选 和 扶 得 均 为 可能 因 使 Ａ 此， 艇 纽 丈库 是 进 行 分 子兜 隆 和 基冈 组 结 构 功 能 研 究 的 撼 础 ： ０年 代 人 们 就 已提 …臧 阏 组 文 库 的概 念 Ｉ １ ７ ７ ９８ ．
隆 效 率 有 ｒ很 大 改 善 。 所 谓 人 ｌ染 色体 ． 指 一 类 能 在 生 物 细 胞 叶 独 立 、 定 ｒ 是 １ 稳 仔 往 和 遗传 的人 丁晕 组 Ｄ Ａ分 子， 至 少 应 具染 色 体 系 统 ， 哺 乳 动 物 人 Ｔ 染 色 体 ｆ ｍｍ ｌ ｎ ａ ｉｃａ ｍａ ａｉ ｒｆ ｉ ａ ｔ ｉ ｌ ｃ ｒｍ ｓ ｍ ， Ｃ ， 大 能 容 纳 ２ ０ ｋ ｈｏ ｏ ｏ ｅ ＭＡ ）最 ０ ０ ｐ的外 源 Ｄ Ａ， 以携 Ｎ 可 带 足 够 长 的 包 括 编码 顺 序 和 可 以 有 效 调 控 治 疗 基 因 表达 的
得 多种 类 型 ＨＡＣ 。ＨＡＣ ｓ ｓ可 以携 带 大 片段 基 因 组 ＤＮＡ， 建 是 立 转 基 因动 物 模 型 的重 要 手 段 ， 基 因 治疗 方 面 也 有 着 广 阔 在 的应 用 前 景 为 方 便 从 各 种 文 库 筛 选 到 的 一 新 基 进 行 功 能 研 究
什 的 类 似组 份 ：复 制 原 点 ｆ ｉｉ ｏ ｐｉ ｔｎ 、着 丝 ｃｎ ｏ ｇｎ ｆｅ ｌａｉ １ ｒ ｒ ｃ ｏ ￣（ — ｅ ｔ ｍ ｒ）Ｈ 粒 ＂ｅｍｅｅ。 ｌ８ ｒ ｅｅ￣ 端 ｏ ｆｔｈ ｌ ） ９ ３年 ， ｒ Ｉ 酵 母 染 色体 的 （ ｒ Ｍｕｒ ｙ１ 把
人工染色体载体PPT课件
目录
• 人工染色体载体概述 • 人工染色体载体的构建 • 人工染色体载体的功能与特性 • 人工染色体载体的应用实例 • 人工染色体载体的未来展望
01
人工染色体载体概述
定义与特点
定义
人工染色体载体是一种通过生物 技术手段构建的染色体，用于基 因治疗、基因克隆和基因组编辑 等领域。
特点
具有可调控的复制子、可选择的 标记基因、可变化的染色体长度 和结构等。
人工染色体载体的应用领域
01
02
03
基因治疗
用于将正常基因导入病变 细胞，替代缺陷基因，治 疗遗传性疾病和癌症等疾 组学和转录组学 研究。
基因组编辑
用于对细胞或生物体的基 因组进行定点、定向的改 造和修饰。
挑战
人工染色体载体的构建和改造需 要较高的技术要求，同时需要解 决基因表达的效率和特异性问题
。
人工染色体载体在基因克隆中的应用
01
基因克隆
人工染色体载体可以用于克隆和保存珍贵的基支持。
02
优势
人工染色体载体具有大容量和高稳定性，能够容纳大型基因组片段，保
拓展应用范围
探索人工染色体在农业、工业和医 学等领域的应用，开发更多具有实 用价值的基因工程产品。
人工染色体载体在其他领域的应用拓展
生物制药
利用人工染色体载体将药物基因导入细胞，实现药物的定点、定 量和定时释放，提高药物的疗效和降低副作用。
生物能源
将人工染色体载体用于基因工程微生物的改造，提高微生物的产氢 、产乙醇等生物能源的产量和效率。
持基因组的完整性。
03
挑战
人工染色体载体的构建需要克服技术难题，如大片段DNA的获取、组
第九章 基因克隆载体
接合型质粒（传递性质粒） 非接合型质粒
严密型质粒（stringent plasmid)
严密型质粒通常是一些具有自身传递能力的大质粒，复制与 宿主菌密切相关，宿主菌内只有1-2个质粒拷贝存在，当宿主 菌蛋白合成停止时，质粒的DNA复制也就随之停止
松弛型质粒 (relaxed plasmid)
第九章 基因克隆载体
第一节
概述
1、载体
要把一个有用的基因通过基因工程手段送进生物细胞中， 需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫
载体（Vector）。
（1）质粒 （2）噬菌体 （3）质粒-噬菌体杂合载体 （4）人工染色体载体
2、载体的性质
1）它必须具有能够在某些宿主细胞中独立地自我复制和表达的能 力。
pJDB 219
选用哪种类型的真菌质粒？
转化频率 YEps：103—105 YIps：1-10 转化子的稳定性 YEps：不稳定 YIps：稳定
第三节 噬菌体载体
噬菌体的研究历史，是同 分子生物学、分子遗传学的创 立和发展过程密切相关的。DNA 复制机理的阐明、转录的终止 作用、连接酶和解旋酶的发现 、位点特异的重组作用、SOS修 复机制等，均是以噬菌体为材 料取得的重要研究成果。依据 噬菌体的复制和生活周期等特 点，已经构建了许多料。
•7
三、质粒在基因工程中的应用优点 ①体积小，便于DNA的分离和操作； ②呈环状，使其化学分离过程中能保持性能稳定； ③有不受核基因组控制的独立复制起始点； ④拷贝数多，使外源DNA 可很快扩增； ⑤存在抗药性基因等选择性标记，便于含质粒克
隆的检出和选择（如E.coli 的pBR322质粒）。
四、质粒的分离与鉴定 分离：细胞的裂解、蛋白质和RNA去除以及质粒 DNA与染色体DNA分离。 鉴定：电镜、琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳及密 度梯度离心法。
2.3 基因工程载体-人工染色体载体 201209
植物Ti质粒载体
（1）T-DNA区（transferred-DNA regions） T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒 上导入植物细胞的一段DNA。
T-DNA两端各有一段25bp的重复序列(LB, RB)。 T-DNA携带的致瘤基因是一些与激素合成有关的基 因，由于激素合成基因使细胞处于不停的分裂状态， 形成冠瘿瘤，不能进行细胞分化。 Ti质粒改造后才能应用于植物的基因工程。 保留 T-DNA两端的末端序列，然后用外源DNA插入或直 接取代野生型T-DNA的部分基因，使转化的植物细 胞不具有成瘤能力。
3、PAC载体
二、植物载体
Plant cloning vectors
• Ti质粒:侵染广泛的双子叶植物 • T-DNA或T-区(T-region)：约20kb，包含专化冠瘿碱生化 合成和冠瘿瘤生长的基因，随机地整合到植物染色体上。 • 结构特点：两端具有25个碱基对的顺向重复序列，但重复 不是完全的。25个碱基对的序列称为T-DNA的边界序列(TDNA border sequence)。去除右边界序列，将使T-DNA失 去转移和整合的功能；左边界的缺失，对致瘤性无明显影 响。 • 毒性区域即vir(virulence)区域:引起T-DNA转移的区域。 长度约35kb，和T-DNA处于不同位臵
◆ BAC载体是基于细菌的性因子(F因子)质粒的 一些特点构建的。F因子在细菌接合时转移1Mb 的细菌染色体片段。将F因子经基因工程改良构 成的BAC载体，可用于克隆100 kb以上的DNA 片段。 ◆带有外源片段的BAC载体在细菌细胞中通常仅 单个拷贝，这一特点有利于保持DNA大分子，在 细胞内稳定复制而不发生重组。BAC载体本身分 子量小，具有氯霉素抗性选择基因及多克隆位 点。
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YAC具有自主复制序
列、克隆位点以及可在细菌
TRP1
pYAC4
Apr 和酵母菌中选择的标记基因。
URA3
此外，YAC还具有酵母菌染
色体的一些特点。可以接受 100-1000kb的外源DNA片段。
2013-7-18
ori TEL BamHI TEL
32
第二节 酵母人工染色体载体
这种人工染色体克隆载 体实际上是一种“穿梭”克 隆载体，含有质粒克隆载体 所必备的第一受体(大肠杆 菌)源质粒复制起始位点 TRP1 ARS1
DNA分子，—般在5--7kb。
②cosmid克隆载体具有质粒的性质。
cosmid克隆载体具有质粒的复制子，在大肠
杆菌细胞内按质粒复制的方式进行复制，具有转
化大肠杆菌的功能，并且在氨苄青霉素作用下，
同样也会获得扩增。
cosmid克隆载体通常也具抗菌素抗性基因， 作为重组体分子表型选择标记。其中有一些还带
质，可以按一般质粒克隆载体进行操作，转
化受体细胞，可在受体细胞内进行自行复制。
实际上，使用cosmid克隆载体主要利用它 的λ噬菌体克隆载体性质。
因为cosmid克隆载体含有cos位点，可
承载大的DNA片段，进行体外包装后能高
效率转导受体细胞 。
使用cosmid克隆载体的程序与使用λ噬菌 体克隆载体的程序有所不同 。
cos
5
考斯质粒（cosmid）= 质粒+ cos序列。
BamHI
它是用正常的质粒同λ
Apr
PstI
Tcr SalI
噬菌体的cos位点构成。
cos序列是l噬菌体
pHC79 6400 bp ori l fragment
DNA 中将DNA包装到噬 菌体颗粒中所需的DNA
序列。
cos
2013-7-18
pYAC4
EcoRI
CEN4
EcoRI
EcoRI EcoRI
URA3
BamHI
连
接
ori
TEL BamHI TEL
重组酵母染色体
转化酵母菌
2013-7-18
38
（红色，赤红色）
此克隆载体的sup4(抑制基因：抑制赭色
表型 )基因上，组装了供插入外源DNA片段
Байду номын сангаас
的克隆位。
常用的YAC克隆载体有3种：
pYAC3、pYAC4和pYAC5。 差别： 在sup4基因上的克隆位点不同，分别是
BamHI和EcoRI切割末端的两个DNA片段(双臂)，
随后把两端具EcoRI切割末端的外源DNA与此双
臂连接，构成酵母人工染色体。用电激仪把此人 工染色体转化酵母受体细胞。 在成功构建pYAC4克隆载体的基础上，进一 步构建了人类人工染色体(HAC)克隆载体和哺乳 动物人工染色体(MAC)克隆载体。
DNA连接酶
成为可用于体外包装的样品
不管是(a)程序还是(b)程序，最后获得的重 组线形DNA分子必须保留质粒的复制起始位点 (ori)和选择标记基因，保证重组的线形DNA分
子导入受体细胞后，cos末端自行连接环化，按
质粒的性质进行自主复制，并且有效地表达选
择标记基因的产物，供筛选阳性克隆子。
后，转化第二受体细胞，可在转化的细胞内
按染色体DNA复制的形式进行复制和传递。
筛选第一受体的克隆子，一般采用抗菌素
抗性选择标记；
筛选第二受体的克隆子，常用与受体互补
的营养缺陷型。
人工染色体克隆载体的特点： 能容纳长达1000 kb甚至3000 kb的外源 DNA片段。
人工酵母染色体克隆载体的构建
二、 构建cosmid克隆载体的策略
根据λ噬菌体克隆载体和质粒克隆载体两者
的这些性质，取长去短，设计由质粒和含有cos位
点的这种λDNA片段组装成一类新的克隆载体， 即cosmid克隆载体。
由λDNA片段和pBR322 质粒DNA联合组成的。
cosmid 载 体 ---- pHC79
pBR322质粒(p43)
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第一节
黏粒（cosmid）载体
Apr PstI BamHI
1978年J.Collins和
B.Hohn等人发明
构建1.8 kb的l-DNA
片段 + pBR322片段
ori pHC79 6400 bp
Tcr SalI
装载范围为31 - 45
kb。
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l fragment
作为λ噬菌体克隆载体，线形重组λDNA分 子两端必须各有一个cos末端。而cosmid克隆载 体只有一个cos位点，因此必须先对cosmid克隆 载体进行适当处理，构成具有两个cos位点的二 联体线形DNA分子。
当外源DNA片段组入二联体线形DNA分子，
并且两个cos位点之间的DNA核苷酸序列达到足
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用λ噬菌体基因组的cro—rⅡ的BglⅡ限制
片段，取代pBR322质粒DNA的位于1 459～1
666bp之间的Sau3A片段，产生出具有BglⅡ单
切割位点的重组体分子。 然后通过这个位点，将带有cos序列、长度 为1.78kb的λDNA之BglⅡ片段插入进去，于是
得到了pHC79柯斯质粒.
五、 cosmid克隆载体（自学P72）
常用的粘性粒有PHC79、PJB8、MUA-3和 KOSI等，它们大多具有一种或多种限制性
内切酶的单一酶切位点。采用这种大容筛选时的
阳性检出率，而且极其适合高等真核基因
的克隆工作。
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TRP1
Apr ori
pYAC
酵母染色体的着丝粒序列
酵母系统的选择标记
URA3
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大肠杆菌的复制子标记
YAC载体的装载量为
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TEL BamHI TEL 250 - 400 kb
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这样的克隆载体在第一受体细胞内可以按
质粒复制形式进行高拷贝复制。
这种克隆载体在体外与目的DNA片段重组
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⑤在两个末端序列中间，有
一段填充序列(HIS3)，以
便pYAC4在细菌细胞中稳 定扩增； ⑥Amp抗性及细菌质粒复制 原点；
⑦一个EcoRⅠ克隆位点，该
位点位于酵母菌Sup4
tRNA基因内。
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克隆载体 pYAC4
pYAC4使用程序：
首先用EcoRI和BamHI双酶切割，获得均具
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人工染色体载体:
利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复 制的载体称为人工染色体载体。
模拟染色体的复制方式，因此都能装载大片 段的DNA片段。
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目前常用的人造染色体载体包括：
细菌人工染色体载体（BAC） 酵母人工染色体载体（YAC） 黏粒载体（ cosmid ） P1人工染色体载体（PAC）
选择标记--Sup4
Sup4基因编码赭色抑制Trp-tRNA，抑制赭色
表型(成为白色)。
不含外源DNA片段的pYAC4载体转化酵母菌， 转化子的菌落呈白色。 带有插入的外源DNA片段的pYAC4重组载体， 其Sup4已经失活，结果转化酵母菌后所产生
的转化子形成的自身连接，从而导致效率降低
或者失败。
载体自身只相当于可以插入片段的1/10左右，
因此往往会出现载体同载体自身连接，结果
在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连
在一起。但用碱性磷酸酶处理，可阻止载体 分子自身连接；
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②大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子。 结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一
菌体容许包装的量计算，能承载的外源DNA片段
最大可达44.5 kb(即51 kb～6.5 kb)，最小的也有 29.9kb(即36.4kb～6.5kb)，所以用这样的cosmid 克隆载体能克隆40kb左右的外源DNA片段。
四、cosmid克隆载体的工作原理
cosmid克隆载体具有质粒克隆载体的性
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一、黏粒的结构特征和用途
黏粒它的大小一般 5-7kb 左
右，用来克隆大片段 DNA。 克隆的最大 DNA 片段可达
Apr BamHI PstI Tcr SalI
45kb。
①质粒复制起点（colE1） 象
pHC79 6400 bp ori cos
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质粒一样转化和增殖。
②抗性标记Ampr 。 ③ cos位点。有的粘粒载体含
YAC(酵母人工染色体)克隆载体是最早构建
成功的人工染色体克隆载体。
将酵母染色体DNA的端粒(TEL)、DNA复制 起点 (ARS)和着丝粒(CEN)以及必要的选择标记
(HISA4和TRPl)基因序列克隆到大肠杆菌质粒
pBR322中，构建成YCA克隆载体。
二、YAC载体的工作原理
ARS1
TRP1 Apr
个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出30～
45kb的外源DNA插入载体DNA，此时，每个载体只可能 插入一个外源片段，因为如果二个片段，则将超过包装 成噬菌体颗粒的限度；
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③细菌的菌落体积远大于菌落很费时间。
够长时，两个cos位点可被A蛋白切割，产生具 有两个cos末端的重组λDNA分子，就能进行有 效的体外包装。
使用cosmid克隆载体的基本程序是：
先用一种限制性核酸内切酶切割cosmid克隆载体
DNA连接酶
具有两个cos位点的二联体线形DNA分子
限制性核酸内切酶
切割二联体线形DNA分子和部分切割待克隆的外源DNA片段