4 人工染色体载体

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第一节

黏粒（cosmid）载体
Apr PstI BamHI
1978年J.CollLeabharlann Baiduns和
B.Hohn等人发明
构建1.8 kb的l-DNA
片段 + pBR322片段
ori pHC79 6400 bp
Tcr SalI
装载范围为31 - 45
kb。
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l fragment
pYAC4
EcoRI
CEN4
EcoRI
EcoRI EcoRI
URA3
BamHI
连
接
ori
TEL BamHI TEL
重组酵母染色体
转化酵母菌
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（红色，赤红色）
此克隆载体的sup4(抑制基因：抑制赭色
表型 )基因上，组装了供插入外源DNA片段
的克隆位。
常用的YAC克隆载体有3种：
pYAC3、pYAC4和pYAC5。 差别： 在sup4基因上的克隆位点不同，分别是
现虽建立了高密度菌落筛选法，但由于柯斯
质粒制成的基因文库常常不太稳定，插入的大
片段外源DNA有可能通过同宿主基因组交换而
致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体。
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第二节 酵母人工染色体载体
酵母人工染色体(yeast
artificial chromosome， YAC)是一类酵母穿梭载体。 ARS1 EcoRI CEN4
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一、黏粒的结构特征和用途
黏粒它的大小一般 5-7kb 左
右，用来克隆大片段 DNA。 克隆的最大 DNA 片段可达
Apr BamHI PstI Tcr SalI
45kb。
①质粒复制起点（colE1） 象
pHC79 6400 bp ori cos
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质粒一样转化和增殖。
②抗性标记Ampr 。 ③ cos位点。有的粘粒载体含
cos
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第一节
黏粒克隆载体
黏粒（cosmid）载体
Apr
（柯斯质粒载体）
实际上是质粒的衍 生物，是由英文 “ cos site-carrying plasmid”缩写而成
PstI
BamHI
Tcr SalI
pHC79 6400 bp ori
的，其原意是指带
cos位点的质粒。
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l fragment
YAC(酵母人工染色体)克隆载体是最早构建
成功的人工染色体克隆载体。
将酵母染色体DNA的端粒(TEL)、DNA复制 起点 (ARS)和着丝粒(CEN)以及必要的选择标记
(HISA4和TRPl)基因序列克隆到大肠杆菌质粒
pBR322中，构建成YCA克隆载体。
二、YAC载体的工作原理
ARS1
TRP1 Apr
六、 构建cosmid文库应注意哪些问题

①载体分子的自身连接，从而导致效率降低
或者失败。
载体自身只相当于可以插入片段的1/10左右，
因此往往会出现载体同载体自身连接，结果
在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连
在一起。但用碱性磷酸酶处理，可阻止载体 分子自身连接；
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②大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子。 结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一
作为λ噬菌体克隆载体，线形重组λDNA分 子两端必须各有一个cos末端。而cosmid克隆载 体只有一个cos位点，因此必须先对cosmid克隆 载体进行适当处理，构成具有两个cos位点的二 联体线形DNA分子。
当外源DNA片段组入二联体线形DNA分子，
并且两个cos位点之间的DNA核苷酸序列达到足
λDNA片段除了cos 位点之外，在其两侧还 具有与噬菌体包装有关 的DNA短序列； 质粒DNA部 分则是一个完整的 复制子。 克隆能力为31～ 45kb，而且能够被包 装成为具有感染性能 的噬菌体颗粒。
三、 cosmid克隆载体的特征
包括以下4个方面 ①构建的cosmid克隆载体是一种环形双链
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用λ噬菌体基因组的cro—rⅡ的BglⅡ限制
片段，取代pBR322质粒DNA的位于1 459～1
666bp之间的Sau3A片段，产生出具有BglⅡ单
切割位点的重组体分子。 然后通过这个位点，将带有cos序列、长度 为1.78kb的λDNA之BglⅡ片段插入进去，于是
得到了pHC79柯斯质粒.
TRP1
Apr ori
pYAC
酵母染色体的着丝粒序列
酵母系统的选择标记
URA3
4
大肠杆菌的复制子标记
YAC载体的装载量为
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TEL BamHI TEL 250 - 400 kb
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这样的克隆载体在第一受体细胞内可以按
质粒复制形式进行高拷贝复制。
这种克隆载体在体外与目的DNA片段重组
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l fragmen
有2个cos位点。
一、黏粒的结构特征和用途

能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受
体细胞；

能像质粒那样在受体细胞中自主复制； 重组操作简便，筛选容易； 装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小 范围； 不能体内包装，不裂解受体细胞。
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选择标记--Sup4

Sup4基因编码赭色抑制Trp-tRNA，抑制赭色
表型(成为白色)。

不含外源DNA片段的pYAC4载体转化酵母菌， 转化子的菌落呈白色。 带有插入的外源DNA片段的pYAC4重组载体， 其Sup4已经失活，结果转化酵母菌后所产生

的转化子形成赭色菌落。
DNA分子，—般在5--7kb。
②cosmid克隆载体具有质粒的性质。
cosmid克隆载体具有质粒的复制子，在大肠
杆菌细胞内按质粒复制的方式进行复制，具有转
化大肠杆菌的功能，并且在氨苄青霉素作用下，
同样也会获得扩增。
cosmid克隆载体通常也具抗菌素抗性基因， 作为重组体分子表型选择标记。其中有一些还带
cos
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考斯质粒（cosmid）= 质粒+ cos序列。
BamHI
它是用正常的质粒同λ
Apr
PstI
Tcr SalI
噬菌体的cos位点构成。

cos序列是l噬菌体
pHC79 6400 bp ori l fragment
DNA 中将DNA包装到噬 菌体颗粒中所需的DNA
序列。
cos
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SnaBI、EcoRI和NotI。
YAC载体--pYAC4

主要结构：
因，URA3和TRP1(色氨酸合成基 因)；
①两个可在酵母菌中利用的选择基
②酵母菌着丝粒序列
(centromere4,CEN4)；
③一个自主复制序列(ARS1)； ④两个来自嗜热四膜虫
(Tetrahymenna thermophilp)的 末端重复序列(TEL)，以保持重 组YAC为线状结构； 2013-7-18
上基因插入失活的克隆位点。
③具有λ噬菌体的特性。在此克隆载体上含有一
个cos位点。
cosmid克隆载体在克隆了合适长度的外源 DNA，并在体外包装成噬菌体颗粒之后，可以
高效地转导对λ噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。
进入寄主细胞之后的cosmid克隆载体DNA
分子，便按照λ噬菌体DNA同样的方式环化起
二、 构建cosmid克隆载体的策略
根据λ噬菌体克隆载体和质粒克隆载体两者
的这些性质，取长去短，设计由质粒和含有cos位
点的这种λDNA片段组装成一类新的克隆载体， 即cosmid克隆载体。
由λDNA片段和pBR322 质粒DNA联合组成的。
cosmid 载 体 ---- pHC79
pBR322质粒(p43)
后，转化第二受体细胞，可在转化的细胞内
按染色体DNA复制的形式进行复制和传递。
筛选第一受体的克隆子，一般采用抗菌素
抗性选择标记；
筛选第二受体的克隆子，常用与受体互补
的营养缺陷型。
人工染色体克隆载体的特点： 能容纳长达1000 kb甚至3000 kb的外源 DNA片段。
人工酵母染色体克隆载体的构建
BamHI和EcoRI切割末端的两个DNA片段(双臂)，
随后把两端具EcoRI切割末端的外源DNA与此双
臂连接，构成酵母人工染色体。用电激仪把此人 工染色体转化酵母受体细胞。 在成功构建pYAC4克隆载体的基础上，进一 步构建了人类人工染色体(HAC)克隆载体和哺乳 动物人工染色体(MAC)克隆载体。
五、 cosmid克隆载体（自学P72）

常用的粘性粒有PHC79、PJB8、MUA-3和 KOSI等，它们大多具有一种或多种限制性
内切酶的单一酶切位点。采用这种大容量
载体不仅可减少构建基因组DNA文库的重
组克隆数目，减少工作量，提高筛选时的
阳性检出率，而且极其适合高等真核基因
的克隆工作。
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够长时，两个cos位点可被A蛋白切割，产生具 有两个cos末端的重组λDNA分子，就能进行有 效的体外包装。
使用cosmid克隆载体的基本程序是：
先用一种限制性核酸内切酶切割cosmid克隆载体
DNA连接酶
具有两个cos位点的二联体线形DNA分子
限制性核酸内切酶
切割二联体线形DNA分子和部分切割待克隆的外源DNA片段
菌体容许包装的量计算，能承载的外源DNA片段
最大可达44.5 kb(即51 kb～6.5 kb)，最小的也有 29.9kb(即36.4kb～6.5kb)，所以用这样的cosmid 克隆载体能克隆40kb左右的外源DNA片段。
四、cosmid克隆载体的工作原理
cosmid克隆载体具有质粒克隆载体的性
个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出30～
45kb的外源DNA插入载体DNA，此时，每个载体只可能 插入一个外源片段，因为如果二个片段，则将超过包装 成噬菌体颗粒的限度；
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③细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯
斯质粒制备基因文库，则筛选所需的含某一
DNA片段的菌落很费时间。
质，可以按一般质粒克隆载体进行操作，转
化受体细胞，可在受体细胞内进行自行复制。
实际上，使用cosmid克隆载体主要利用它 的λ噬菌体克隆载体性质。
因为cosmid克隆载体含有cos位点，可
承载大的DNA片段，进行体外包装后能高
效率转导受体细胞 。
使用cosmid克隆载体的程序与使用λ噬菌 体克隆载体的程序有所不同 。
来。 但由于cosmid克隆载体并不含有λ噬菌体的全 部必要基因，因此它不能通过溶菌周期，无 法形成子代噬菌体颗粒。 外源片段克隆在黏粒载体中是以大肠杆菌菌 落的形式表现出来的，而不是噬菌斑。
④构建的cosmid克隆载体较小，因此能承载比较 大的外源DNA片段。 如果cosmid克隆载体的大小为6.5 kb，按入噬
DNA连接酶
成为可用于体外包装的样品
不管是(a)程序还是(b)程序，最后获得的重 组线形DNA分子必须保留质粒的复制起始位点 (ori)和选择标记基因，保证重组的线形DNA分
子导入受体细胞后，cos末端自行连接环化，按
质粒的性质进行自主复制，并且有效地表达选
择标记基因的产物，供筛选阳性克隆子。
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人工染色体载体:
利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复 制的载体称为人工染色体载体。
模拟染色体的复制方式，因此都能装载大片 段的DNA片段。
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目前常用的人造染色体载体包括：
细菌人工染色体载体（BAC） 酵母人工染色体载体（YAC） 黏粒载体（ cosmid ） P1人工染色体载体（PAC）
YAC具有自主复制序
列、克隆位点以及可在细菌
TRP1
pYAC4
Apr 和酵母菌中选择的标记基因。
URA3
此外，YAC还具有酵母菌染
色体的一些特点。可以接受 100-1000kb的外源DNA片段。
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ori TEL BamHI TEL
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第二节 酵母人工染色体载体
这种人工染色体克隆载 体实际上是一种“穿梭”克 隆载体，含有质粒克隆载体 所必备的第一受体(大肠杆 菌)源质粒复制起始位点 TRP1 ARS1
EcoRI CEN4
Apr
pYAC4
URA3
(ori)，还含有第二受体(如
酵母菌)染色体DNA着丝点、 端粒和复制起始位点的序列， ori TEL BamHI TEL
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以及合适的选择标记基因。
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一、YAC载体的复制元件和标志基因
YAC载体应含有下列元件：
ARS1 酵母染色体的端粒序列 酵母染色体的复制子 EcoRI CEN4
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⑤在两个末端序列中间，有
一段填充序列(HIS3)，以
便pYAC4在细菌细胞中稳 定扩增； ⑥Amp抗性及细菌质粒复制 原点；
⑦一个EcoRⅠ克隆位点，该
位点位于酵母菌Sup4
tRNA基因内。
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克隆载体 pYAC4
pYAC4使用程序：
首先用EcoRI和BamHI双酶切割，获得均具