基因工程课程小结

第一章绪论

基因工程概念：按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，有目的地改造生物种性。，使现有的物种在较短时间内趋于完善，创造出更符合人们需求的新的生物类型。（又称遗传工程或DNA重组技术）

（一）基因工程研究发展史

现代分子生物领域理论上的三大发现：1.DNA是遗传物质2揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制3遗传密码的破译、遗传信息的传递方式。

现代分子生物领域理论上的三大发明：1.限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割2DNA连接酶的发现与DNA片段的连接3基因工程的载体的发现研究。

（二）基因工程研究内容

1目的基因的研究获得目的基因的途径很多，主要有通过构建基因组文库或cDNA文库，从中筛选出特殊需要的基因。

2基因工程工具酶的研究基因工程工具酶指体外进行DNA合成、切割、修饰和连接等系列过程中所需要的酶，包括DNA连接酶、限制性核酸内切酶、修饰酶和连接酶等。现在常用的DNA连接酶只有两种，即大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA 连接酶。

第二章基因工程基本技术路线

基因工程基本技术路线图

（一）DNA的组成和结构

生物体内的DNA绝大部分是以B-DNA形式存在的。

当变性的DNA迅速降温时，两条单链DNA不易复性成双链DNA。

几乎所有真核生物的染色体DNA都是线性DNA，部分原核生物的染色体DNA也是

以线形存在。

ocDNA lDNA ccDNA(电泳方向：由上至下)

（二）天然DNA的制备

1天然DNA的来源：1染色体DNA 2病毒和噬菌体DNA 3质粒DNA 4线绿体和叶绿体DNA

2天然DNA的提取：1准备生物材料 2裂解细胞：对于细胞结构简单的原核生物，可用溶菌酶处理，用NaOH和SDS处理，用煮沸处理，用冰冻处理，以及用超声波处理等。

3DNA的纯化：

最常用的是方法是乙醇沉淀

4 DNA浓缩：

5 DNA片段大小的凝胶电泳检测

影响电泳的因素：1带点泳颗粒的物理性状2支持物介质3电场强度4缓冲液离心强度

凝胶电泳：在PH8..0--8.3的缓冲溶液中，核酸分子带负电，向正极移动。在浓度适当的凝胶中，由于分子刷选效应，使大小和构想不同的核酸分子迁移率出现差异，从而把它们分开。

6核酸分子杂交（297-312）

7DNA序列分析

（1）DNA的双脱氧链终止序列（329）

（2）化学降解测序列（327）

（3）PCR测序

（4）DNA自动化测序

（5）DNA杂交测序

（6）DNA片段序列测序的策略随机克隆策略、引物步移策略和定向缺失克隆策略。

大规模基因测序的两种策略：逐步克隆法和全基因组散弹法

第三章基因工程的酶学基础

（一）限制性核酸内切酶和DNA片段化

1限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。

2限制性内切酶识别序列：（1）长度，4--8个碱基，最常见的为6个碱基。（2）识别序列的结构：大多数为回文结构，切割位点在DNA两条链相对称的位置，也有序列埠对称的，或呈间断对称。（3）切割位点：磷酸二酯键断开的位置。

3限制性内切酶内切产生的末端：（1）匹配末端：识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后产生的末端，亦即黏性末端。（2）平末端：在回文对称轴上同时切割DNA的两条链则产生的末端。（3）非对称突出末端：识别序列为非对称性时。

4影响限制性内切酶活性的因素：（1）DNA纯度：存在pro、乙醇、EDTA、SDS 等等会降低活性，可增加酶的用量。（2）DNA样品的甲基化程度。甲基化对酶切得影响：a修饰酶切位点b产生新的酶切位点c对基因组作图的影响。（3）限制性内切酶缓冲液的性质：高盐、中盐和低盐。（4）DNA的分子结构：线形>超螺旋和环状。（5）酶切温度T：37°

5一些限制性核酸内切酶虽然来源不同，但是具有相同的识别序列，这样的限制

性核酸内切酶被称为同裂酶。同裂酶可以是具有不同的切割位点，也可以是具有相同的切割为点。

6 Star活性：某些限制性核酸内切酶在特定条件下，可以在不是原来的识别序列处切割DNA。

Star活性出现的频率因采用的限制性核酸内切酶、底物DNA和反应条件的不同而不同。几乎所有的限制性核酸内切酶都具有Star活性。

7 DNA分子片段化：（1）单酶切法（最常用的方法）（2）双酶切法（3）部分酶切

8 DNA分子的限制性图谱：（1）双酶切法（2）部分酶切法（3）Bal 31 逐步切割片段法

（二）DNA连接酶

1 DNA连接酶是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。

2 DNA连接酶包括大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。

3 T4噬菌体DNA连接酶更广泛的应用：（1）修复双链DNA上的单链缺口（2）连接RNA-DNA杂交双链上的DNA链缺口或RNA链缺口，后者反应速度较慢。（3）连接酶完全断开的两个平头双链DNA分子，属于分子间连接，但速度慢，需高浓度的底物和酶。

4 DNA片段的连接：（1）具互补黏性末端片段之间的连接（注意连接前后识别序列的变化）（2）具平末端DNA片段的连接（3）DNA片段末端修饰后再进行连接（4）DNA片段加连杆后连接。

（三）甲基化酶

Dam甲基化酶：修饰GATC序列中的腺嘌呤残基成为5’-甲基腺嘌呤。

Dcm甲基化酶：修饰CC(A/T)GG序列中的胞嘧啶残基成为5’-甲基胞嘧啶。（四）其他酶

1 磷性磷酸酯酶

2 DNA聚合酶（1）大肠杆菌聚合酶（2）T4噬菌体DNA聚合酶（3）Tt噬菌体DNA 聚合酶（4）耐高温DNA聚合酶：主要用于多聚酶链式反应（PCR）（5）反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶。（6）末端脱氧核苷酸转移酶

第四章基因工程载体

（一）载体的功能与特征

1 概念：载体是在基因工程中，把外源DNA或基因携带入宿主细胞的工具称为载体。

2 功能：（1）运送外源基因高效转入受体细胞

（2）为外源基因提供复制能力或整合能力

（3）为外源基因扩增和表达提供条件

3 载体蓝本：天然存在的质粒，噬菌体，病毒DNA，对其再进行修饰、改造、构建成多种功能的载体DNA分子。

4 载体具备的条件：具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）

具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点

具有较高的外源DNA装载能力

具有多种单一的限制性内切酶的识别位点、切割位点