4-克隆载体

具有若干限制酶单一 若干限制酶单一识别位点 （3）具有若干限制酶单一识别位点
这样的分子结构特性， 这样的分子结构特性，可以满足基因克隆的 需要，并且在其中插入适当大小的外源DNA DNA片段之 需要，并且在其中插入适当大小的外源DNA片段之 应该不影响质粒DNA的复制功能。 DNA的复制功能 后，应该不影响质粒DNA的复制功能。
（3）失控的质粒载体
有一些低拷贝数的质粒，它的复制控制是温度敏感型的， 有一些低拷贝数的质粒，它的复制控制是温度敏感型的， 在不同的温度下，拷贝数会有明显的变化。 在不同的温度下，拷贝数会有明显的变化。 pOC71： ： 37℃ ℃ 42℃ ℃
（单拷贝） 单拷贝） 拷贝) （>1000拷贝 拷贝
改良质粒： 30℃下 每个寄主细胞只有少量的拷贝数， 改良质粒：在30℃下，每个寄主细胞只有少量的拷贝数，当温度升高 35℃时 质粒的复制便失去了控制，单个细胞中的拷贝数持续上升。 到35℃时，质粒的复制便失去了控制，单个细胞中的拷贝数持续上升。 这个时候，细胞正常的代谢活动开始受到影响，但仍然可以持续2 这个时候，细胞正常的代谢活动开始受到影响，但仍然可以持续2～3 个小时，最后失活，但是，在这个阶段，质粒DNA DNA的量已经得到了累 个小时，最后失活，但是，在这个阶段，质粒DNA的量已经得到了累 可以达到细菌总DNA 50％左右。 DNA的 积，可以达到细菌总DNA的50％左右。
多克隆位点（multiple cloning site，MCS） ， ）
多克隆位点最初是用在蓝白斑筛选的质粒载体 系列）上的。 （pUC 系列）上的。它实际上是一个改造过的 lacZ’ 基因，在基因编码区的前段含有多个限制 基因， 酶识别的位点， 酶识别的位点，目的基因只要插入其中一个或两 个位点之间， 基因的失活， 个位点之间，都会导致lacZ’ 基因的失活，可供 蓝白斑筛选。 蓝白斑筛选。 多克隆位点的应用， 多克隆位点的应用，使操作过程中限制性内切酶 的选择余地更大，方便操作。 的选择余地更大，方便操作。
目的蛋白绝大多数都是来自真核生物， 目的蛋白绝大多数都是来自真核生物，而真核基 因并不具备可以被大肠杆菌细胞的遗传体系所识 别的转录－翻译调控元件， 别的转录－翻译调控元件，并且超量表达外源蛋 白的时候常常会使宿主细胞致死。 白的时候常常会使宿主细胞致死。 表达载体是在常规克隆载体的基础上衍生而来的， 表达载体是在常规克隆载体的基础上衍生而来的， 主要增添了强启动子，以及有利于表达产物分泌、 主要增添了强启动子，以及有利于表达产物分泌、 分离或纯化的元件。 分离或纯化的元件。
分 解
蓝色产物
（5）克隆载体与表达载体
①克隆载体
在基因克隆的研究工作中， 在基因克隆的研究工作中，有时候是为 了获得大量的目的基因片段， 了获得大量的目的基因片段，这个时候用的 载体称为克隆载体。 载体称为克隆载体。 克隆载体主要用于扩增或保存 DNA 片 是最简单的载体。 段，是最简单的载体。
②表达载体
（2）低拷贝数的质粒载体
特点：体积小、拷贝数低， 特点：体积小、拷贝数低，与此相对应的基因剂 量也少。 量也少。 有些外源的DNA片段所编码的基因， 有些外源的DNA片段所编码的基因，当用高拷贝的 DNA片段所编码的基因 质粒作为载体的时候，外源蛋白的大量表达， 质粒作为载体的时候，外源蛋白的大量表达，会 严重的扰乱宿主细胞的正常的新陈代谢活动。 严重的扰乱宿主细胞的正常的新陈代谢活动。选 择低拷贝的质粒载体， 择低拷贝的质粒载体，使外源基因的蛋白产物对 宿主细胞的毒害作用降低到最低的程度。 宿主细胞的毒害作用降低到最低的程度。
氨卞青霉素和四环素双选择的载体，通过“影印 氨卞青霉素和四环素双选择的载体，通过“ 双选择的载体 平板培养” 平板培养”的方法进行筛选 。 蓝－白斑筛选
lacZ 基因是乳糖 lac 操纵子中编码 β-半乳糖苷酶的基因，乳糖及 半乳糖苷酶的基因， 其衍生物可诱导其表达。 异丙基硫代半乳糖苷（IPTG） 其衍生物可诱导其表达。 异丙基-β-D- 硫代半乳糖苷（IPTG）是乳 糖的衍生物， 操纵子的诱导物； 吲哚糖的衍生物，可作为 lac 操纵子的诱导物； 5-溴-4-氯-3-吲哚-β半乳糖苷（ 操纵子的底物，以及生色剂， D-半乳糖苷（X-gal） 可作为 lac 操纵子的底物，以及生色剂，当它 半乳糖苷酶分解后可产生蓝色产物，使菌落或噬菌斑呈蓝色。 被 β-半乳糖苷酶分解后可产生蓝色产物，使菌落或噬菌斑呈蓝色。 X-gal lacZ 基因 IPTG诱导 诱导 β-半乳糖苷酶 半乳糖苷酶
2、质粒载体的选择记号
在基因克隆中采用的质粒载体的选择记号有很 多种，采用较多的是抗性特征 抗性特征。 多种，采用较多的是抗性特征。 一方面由于许多质粒本身就是带有此类抗性基 另一方面因为抗菌素的抗性特征便于操作， 因，另一方面因为抗菌素的抗性特征便于操作， 易于选择。 易于选择。
3、天然质粒用作克隆载体的局限性
（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数
低分子量的质粒首先易于操作，克隆了外源DNA DNA片 ①低分子量的质粒首先易于操作，克隆了外源DNA片 段之后，仍然可以有效的转化受体细胞。 段之后，仍然可以有效的转化受体细胞。经验表 分子量大于10kb的分子， 10kb的分子 明，分子量大于10kb的分子，在纯化的过程中容 易发生断裂； 易发生断裂； 这类质粒往往含有比较高的拷贝数， ②这类质粒往往含有比较高的拷贝数，这不仅有利 于质粒DNA的提取， DNA的提取 于质粒DNA的提取，同时还会增加细胞中克隆基因 的剂量； 的剂量；
典型的大肠杆菌表达型质粒载体
必须包括大肠杆菌的启动子及操纵位点序列、 必须包括大肠杆菌的启动子及操纵位点序列、多 启动子 序列 克隆位点（MCS） 转录及翻译信号、 克隆位点（MCS）、转录及翻译信号、质粒载体的 复制起点以及抗菌素的抗性基因。 以及抗菌素的抗性基因 复制起点以及抗菌素的抗性基因。
ColE1
拷贝数高，但选择标记为免疫标记，重组子筛选工作量大。 拷贝数高，但选择标记为免疫标记，重组子筛选工作量大。
4、不同类型的质粒载体
（1）高拷贝数的质粒载体
克隆的目的仅仅是为了分离、 克隆的目的仅仅是为了分离、获得大量的克隆基因的 DNA片段，通常选择 片段， 片段 通常选择ColE1、pMB1或者是它们的派生质 、 或者是它们的派生质 粒。 特点：分子量低、拷贝数高， 特点：分子量低、拷贝数高，而且与大多数其他质粒不同 的是，他们在没有蛋白质合成的条件下仍然可以继续复制。 的是，他们在没有蛋白质合成的条件下仍然可以继续复制。
天然质粒： 天然质粒：没有经过以基因克隆为目标的体外修 饰改造的质粒。 pSC101
优点：有一个四环素抗性（Tetr）的选择记号，对于EcoR 优点：有一个四环素抗性（ 的选择记号，对于 I限制酶只有一个识别位点，在这个位点插入外源DNA既不 限制酶只有一个识别位点， DNA既不 限制酶只有一个识别位点 在这个位点插入外源DNA 会影响载体本身的复制功能，也不会破坏抗性标记。 会影响载体本身的复制功能，也不会破坏抗性标记。 缺点：分子量比较大（ ），拷贝数比较低 缺点：分子量比较大（9.09Kb），拷贝数比较低，只有一 ），拷贝数比较低， 个抗性基因，增加了重组子筛选的工作量。 个抗性基因，增加了重组子筛选的工作量。
比如，在处于对数生长期的含有 质粒的培养物中， 比如，在处于对数生长期的含有ColE1质粒的培养物中，加入适量的 质粒的培养物中 蛋白质合成抑制剂进行处理，可以阻断染色体DNA的复制（组蛋白 的复制（ 蛋白质合成抑制剂进行处理，可以阻断染色体 的复制 的合成被阻断），而对质粒DNA的复制没有什么影响，于是，经过 的合成被阻断），而对质粒 的复制没有什么影响，于是， ），而对质粒 的复制没有什么影响 10～12小时的培养 每个细胞中的质粒拷贝数可以扩增到1000 小时的培养， 1000～ 10～12小时的培养，每个细胞中的质粒拷贝数可以扩增到1000～3000 个之多。所以，分离到的质粒DNA的产量可以达到 的产量可以达到1mg/L。 个之多。所以，分离到的质粒 的产量可以达到 。
按照特殊设计构建的， 按照特殊设计构建的，能使克隆在其中特定位点的外 源真核基因的编码序列， 源真核基因的编码序列，在大肠杆菌中正常转录并翻 译成相应蛋白质的克隆载体称为表达载体 译成相应蛋白质的克隆载体称为表达载体 （expression vectors） ） 表达载体可以分为表达型质粒载体和表达型噬菌体载 体两种。 体两种。
待表达的真核基因编码序列被克隆在紧靠启动子 待表达的真核基因编码序列被克隆在紧靠启动子（P， promoter）下游的多克隆位点上， promoter）下游的多克隆位点上，这样才能在启动子控制下 进行有效的转录 terminator）能够增进mRNA mRNA的数量和稳定性 转录终止子（T，terminator）能够增进mRNA的数量和稳定性 operator） 操纵位点（O，operator）则是通过与阻遏蛋白的结合来调节 转录反应 RBS， site） 核糖体结合位点（RBS，ribosome binding site）为克隆基因 mRNA的有效翻译提供了必要的序列信号 sequence） mRNA的有效翻译提供了必要的序列信号（SD sequence） 抗菌素基因提供选择标记 抗菌素基因提供选择标记
（4）插入失活型的双选择质粒载体
理想的质粒克隆载体应该具有两种或两种以上的 抗性标记，在重组的过程中，一个标记保持完整， 抗性标记，在重组的过程中，一个标记保持完整， 用来筛选转化子， 用来筛选转化子，而另一个标记则有插入失活的 效应。这样就可以在转化以后直接选出重组质粒， 效应。这样就可以在转化以后直接选出重组质粒， 减轻了实验的工作量，同时提高了选择的敏感性。 减轻了实验的工作量，同时提高了选择的敏感性。
第四章
克隆载体
一、质粒载体的特点及类型 二、噬菌体载体 黏粒、YAC与 三、黏粒、YAC与BAC 四、真核生物载体