基因克隆的质粒载体详解124页PPT
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《基因克隆载体》PPT课件
显性质粒
Ｒ质粒：含有氨苄青霉素Ap、氯霉素Cm、
卡那霉素Km、四环素Tc、链霉素Sm等药物的 抗性基因，可作为选择标记。
Col质粒 Ｆ质粒 降解质粒 Ｔi质粒
隐蔽质粒 蓝藻内源质粒
二、 质粒克隆载体构建的基本策略
１、能进行有效复制——复制起始位点（最好是多拷贝） ２、克隆位点——组装MCS连杆 ３、选择标记基因——抗性基因，Lac Z’基因 ４、分子尽可能小（转化率高），＞15kb，转化率↓↓ ５、组装各种“元件”，如启动子、终止子等
酵母染色体URA3基因→HindⅢ酶切
pBR322质粒
YEp24 （图3-11）
特征 （1）保留了pBR322的Ａｐｒ和Ｔｃｒ——筛选大肠杆菌克隆子 （2）含URA3标记——筛选酵母菌克隆子 （3）URA3基因——补偿酵母菌ura3突变
优点 （1）是一种穿梭质粒，可在酵母菌和大肠杆菌中复制 （2）转化率高，1μgDNA可获得约104～105个克隆子 （3）稳定高拷贝复制
3．2 病毒（噬菌体）克隆载体
病毒基本结构：
DNA（或RNA）+ 外壳蛋白 感染细菌的病毒，称为噬菌体。
分类（根据病毒与宿主的关系）： 温和性病毒：
溶原性增殖→构建病毒载体
烈性病毒：
溶菌性增殖→改造后
一、λ噬菌体克隆载体
（一） λ噬菌体性质
λDNA + 外壳蛋白 1、λDNA (48.5kb) 噬菌体中：线性 宿主细胞：环状(cos位点)
λDNA头部可包装约36.4～51kb(自身的75%～105%)， 且约有20kb λDNA可缺失（生长非必需） 3、在λDNA上有多种限制性内切酶位点
（三）构建的基本策略与技术路线
策略: 切去部分非必需区，删掉多余的限制性内切酶位 点，插入选择性标记基因，建立体外包装系统。
Ｒ质粒：含有氨苄青霉素Ap、氯霉素Cm、
卡那霉素Km、四环素Tc、链霉素Sm等药物的 抗性基因，可作为选择标记。
Col质粒 Ｆ质粒 降解质粒 Ｔi质粒
隐蔽质粒 蓝藻内源质粒
二、 质粒克隆载体构建的基本策略
１、能进行有效复制——复制起始位点（最好是多拷贝） ２、克隆位点——组装MCS连杆 ３、选择标记基因——抗性基因，Lac Z’基因 ４、分子尽可能小（转化率高），＞15kb，转化率↓↓ ５、组装各种“元件”，如启动子、终止子等
酵母染色体URA3基因→HindⅢ酶切
pBR322质粒
YEp24 （图3-11）
特征 （1）保留了pBR322的Ａｐｒ和Ｔｃｒ——筛选大肠杆菌克隆子 （2）含URA3标记——筛选酵母菌克隆子 （3）URA3基因——补偿酵母菌ura3突变
优点 （1）是一种穿梭质粒，可在酵母菌和大肠杆菌中复制 （2）转化率高，1μgDNA可获得约104～105个克隆子 （3）稳定高拷贝复制
3．2 病毒（噬菌体）克隆载体
病毒基本结构：
DNA（或RNA）+ 外壳蛋白 感染细菌的病毒，称为噬菌体。
分类（根据病毒与宿主的关系）： 温和性病毒：
溶原性增殖→构建病毒载体
烈性病毒：
溶菌性增殖→改造后
一、λ噬菌体克隆载体
（一） λ噬菌体性质
λDNA + 外壳蛋白 1、λDNA (48.5kb) 噬菌体中：线性 宿主细胞：环状(cos位点)
λDNA头部可包装约36.4～51kb(自身的75%～105%)， 且约有20kb λDNA可缺失（生长非必需） 3、在λDNA上有多种限制性内切酶位点
（三）构建的基本策略与技术路线
策略: 切去部分非必需区，删掉多余的限制性内切酶位 点，插入选择性标记基因，建立体外包装系统。
基因工程原理讲义：基因克隆的质粒载体
第六讲基因克隆的质粒载体中国科学院遗传与发育生物学研究所2017年8月基因克隆的质粒载体一、导言1．质粒是一类引人注目的亚细胞有机体其结构比病毒还要简单，既无蛋白质外壳，也无细胞外生命周期，只能在寄主细胞内增殖，并随着寄主细胞的分裂而被遗传下去。
2．质粒的类型多种多样F质粒：F因子或性质粒(Sex plasmid)，它能够使寄主染色体上的基因与F因子(F factor)一道转移到原先不存在该质粒的寄主受体细胞中去。
R质粒：通称抗药性因子(Resistant factor, R factor)，编码一种或数种抗菌素抗性基因，并能将此抗性转移到缺乏该质粒的适宜的受体细胞中去。
Col质粒：所谓Col质粒，即是一种产生大肠杆菌素的因子，编码控制大肠杆菌素合成的基因。
大肠杆菌素可使不带Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死。
3．质粒载体70年代在实验室构建的一类最普遍使用的基因克隆载体。
二、质粒的一般特性1．质粒DNA(细菌质粒定义)*1.大肠杆菌的质粒是独立于寄主染色体以外的自主复制的共价、闭合、环形的双链DNA分子(covalently closed circular DNA, cccDNA)。
除了酵母的杀伤质粒(Killer plasmid)是RNA质粒外，所有的质粒都是质粒DNA。
但是质粒DNA的复制又必须依赖于寄主提供核酸酶及蛋白质。
*2.质粒DNA分子大小文献中有3种说法：小的仅有103KD，仅能编码2-3种蛋白质；大的可达105KD，两者相差上百倍。
1Kb～200Kb (Sambrok et al.)5Kb～400Kb (Lehninger)MD(megadaltons)=106D (兆道尔顿)1.5Kb≈1MD*3.质粒DNA与寄主染色体DNA间的关系一般情况下，质粒DNA可持续地处于寄主染色体外的游离状态，但在一定条件下又可以可逆地整合到寄主染色体上，并随之一道复制和细胞分裂而传到后代。
基因工程原理第3章基因克隆载体[可修改版ppt]
![基因工程原理第3章基因克隆载体[可修改版ppt]](https://img.taocdn.com/s3/m/d56699a9ddccda38366baf0a.png)
融合蛋白质克隆载体克隆外源基因示意图
表达融合体蛋白质策略的优点：
（1）克隆的外源基因能有效 转译。 （2）表达的蛋白质稳定。 （3）可以加入信号肽，定位 输送蛋白质。 （4）利于分离纯化。
非融合蛋白表达载体：
二、噬菌体克隆载体
λ DNA： ——在噬菌体中是线状DNA分子，进入寄主细胞后呈环 状DNA分子。 ——长48kb。 ——左右两端各有12bp组成的彼此完全互补的粘性末端。 形成cos位点。 ——包括61个基因，其中1/2参与了噬菌体生命周期， 是必要基因，另1/2属于不必要基因，用于基因工程操 作。
不含对受体有害基因不任意转入其它细胞尤其是人体细胞第一节克隆载体的一般特征一细菌质粒载体第二节原核生物基因克隆载体细菌质粒载体是以细菌质粒dna分子为基础构建的克隆载体主克隆载体
• DNA重组（限制性内切酶） • 运输工具——基因克隆载体 • 目的基因的制备 • 目的基因导入受体细胞 • 外源基因的表达 • 基因工程的应用
的成熟有关（占20%）
4.λ噬菌体DNA的包装限制问题
包装能力： λDNA×75%——λDNA ×105%， 即从36kb——51kb
• 野生型λDNA的必要区是28kb，所以能加入的外源DNA长度最大为 51kb-28kb=23kb。实际为15kb。
• 若λ基因组缺失大于25%时，也不能有效包装。
pBR322
（6524bp)
λDNA：cos序列和控制包装序列
pBR322
质粒的复制子 抗药性基因 多克隆位点区
克隆能力：31—45kb
（二） Cosmid载体的应用程序
应用柯斯质粒载体，在大肠 杆菌细胞中克隆大片段的真 核基因组DNA技术，叫做柯 斯克隆（cosmid cloning）。
表达融合体蛋白质策略的优点：
（1）克隆的外源基因能有效 转译。 （2）表达的蛋白质稳定。 （3）可以加入信号肽，定位 输送蛋白质。 （4）利于分离纯化。
非融合蛋白表达载体：
二、噬菌体克隆载体
λ DNA： ——在噬菌体中是线状DNA分子，进入寄主细胞后呈环 状DNA分子。 ——长48kb。 ——左右两端各有12bp组成的彼此完全互补的粘性末端。 形成cos位点。 ——包括61个基因，其中1/2参与了噬菌体生命周期， 是必要基因，另1/2属于不必要基因，用于基因工程操 作。
不含对受体有害基因不任意转入其它细胞尤其是人体细胞第一节克隆载体的一般特征一细菌质粒载体第二节原核生物基因克隆载体细菌质粒载体是以细菌质粒dna分子为基础构建的克隆载体主克隆载体
• DNA重组（限制性内切酶） • 运输工具——基因克隆载体 • 目的基因的制备 • 目的基因导入受体细胞 • 外源基因的表达 • 基因工程的应用
的成熟有关（占20%）
4.λ噬菌体DNA的包装限制问题
包装能力： λDNA×75%——λDNA ×105%， 即从36kb——51kb
• 野生型λDNA的必要区是28kb，所以能加入的外源DNA长度最大为 51kb-28kb=23kb。实际为15kb。
• 若λ基因组缺失大于25%时，也不能有效包装。
pBR322
（6524bp)
λDNA：cos序列和控制包装序列
pBR322
质粒的复制子 抗药性基因 多克隆位点区
克隆能力：31—45kb
（二） Cosmid载体的应用程序
应用柯斯质粒载体，在大肠 杆菌细胞中克隆大片段的真 核基因组DNA技术，叫做柯 斯克隆（cosmid cloning）。
基因克隆的载体 PPT课件
基因克隆的载体
载体（vector）是由在细胞中能 够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种 遗传成分，通过实验手段可使其它的 ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行 复制，作为基因工程的载体，必须具 备以下几个性能：
1、分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。
2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。
3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制
主要基因
非接合型质粒 自主复制基因，长生大肠杆菌素基因
按抗性记号分类 Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基因
R质粒(R因子)
自主复制基因，转移基因，细菌染色体区段 F质粒（ F因子）
自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因 自主复制基因，转移基因，抗菌素抗性基因 自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因
流程：
首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠 （SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。
将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的 大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链 的碱基中去。
在EB达到饱和时，进行氯化铯密度 梯度离心。
2.碱变性法：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。
酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。
4、有适合的标记，易于选择。
5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达， 并且尽可能是高效的表达。
6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于 在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。
载体
功能
克隆载体: 克隆一个基因或DNA片断
作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适 当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的 质粒载体。
载体（vector）是由在细胞中能 够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种 遗传成分，通过实验手段可使其它的 ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行 复制，作为基因工程的载体，必须具 备以下几个性能：
1、分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。
2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。
3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制
主要基因
非接合型质粒 自主复制基因，长生大肠杆菌素基因
按抗性记号分类 Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基因
R质粒(R因子)
自主复制基因，转移基因，细菌染色体区段 F质粒（ F因子）
自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因 自主复制基因，转移基因，抗菌素抗性基因 自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因
流程：
首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠 （SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。
将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的 大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链 的碱基中去。
在EB达到饱和时，进行氯化铯密度 梯度离心。
2.碱变性法：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。
酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。
4、有适合的标记，易于选择。
5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达， 并且尽可能是高效的表达。
6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于 在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。
载体
功能
克隆载体: 克隆一个基因或DNA片断
作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适 当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的 质粒载体。
《基因克隆的载体》课件
噬菌体
适用于大批量表达分泌蛋白的研究，转化后可产生 高水平的基因表达。
Cosmid
BAC
可容纳大型外源DNA片段，适用于聚合酶连锁反应、 基因组构建和定位大片段DNA序列等研究。
适合于构建大型基因组和物种基因组序列的物 理/遗传图谱。
基因克隆的步骤
1
下载或制备载体
获取可自主复制的载体，或通过人工合成的方法制备载体。
特点
常见的基因克隆载体质粒具 有如下特点： 1. 大小适中； 2. 构建简单方便； 3. 易于操作且可大量扩增； 4. 可以自主复制； 5. 便于基因操纵和定向表达 等。
类型
常见的载体类型包括质粒、 噬菌体、Cosmid和BAC等。
常见的基因克隆载体
质粒
最常见的基因克隆载体，易于操作且可大量扩增。
基因克隆的载体
克隆技术是现代生命科学研究的重要手段之一。基因克隆技术作为克隆技术 的重要组成部分，因其应用领域的广泛性及重要性而备受关注。本课程将为 您详细介绍基因克隆的载体知识。
载体的定义和特点
定义
基因克隆载体是指具有自主 复制能力的DNA分子，具有 携带外源DNA片段进入细胞 和定向操纵目的基因表达等 功能。
基因克隆的验证
1 检测重组载体
常用方法包括PCR，南方杂交等。通过检测 目的基因的插入，判断载体是否重组成功。
2 验证目的基因的插入
常用方法包括Sequencing和Southern blotting等，验证目的基因是否插入到载体中。
总结和展望
总结
基因克隆载体是基因克隆技术的重要组成部分， 应用领域广泛。核心在于选取合适的载体、构 建载体、将基因植入载体并最终将载体转化到 受体细胞中。
2
第六章基因克隆的载体与受体PPT课件
抗菌素选择原理
含有抗菌素的培养基（选择培养基）中能够生 长抗菌素抗性基因的受体菌
当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后， 受体菌才能生长。
抗性基因
死
抗菌素
活
• 另：pUC18质粒具有以下特点：
①. 分子量小，可接受较大外源片段； ②. 拷贝数多，500个／细胞； ③. 克隆位点的酶切位点多，克隆方便； ④. 具有用于检测重组质粒的选择标记
（1）选择标记
① 抗菌素抗性
绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记：
氨苄青霉素抗性（Ampr） 卡那霉素抗性 （Kanr） 四环素抗性 （Tetr） 链霉素抗性 （Strr） 氯霉素抗性 （Cmlr）
② 遗传标记
使受体菌发生遗传性状的改变的基因。
经典的大肠杆菌质粒载体
1. pSC101
第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。
第六章 基因克隆的载体与受体
质粒载体 噬菌体载体 大分子DNA克隆载体 用于基因转移的受体菌或细胞
载体
• 载体是将“目的”基因即重组DNA分子导入受体细胞的运载工具。 DNA载体：质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体等，现 在使用的载体都是采用基因工程的方法构建的。
• 载体的条件： ①.具有复制原点，能自我复制，并能带动携带的外源DNA一起复
（4）质粒的空间构型：
① 共价闭合环状DNA（cccDNA) Covalent close circular DNA 呈超螺旋（SC）（super coil）
② 开环DNA（ open circular， ocDNA） 一条链上有一至数个缺口。
③ 线形DNA （ linear ，lDNA）
（5）质粒空间构型与电泳速率 同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳 迁移率不同：
克隆载体表达载体(课件)PPT课件
详细描述
组成型表达载体是将基因整合到宿主细胞的染色体上，使基因在任何生长条件下都能稳定表达。这种 表达载体适用于需要持续稳定表达的基因。
组织特异性表达载体
总结词
在特定的组织或器官中，表达载体才能 启动基因的表达。
VS
详细描述
组织特异性表达载体是将基因与特定的组 织或器官相关的调控序列结合，使基因只 在特定的组织或器官中表达。这种表达载 体适用于需要组织特异性表达的基因。
05
克隆载体和表达载体的未来发展
克隆载体和表达载体的新技术和新方法
基因编辑技术
利用CRISPR-Cas9等基因编辑技术，实现对克隆载体和表达载体的精确修饰，提高基 因治疗的效率和安全性。
人工染色体技术
开发人工染色体技术，实现对大型基因组的克隆和表达，为遗传病研究和治疗提供新的 工具。
克隆载体和表达载体的新应用和新领域
04
克隆载体和表达载体的应用
克隆载体在基因工程中的应用
基因克隆
克隆载体可以将目的基因插入到质粒 或病毒载体中，实现基因的复制和扩 增，为基因工程提供大量目的基因。
基因保存
基因突变
通过将目的基因插入到克隆载体中， 进行定点突变或随机突变，研究基因 功能和蛋白质活性。
克隆载体可以保存和传递目的基因， 为基因工程提供长期稳定的基因来源。
01
02
03
基因治疗
利用克隆载体和表达载体， 开发新型基因治疗策略， 针对遗传性疾病、肿瘤等 进行有效治疗。
生物制药
通过克隆载体和表达载体， 实现高效、大规模的蛋白 质药物生产，推动生物制 药产业的发展。
农业育种
利用克隆载体和表达载体， 培育抗逆、抗病、高产的 农作物新品种，提高农业 生产效益。
组成型表达载体是将基因整合到宿主细胞的染色体上，使基因在任何生长条件下都能稳定表达。这种 表达载体适用于需要持续稳定表达的基因。
组织特异性表达载体
总结词
在特定的组织或器官中，表达载体才能 启动基因的表达。
VS
详细描述
组织特异性表达载体是将基因与特定的组 织或器官相关的调控序列结合，使基因只 在特定的组织或器官中表达。这种表达载 体适用于需要组织特异性表达的基因。
05
克隆载体和表达载体的未来发展
克隆载体和表达载体的新技术和新方法
基因编辑技术
利用CRISPR-Cas9等基因编辑技术，实现对克隆载体和表达载体的精确修饰，提高基 因治疗的效率和安全性。
人工染色体技术
开发人工染色体技术，实现对大型基因组的克隆和表达，为遗传病研究和治疗提供新的 工具。
克隆载体和表达载体的新应用和新领域
04
克隆载体和表达载体的应用
克隆载体在基因工程中的应用
基因克隆
克隆载体可以将目的基因插入到质粒 或病毒载体中，实现基因的复制和扩 增，为基因工程提供大量目的基因。
基因保存
基因突变
通过将目的基因插入到克隆载体中， 进行定点突变或随机突变，研究基因 功能和蛋白质活性。
克隆载体可以保存和传递目的基因， 为基因工程提供长期稳定的基因来源。
01
02
03
基因治疗
利用克隆载体和表达载体， 开发新型基因治疗策略， 针对遗传性疾病、肿瘤等 进行有效治疗。
生物制药
通过克隆载体和表达载体， 实现高效、大规模的蛋白 质药物生产，推动生物制 药产业的发展。
农业育种
利用克隆载体和表达载体， 培育抗逆、抗病、高产的 农作物新品种，提高农业 生产效益。
基因克隆载体PPT幻灯片
二、基因克隆载体
（一）载体的功能及特征 （二）质粒 （三）噬菌体或病毒DNA （四）Cos质粒与噬菌粒 （五）人工染色体载体
（一）载体的功能及特征
载体(vector)：
在基因工程操作中，能携带外源DNA 进入受体细胞的DNA分子。
载体的功能： 运送外源基因高效转入受体细胞； 为外源基因提供复制能力或整合能力； 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
2、不相容性(incompatibility)
指任何两种含相似复制子结构的不同 质粒，不能同时存在于一个细胞中。
分子机制：
两种含不同复制子结构的不同质粒，在 复制时受各自的拷贝数控制系统调节，致使 两种质粒的最终拷贝数恒定，经若干复制周 期和细胞分裂周期后，仍能共处于同一细胞 内。
两种含相似复制子结构的不同质粒，在 复制时受同一拷贝数控制系统的干扰，致使 两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多 的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。
1）接合型质粒：
除带有自我复制所必需的遗传信息外，还带 有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另 一个细胞，如F质粒。
2）非接合型质粒：
虽带有自我复制所必需的遗传信息，但失 去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
不能在天然条件下独立地发生接合作用， 如ColE1质粒。
2）存在于细菌、真菌、 蓝藻、酵母等细胞中。
plasmid DNA
Genomic DNA
The genomic DNA of E.coli: a single circular double-stranded DNA, with the contour length about 850 times longer than the cell
（一）载体的功能及特征 （二）质粒 （三）噬菌体或病毒DNA （四）Cos质粒与噬菌粒 （五）人工染色体载体
（一）载体的功能及特征
载体(vector)：
在基因工程操作中，能携带外源DNA 进入受体细胞的DNA分子。
载体的功能： 运送外源基因高效转入受体细胞； 为外源基因提供复制能力或整合能力； 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
2、不相容性(incompatibility)
指任何两种含相似复制子结构的不同 质粒，不能同时存在于一个细胞中。
分子机制：
两种含不同复制子结构的不同质粒，在 复制时受各自的拷贝数控制系统调节，致使 两种质粒的最终拷贝数恒定，经若干复制周 期和细胞分裂周期后，仍能共处于同一细胞 内。
两种含相似复制子结构的不同质粒，在 复制时受同一拷贝数控制系统的干扰，致使 两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多 的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。
1）接合型质粒：
除带有自我复制所必需的遗传信息外，还带 有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另 一个细胞，如F质粒。
2）非接合型质粒：
虽带有自我复制所必需的遗传信息，但失 去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
不能在天然条件下独立地发生接合作用， 如ColE1质粒。
2）存在于细菌、真菌、 蓝藻、酵母等细胞中。
plasmid DNA
Genomic DNA
The genomic DNA of E.coli: a single circular double-stranded DNA, with the contour length about 850 times longer than the cell
目的基因的克隆PPT课件(模板)
A ＝ 1 : ( 1~3 )
载体摩尔数
目标基因片段碱基数×载体重量
目标DNA摩尔数
目标基因片段重量×载体碱基数
载体和目标基因的连接反应
➢ 如未定量可以按回收效率75％计算DNA浓度，按载体与 目的基因摩尔数比1:3进行连接。
➢ 连接反应在灭菌的0.5ml离心管中进行。15 l体积反
应体系中：
加ddH2O使终体积为 Liner vector
15 l 50-100 ng
Target gene fragment
15- 30 ng
10×Ligase Buffer (已含有ATP) T4 DNA Ligase
1.5 l 1.O l
➢ 轻轻混匀，稍加离心, 14-16℃或4℃,O/N 。
分钟，9000g×1分钟。备用。
载体和目标基因的连接反应
重组 DNA 技术的一般流程
重组子的筛选 （2）受体菌的选择与改造
仔细切下含DNA的凝胶，置一称重的1.
次选匹配粘端，载体脱磷
5ml离心管中，在吸附膜中央加入30 lddH2O，静置1分钟，9000g×1分钟。
耐药性基因 如 Pst I（CTGCA↓G，12℃ ），EcoRI（G↓AATTC，8℃）。
荧光质粒转染观察
重组 DNA 技术的一般流程
➢ 目的DNA的获得 ➢ 目的DNA与载体的连接 ➢ 重组子导入受体细胞 ➢ 重组子的筛选和鉴定
实验一:pEGFP-NGF质粒载体的构建
NGF 基因的克隆(T-A克隆)
NGF-sense: NGF-antisense:
a GAGCTC aagatgctgtgcctcaagccagt at GGGCCC gtctagatcc agagtgtctg
载体摩尔数
目标基因片段碱基数×载体重量
目标DNA摩尔数
目标基因片段重量×载体碱基数
载体和目标基因的连接反应
➢ 如未定量可以按回收效率75％计算DNA浓度，按载体与 目的基因摩尔数比1:3进行连接。
➢ 连接反应在灭菌的0.5ml离心管中进行。15 l体积反
应体系中：
加ddH2O使终体积为 Liner vector
15 l 50-100 ng
Target gene fragment
15- 30 ng
10×Ligase Buffer (已含有ATP) T4 DNA Ligase
1.5 l 1.O l
➢ 轻轻混匀，稍加离心, 14-16℃或4℃,O/N 。
分钟，9000g×1分钟。备用。
载体和目标基因的连接反应
重组 DNA 技术的一般流程
重组子的筛选 （2）受体菌的选择与改造
仔细切下含DNA的凝胶，置一称重的1.
次选匹配粘端，载体脱磷
5ml离心管中，在吸附膜中央加入30 lddH2O，静置1分钟，9000g×1分钟。
耐药性基因 如 Pst I（CTGCA↓G，12℃ ），EcoRI（G↓AATTC，8℃）。
荧光质粒转染观察
重组 DNA 技术的一般流程
➢ 目的DNA的获得 ➢ 目的DNA与载体的连接 ➢ 重组子导入受体细胞 ➢ 重组子的筛选和鉴定
实验一:pEGFP-NGF质粒载体的构建
NGF 基因的克隆(T-A克隆)
NGF-sense: NGF-antisense:
a GAGCTC aagatgctgtgcctcaagccagt at GGGCCC gtctagatcc agagtgtctg
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23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
39、没有不老的誓言，没有不变的承 诺，踏 上旅途 ，义无 反顾。 40、对时间的价值没有没有深切认识 的人， 决不会 坚韧勤 勉。
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
基因克隆的质粒载体详解
36、“不可能”这个字(法语是一个字 )，只 在愚人 的字典 中找得 到。--拿 破仑。 37、不要生气要争气，不要看破要突 破，不 要嫉妒 要欣赏 ，不要 托延要 积极， 不要心 动要行 动。 38、勤奋，机会，乐观是成功的三要 素(注 意：传 统观念 认为勤 奋和机 会是成 功的要 素，但 是经过 统计学 和成功 人士的 分析得 出，乐 观是成 功的第 三要素 。
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
39、没有不老的誓言，没有不变的承 诺，踏 上旅途 ，义无 反顾。 40、对时间的价值没有没有深切认识 的人， 决不会 坚韧勤 勉。
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
基因克隆的质粒载体详解
36、“不可能”这个字(法语是一个字 )，只 在愚人 的字典 中找得 到。--拿 破仑。 37、不要生气要争气，不要看破要突 破，不 要嫉妒 要欣赏 ，不要 托延要 积极， 不要心 动要行 动。 38、勤奋，机会，乐观是成功的三要 素(注 意：传 统观念 认为勤 奋和机 会是成 功的要 素，但 是经过 统计学 和成功 人士的 分析得 出，乐 观是成 功的第 三要素 。