基因克隆载体的特点、分类和表达
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• 质粒载体 大肠杆菌质粒载体，枯草杆菌质粒载体，酵母质 粒载体，农杆菌质粒载体，蓝细菌质粒载体
• 噬菌体质粒载体 双链DNA噬菌体载体：λ 单链DNA噬菌体载体：M13，T3，T7
• 病毒载体 植物病毒载体CaMV（花椰菜花斑病病毒） 动物病毒载体 SV40（猿猴空泡病毒）
质粒和噬菌体DNA兼有的载体 Phasmid 载体（含有f1 噬菌体的ori） Cosmid 载体（含有λDNA的Cos区）
１ λ噬菌体克隆载体
１.1λ噬菌体的一般特性 λ噬菌体的组成
结构：外壳蛋白 DNA
形态：头部 尾部
3.2 pBR322质粒载体的构建
３.3 pUC18-19 质粒载体的构建
以pBR322为出发质粒，用含乳糖操纵子O、P和Z’ 的DNA片段取代pBR322上的Tcr基因，并在Z’区组 入一个多克隆位点．
pUC18-19的构建
3.４ 蓝藻质粒载体的构建
蓝藻作为受体细胞的特点 a）原核生物，能进行光合作用，具有固氮能力． b）基因组简单，50%的蓝藻含有质粒．
病毒区基因及功能
Ti质粒T-DNA的边界序列
３ 质粒载体的构建
3.1 质粒构建的基本要求
1）构建的质粒载体能转化受体细胞,并在其中进行 松弛型复制. * 选择松弛型质粒复制起始子(Ori)
2) 构建的质粒载体含有克隆外源DNA的位点(MCS) *构建的质粒载体含有选择标记基因(Apr,Tcr,Kmr) *构建的质粒载体分子量小,转化效率高,插入外 源片段较大.
质粒载体的一般特性
质粒的组成与构型 细胞内：超螺旋环状共价双链DNA分子
细胞外：超螺旋、开环，线形
双螺旋共价闭合 环（超螺旋）
开环双螺旋 （一个裂口）
线状双螺旋 （两个裂口）
质粒DNA分子的大小：细菌质粒的大小相差较大， 小的仅不足1kb，大的可达数百kb.
不相容性（Incompatible）：两种类似的但又不 同的质粒不能存在于同一细胞中．
c）细胞大（10-10于E.coli）储藏蛋白多，单一蛋白可达
25%，而大肠杆菌仅为5%． d）蛋白更新慢，容受性比较大 e）蛋白酶的降解作用比较低，产物比较均一．
蓝藻质粒的特点 a）双向载体（需要两种Ori）． b）合适的选择标记． c）分子大小合适． d）拷贝高．
蓝藻质粒载体pAQE17的构建
部分缺失的Lac操纵子片段，并在Lac Z’区组装了MCS．
pUC 18-19多克隆位点
3）pBluescript M13： 含有M13噬菌体DNA复制起点的载
体，该起点以互为相反方向插入到含有T3和T7噬菌体启动
子的一个来自pUC质粒的载体当中．
pBluescript M13多克隆位点
4）Ti质粒载体
染 色 体 和 质 粒 DNA 兼 有 的 载 体 （ Chrosmid vector）
基因整合平台系统 ＹＡＣ克隆载体
其它克隆载体
2.2 按克隆载体的用途分类
cDNA克隆载体：λgt11，pT7T3 原核（Prokaryotic）表达载体：pKK223-3 原核基因融合（Prokaryoti源自文库 gene fusion）载体：
3.５ 农杆菌Ti质粒载体的构建
设计原理: 保留T-DNA两侧的边界序列,插入选择 性标记,除去致瘤基因和无关基因.
共整合质粒载体: 将T-DNA区段编码致瘤基因和 冠瘿碱合成酶的基因由pBR322上的一段DNA片 段取代,当携带目的基因片段的pBR322衍生中 间载体进入农杆菌细胞后,两者相同的pBR322 序列之间发生同源交换,导致外源目的基因片 段整合到Ti质粒上.
基因克隆载体的特 点、分类和表达
具备与外源DNA片段连接和重组的克隆位点．
进入受体细胞后能稳定存在于细胞质中或与染 色体整合在一起．
在宿主细胞或受体细胞中自我复制或随整合的 受体细胞染色体DNA一起复制．
外源基因能在受体细胞中表达．
克隆载体进入细胞后有可供选择标记．
２ 克隆载体的分类 2.1 按构建克隆载体DNA的来源分类
可转移性：质粒可通过接合作用等方式转移到新 的宿主细胞中．
复制性：质粒DNA分子只在宿主细胞内进行单向 复制，其复制受质粒本身和宿主细胞遗传系统的双 重控制，质粒提供复制的起始位点和核苷酸的序 列．
6）相关基因
A）COP因子：决定质粒的拷贝数，在质粒的复制过程中指令细 胞合成阻物，当质粒复制到一定的拷贝时，阻物的量也积 累到足以阻止质粒的复制．
外源片段共整合到Ti质粒上的过程
双向载体：由两 个以上的质粒构 建而成. 将Ti 质粒的Vir与广宿 主范围质粒的携 带目的基因 (MCS)、选择性标 记、转移和复制 功能整合在 一 起.双向载体可在 大肠杆菌和农杆 菌中进行 复制 并稳定存在下 去．
双向Ti质粒载体的构建
第三节 噬菌体衍生的克隆载体
E）抗性基因：抗菌素抗性基因，Apr，Tcr． F）产毒素基因：大肠杆菌素基因（Col-质粒）． G）降解基因：降解重金属、有机物和农药等．
H) 致瘤基因：诱导某些组织形成肿瘤，如Ti质粒，Ri质粒．
２ 几种常见的质粒载体
１）pBR322：含有双抗基因（Apr，Tcr）Col E1 复制起始子
2）pUC18-19：含有pBR322的Apr基因和复制的起始点，
B）Rep基因：在质粒的复制过程中，Replication基因会指令宿 主细胞合成一种调节蛋白，促进质粒的复制．
C）Inc基因：决定两种亲缘关系相近的两种质粒不能存在于同 一宿主细胞中．
D）Tra基因：指令宿主细胞合成菌毛（Pilus）和细胞表面物， 促使宿主细胞与受体细胞表面结合，遗传物质的转移．
pGEX-2T，pGEX-3X 真核（Eukaryotic）表达载体：pSVK3，pBPV 转录（Transcription）载体：pSL1190 普通载体（General vector）：pBR322，pUC18
第二节 质粒克隆载体
１ 质粒载体的一般特性
质粒是一种广泛存在于 细菌细胞中染色体以 外 的能自主复制的裸露的 环状双链DNA分子，比 病毒更简单。在霉菌、 蓝藻、酵母和一些动植 物细胞中也发现了质粒， 目前对细菌的质粒研究 得比较深入。
• 噬菌体质粒载体 双链DNA噬菌体载体：λ 单链DNA噬菌体载体：M13，T3，T7
• 病毒载体 植物病毒载体CaMV（花椰菜花斑病病毒） 动物病毒载体 SV40（猿猴空泡病毒）
质粒和噬菌体DNA兼有的载体 Phasmid 载体（含有f1 噬菌体的ori） Cosmid 载体（含有λDNA的Cos区）
１ λ噬菌体克隆载体
１.1λ噬菌体的一般特性 λ噬菌体的组成
结构：外壳蛋白 DNA
形态：头部 尾部
3.2 pBR322质粒载体的构建
３.3 pUC18-19 质粒载体的构建
以pBR322为出发质粒，用含乳糖操纵子O、P和Z’ 的DNA片段取代pBR322上的Tcr基因，并在Z’区组 入一个多克隆位点．
pUC18-19的构建
3.４ 蓝藻质粒载体的构建
蓝藻作为受体细胞的特点 a）原核生物，能进行光合作用，具有固氮能力． b）基因组简单，50%的蓝藻含有质粒．
病毒区基因及功能
Ti质粒T-DNA的边界序列
３ 质粒载体的构建
3.1 质粒构建的基本要求
1）构建的质粒载体能转化受体细胞,并在其中进行 松弛型复制. * 选择松弛型质粒复制起始子(Ori)
2) 构建的质粒载体含有克隆外源DNA的位点(MCS) *构建的质粒载体含有选择标记基因(Apr,Tcr,Kmr) *构建的质粒载体分子量小,转化效率高,插入外 源片段较大.
质粒载体的一般特性
质粒的组成与构型 细胞内：超螺旋环状共价双链DNA分子
细胞外：超螺旋、开环，线形
双螺旋共价闭合 环（超螺旋）
开环双螺旋 （一个裂口）
线状双螺旋 （两个裂口）
质粒DNA分子的大小：细菌质粒的大小相差较大， 小的仅不足1kb，大的可达数百kb.
不相容性（Incompatible）：两种类似的但又不 同的质粒不能存在于同一细胞中．
c）细胞大（10-10于E.coli）储藏蛋白多，单一蛋白可达
25%，而大肠杆菌仅为5%． d）蛋白更新慢，容受性比较大 e）蛋白酶的降解作用比较低，产物比较均一．
蓝藻质粒的特点 a）双向载体（需要两种Ori）． b）合适的选择标记． c）分子大小合适． d）拷贝高．
蓝藻质粒载体pAQE17的构建
部分缺失的Lac操纵子片段，并在Lac Z’区组装了MCS．
pUC 18-19多克隆位点
3）pBluescript M13： 含有M13噬菌体DNA复制起点的载
体，该起点以互为相反方向插入到含有T3和T7噬菌体启动
子的一个来自pUC质粒的载体当中．
pBluescript M13多克隆位点
4）Ti质粒载体
染 色 体 和 质 粒 DNA 兼 有 的 载 体 （ Chrosmid vector）
基因整合平台系统 ＹＡＣ克隆载体
其它克隆载体
2.2 按克隆载体的用途分类
cDNA克隆载体：λgt11，pT7T3 原核（Prokaryotic）表达载体：pKK223-3 原核基因融合（Prokaryoti源自文库 gene fusion）载体：
3.５ 农杆菌Ti质粒载体的构建
设计原理: 保留T-DNA两侧的边界序列,插入选择 性标记,除去致瘤基因和无关基因.
共整合质粒载体: 将T-DNA区段编码致瘤基因和 冠瘿碱合成酶的基因由pBR322上的一段DNA片 段取代,当携带目的基因片段的pBR322衍生中 间载体进入农杆菌细胞后,两者相同的pBR322 序列之间发生同源交换,导致外源目的基因片 段整合到Ti质粒上.
基因克隆载体的特 点、分类和表达
具备与外源DNA片段连接和重组的克隆位点．
进入受体细胞后能稳定存在于细胞质中或与染 色体整合在一起．
在宿主细胞或受体细胞中自我复制或随整合的 受体细胞染色体DNA一起复制．
外源基因能在受体细胞中表达．
克隆载体进入细胞后有可供选择标记．
２ 克隆载体的分类 2.1 按构建克隆载体DNA的来源分类
可转移性：质粒可通过接合作用等方式转移到新 的宿主细胞中．
复制性：质粒DNA分子只在宿主细胞内进行单向 复制，其复制受质粒本身和宿主细胞遗传系统的双 重控制，质粒提供复制的起始位点和核苷酸的序 列．
6）相关基因
A）COP因子：决定质粒的拷贝数，在质粒的复制过程中指令细 胞合成阻物，当质粒复制到一定的拷贝时，阻物的量也积 累到足以阻止质粒的复制．
外源片段共整合到Ti质粒上的过程
双向载体：由两 个以上的质粒构 建而成. 将Ti 质粒的Vir与广宿 主范围质粒的携 带目的基因 (MCS)、选择性标 记、转移和复制 功能整合在 一 起.双向载体可在 大肠杆菌和农杆 菌中进行 复制 并稳定存在下 去．
双向Ti质粒载体的构建
第三节 噬菌体衍生的克隆载体
E）抗性基因：抗菌素抗性基因，Apr，Tcr． F）产毒素基因：大肠杆菌素基因（Col-质粒）． G）降解基因：降解重金属、有机物和农药等．
H) 致瘤基因：诱导某些组织形成肿瘤，如Ti质粒，Ri质粒．
２ 几种常见的质粒载体
１）pBR322：含有双抗基因（Apr，Tcr）Col E1 复制起始子
2）pUC18-19：含有pBR322的Apr基因和复制的起始点，
B）Rep基因：在质粒的复制过程中，Replication基因会指令宿 主细胞合成一种调节蛋白，促进质粒的复制．
C）Inc基因：决定两种亲缘关系相近的两种质粒不能存在于同 一宿主细胞中．
D）Tra基因：指令宿主细胞合成菌毛（Pilus）和细胞表面物， 促使宿主细胞与受体细胞表面结合，遗传物质的转移．
pGEX-2T，pGEX-3X 真核（Eukaryotic）表达载体：pSVK3，pBPV 转录（Transcription）载体：pSL1190 普通载体（General vector）：pBR322，pUC18
第二节 质粒克隆载体
１ 质粒载体的一般特性
质粒是一种广泛存在于 细菌细胞中染色体以 外 的能自主复制的裸露的 环状双链DNA分子，比 病毒更简单。在霉菌、 蓝藻、酵母和一些动植 物细胞中也发现了质粒， 目前对细菌的质粒研究 得比较深入。