基因克隆常用的方法PPT演示文稿
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基因的克隆方法ppt课件
1）直接从基因组中扩增过程： （1）提取基因组DNA作模板 （2）根据目的基因序列设计引物 （3）PCR扩增及产物鉴定
31
提取基因组DNA
PCR引物设计
PCR扩增
基因序列分析
此法适合扩增原 核生物基因。
真核生物基因组含有内含子32 ！
2）从mRNA中扩增: RT-PCR
（1）提取基因组 total RNA （2）反转录合成总cDNA作模板 （3）根据目的基因序列设计引物 （4）PCR扩增及序列分析
工作量大。 无法定量研究。 扩出的条带往往是3`端比较短的UTR区的一
段序列，提供的信息较少。
19
优点：
简便、灵敏、高效、省时，能快速显示 mRNA的组成。
所需的mRNA量少。 各样本mRNA的差异可同时进加标签的基因克隆 方法野生株构建基因组 基因苗构建基因组文 库基因苗
阳性克隆
获得阳性克隆 目的基因
基因序列分析，24 确定为基因
转座子标签法
转座子又称转座因子或者跳跃因子，实 际上也是DNA片段，它可以在生物的染色 体组中移动，从染色体的一个位点跳到另 一个位点，或从一条染色体跳到另一条染 色体上，引起基因功能的改变。
mRNA
5` RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
TTTTTTTTTT
G
3`
15
mRNA
5` RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
TTTTTTTTTT
G
3`
AATTTTTTTT ACTTTTTTTT AGTTTTTTTT TATTTTTTTT
TCTTTTTTTT TGTTTTTTTT CATTTTTTTT CCTTTTTTTT CGTTTTTTTT GATTTTTTTT
31
提取基因组DNA
PCR引物设计
PCR扩增
基因序列分析
此法适合扩增原 核生物基因。
真核生物基因组含有内含子32 ！
2）从mRNA中扩增: RT-PCR
（1）提取基因组 total RNA （2）反转录合成总cDNA作模板 （3）根据目的基因序列设计引物 （4）PCR扩增及序列分析
工作量大。 无法定量研究。 扩出的条带往往是3`端比较短的UTR区的一
段序列，提供的信息较少。
19
优点：
简便、灵敏、高效、省时，能快速显示 mRNA的组成。
所需的mRNA量少。 各样本mRNA的差异可同时进加标签的基因克隆 方法野生株构建基因组 基因苗构建基因组文 库基因苗
阳性克隆
获得阳性克隆 目的基因
基因序列分析，24 确定为基因
转座子标签法
转座子又称转座因子或者跳跃因子，实 际上也是DNA片段，它可以在生物的染色 体组中移动，从染色体的一个位点跳到另 一个位点，或从一条染色体跳到另一条染 色体上，引起基因功能的改变。
mRNA
5` RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
TTTTTTTTTT
G
3`
15
mRNA
5` RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
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G
3`
AATTTTTTTT ACTTTTTTTT AGTTTTTTTT TATTTTTTTT
TCTTTTTTTT TGTTTTTTTT CATTTTTTTT CCTTTTTTTT CGTTTTTTTT GATTTTTTTT
植物基因克隆的方法课件PPT
素合成酶基因。
技术支持：
差别筛选法（differential screening） 扣除杂交技术（subtractive hybridization） mRNA差异显示技术（ mRNA differential
display reverse transcription-PCR） 代表性差异显示（representational difference
1.2根据基因的表型突变互补功能
植物的许多基因与细菌或酵母的突变 能的mRNA序列,据此合成寡核苷酸探针从文
地分离了编码天麻抗真菌蛋白基因cDNA 记(EST)寻找新基上
◆ 此种方法只需检测基因表达库中每一cDNA的很短序列(9bp),建立基因表达图,根据基因表达图就可以发现新基因. 用植物偏爱的密码子，人工合成并克 1、筛选与目标基因连锁的分子标记
6、外显子的分离、鉴定
阳性克隆这些候选基因，再进行分离，时空 表达特点，同源性比较等分析确定目的基因。
定位克隆的优点和局限性
优点：不必知道基因产物的功能，也不需要
知道产生某表型的生化、生理和病理过程。 局限性：1、基因定位依赖分子标记。
未消失，发生转座的只是转座子的拷贝。 能的mRNA序列,据此合成寡核苷酸探针从文
1、筛选与目标基因连锁的分子标记 增，扩增的片段经纯化后连接到合适的
基因发生转座可引起插入突变，使插入位 3、构建目的基因区域跨叠克隆（contig）
常用载体：柯斯质粒、酵母人工染色体（YAC）、PI、BAC、PAC等。 要求分离一个纯度很高的蛋白质.
的隆插该入 基和因嵌。合来克隆置基因的。 基因失活并诱导产生突变型或在插入
常用载体：柯斯质粒、酵母人工染色体（YAC）、PI、BAC、PAC等。 能的mRNA序列,据此合成寡核苷酸探针从文
技术支持：
差别筛选法（differential screening） 扣除杂交技术（subtractive hybridization） mRNA差异显示技术（ mRNA differential
display reverse transcription-PCR） 代表性差异显示（representational difference
1.2根据基因的表型突变互补功能
植物的许多基因与细菌或酵母的突变 能的mRNA序列,据此合成寡核苷酸探针从文
地分离了编码天麻抗真菌蛋白基因cDNA 记(EST)寻找新基上
◆ 此种方法只需检测基因表达库中每一cDNA的很短序列(9bp),建立基因表达图,根据基因表达图就可以发现新基因. 用植物偏爱的密码子，人工合成并克 1、筛选与目标基因连锁的分子标记
6、外显子的分离、鉴定
阳性克隆这些候选基因，再进行分离，时空 表达特点，同源性比较等分析确定目的基因。
定位克隆的优点和局限性
优点：不必知道基因产物的功能，也不需要
知道产生某表型的生化、生理和病理过程。 局限性：1、基因定位依赖分子标记。
未消失，发生转座的只是转座子的拷贝。 能的mRNA序列,据此合成寡核苷酸探针从文
1、筛选与目标基因连锁的分子标记 增，扩增的片段经纯化后连接到合适的
基因发生转座可引起插入突变，使插入位 3、构建目的基因区域跨叠克隆（contig）
常用载体：柯斯质粒、酵母人工染色体（YAC）、PI、BAC、PAC等。 要求分离一个纯度很高的蛋白质.
的隆插该入 基和因嵌。合来克隆置基因的。 基因失活并诱导产生突变型或在插入
常用载体：柯斯质粒、酵母人工染色体（YAC）、PI、BAC、PAC等。 能的mRNA序列,据此合成寡核苷酸探针从文
基因的克隆与表达PPT课件
2．真核表达系统：使外源基因在真核细 胞中表达的体系。
.
32
二．原核生物基因结构和表达特点
.
33
1. 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA，其转录和翻译是偶联的连续 进行。
2. 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
.
34
3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
• PCR过程中，普通的Taq酶可在产 物的3’端多加一个A
.
17
五、基因克隆的工作流程
（一）目的基因的获得
1、直接分离3、构建cDNA4、PCR5、人工合成
6、差异显示
.
18
1、直接物的基因组DNA切割成一定大 小的片段，并与合适的载体重组后 导入宿主细胞，进行克隆。这些存 在于所有重组
11
三、受体细胞
1、定义：外源DNA导入的细胞，是 重组体扩增的场所。
2、要求：易于接纳外源DNA
无特异的内源性核酸内切酶
载体复制、扩增不受阻
与载体有互补性
.
12
四、体外重组的策略
1、粘末端连接 1）全同源粘末端连接 • 最方便简单 • 高背景-载体自身环化 • 双向插入
.
13
2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体 中的克隆策略
基因的克隆与表达
.
1
➢基因克隆(gene cloning) ➢基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
.
2
基因克 隆 Gene Cloning
.
3
➢概述 ➢克隆载体 ➢受体细胞 ➢体外重组的策略 ➢基因克隆工作流程
.
32
二．原核生物基因结构和表达特点
.
33
1. 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA，其转录和翻译是偶联的连续 进行。
2. 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
.
34
3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
• PCR过程中，普通的Taq酶可在产 物的3’端多加一个A
.
17
五、基因克隆的工作流程
（一）目的基因的获得
1、直接分离3、构建cDNA4、PCR5、人工合成
6、差异显示
.
18
1、直接物的基因组DNA切割成一定大 小的片段，并与合适的载体重组后 导入宿主细胞，进行克隆。这些存 在于所有重组
11
三、受体细胞
1、定义：外源DNA导入的细胞，是 重组体扩增的场所。
2、要求：易于接纳外源DNA
无特异的内源性核酸内切酶
载体复制、扩增不受阻
与载体有互补性
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12
四、体外重组的策略
1、粘末端连接 1）全同源粘末端连接 • 最方便简单 • 高背景-载体自身环化 • 双向插入
.
13
2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体 中的克隆策略
基因的克隆与表达
.
1
➢基因克隆(gene cloning) ➢基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
.
2
基因克 隆 Gene Cloning
.
3
➢概述 ➢克隆载体 ➢受体细胞 ➢体外重组的策略 ➢基因克隆工作流程
基因定位与克隆PPT课件
基因分布在24种染色体上，它们在染色体上的位置可通过两
种制图方法来表示：
1、物理图谱(physical map)，即确定基因之间的绝对物
理学距离，通常用Mb(百万碱基对)或Kb(千碱基对)来表示
2、遗传图谱(genetic map)，即确定基因之间的遗传学
距离，用cM(centimorgen分摩)表示。
编辑版ppt
NLM8 G
体细胞杂种法
• 体细胞杂种通常由人和鼠的体细胞融合而成。这些 融合细胞在最初几代培养过程中具有选择性丢失人 类染色体趋势，而保留所有的鼠染色体。
• 保留在融合细胞中的染色体可以是多条，也可能只 有一条甚至某条染色体的一部分。
• 根据研究的需要可将含有不同人类染色体的人鼠杂 种细胞组合成人鼠杂种细胞板(hybrid panel)，结 合杂种细胞板和PCR的方法或基因剂量分析，或蛋 白质表达分析，可将相应的基因定位到特定的染色 体或染色体片段上，该杂种细胞板在人类基因定位 以及人类基因组计划中发挥过重要的作用。
• 染色体多态法（chromosome heteromorphism） • 染色体畸变法(chromosome abnormality) • 体细胞杂种法(somatic cell hybrids) • 染色体分类法(chromosome sorting ) • 原位杂交法（FISH） • 剂量分析法(dosage ananlysis) • 测序法（sequencing） • 家系分析法 （pedigree ananlysis）
编辑版ppt
13
连锁分析原理
生殖细胞在减数分裂时发生交换，一对同源染色体 上存在着两两相邻的基因座位，若两者之间距离较 远，发生交换的机会较多，则出现重组次数就多； 若两者之间距离较近，则重组机会较少。
T-A基因克隆的技术要点.ppt
8）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面。
Page ▪ 14
外源DNA的重组与转化
▪DNA的体外连接重组
▪ 其本质是一个酶促反应过程，即在一定的条件下，DNA连接酶 催化两个双链DNA片段的5’端磷酸和3’端羟基之间相互作用， 形成磷酸二酯键的过程。
▪ DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶 大肠杆菌DNA连接酶。
▪ lacZ 编码半乳糖苷酶的N端，它可以和宿主菌株产生的半乳糖苷酶C端互
补，形成有活性的β-半乳糖苷酶。
▪ Xgal 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 ，β–半乳糖苷酶的底物，水解后呈
蓝色
▪ IPTG 异丙基硫代半21
蓝白斑
Page ▪ 22
T-A基因克隆的技术要点.ppt
Page ▪ 2
Page ▪ 3
3’-A突出的PCR产物
▪ 使用不同的Taq酶，在PCR扩增循环结束后，加上72℃10分钟 一个过程，Taq酶可以在扩增产物的3末端加上A 。
▪ 使用高保真的DNA聚合酶，如pfu酶，其不能在扩增产物的3 末端加上A，得到的DNA序列为钝端，因此，在回收纯化后进 行加A的过程，通常是以PCR回收产物为模板，加上一定量的 普通Taq酶和反应液，加入dATP（或dNTP）， 72℃ 10分钟 。
混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于细 胞表面，经42˚C短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物 。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化 过程中获得新的表型（如Amp+等）得到表达，然后将此细菌 培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上进行培养获得阳 性克隆。
Page ▪ 17
▪ 如果使用ddTTP，效果会更好。
Page ▪ 14
外源DNA的重组与转化
▪DNA的体外连接重组
▪ 其本质是一个酶促反应过程，即在一定的条件下，DNA连接酶 催化两个双链DNA片段的5’端磷酸和3’端羟基之间相互作用， 形成磷酸二酯键的过程。
▪ DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶 大肠杆菌DNA连接酶。
▪ lacZ 编码半乳糖苷酶的N端，它可以和宿主菌株产生的半乳糖苷酶C端互
补，形成有活性的β-半乳糖苷酶。
▪ Xgal 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 ，β–半乳糖苷酶的底物，水解后呈
蓝色
▪ IPTG 异丙基硫代半21
蓝白斑
Page ▪ 22
T-A基因克隆的技术要点.ppt
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3’-A突出的PCR产物
▪ 使用不同的Taq酶，在PCR扩增循环结束后，加上72℃10分钟 一个过程，Taq酶可以在扩增产物的3末端加上A 。
▪ 使用高保真的DNA聚合酶，如pfu酶，其不能在扩增产物的3 末端加上A，得到的DNA序列为钝端，因此，在回收纯化后进 行加A的过程，通常是以PCR回收产物为模板，加上一定量的 普通Taq酶和反应液，加入dATP（或dNTP）， 72℃ 10分钟 。
混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于细 胞表面，经42˚C短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物 。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化 过程中获得新的表型（如Amp+等）得到表达，然后将此细菌 培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上进行培养获得阳 性克隆。
Page ▪ 17
▪ 如果使用ddTTP，效果会更好。
基因克隆PPT课件
（1）构建 由 pBR 质 粒 与 M13 噬 菌 体 构 建 成 的 双 链 DNA质粒载体，长2674bp，1983年构建。
.
14
主要特点：氨苄青霉素抗性基因、lac Z基因、
复制起始点（ori）
.
15
（2）筛选原理及方法
含 有 来 自 大 肠 杆 菌 的 lacZ 操 纵 子 的 DNA 片 段 （lacZ基因），编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个片 段。此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖 苷酶实现基因内互补（α互补），形成完整的β-半乳 糖苷酶。该酶能分解X-gal，形成蓝色菌落。
基因工程及体外表达体系 （2）.载体
心血管病研究所 王佐
.
1
一、概述
外源DNA一般没有明显的遗传标志，如果 将其导入宿主细胞，没有有效的方法将导 入了外源DNA的细胞和未导入外源DNA的 细胞区分开来。
外源DNA导入宿主细胞后，不能随宿主细 胞的繁殖而复制，达不到使外源DNA片段 扩增的目的。
.
2
.
35
YAC载体序列包括着丝粒序列（CEN1）、端粒序列（TEL 使
线形DNA的完全复制和保护染色体末端免于核酸酶的降解）、
自主复制序列（ARS1 主导染色体DNA的自主复制）、氨苄青
霉素抗性基因（Amp）、源于E.coli的复制起始区（ori）。
.
36
由于酵母细胞内真正必需的DNA片段主要 限于几百碱基对，因而就可以用酵母染色体 复 制 子 ARS 元 件 构 建 新 型 的 克 隆 载 体 。
.
21
λ噬菌体载体在细菌中以溶菌状态生长。它有两种 形式：插入载体和替代载体。
DNA与λ噬菌体载体组成重组DNA分子后，还不能直接 转染宿主细胞，必须首先包装成有活性的成熟噬菌体颗粒 后才具有转染宿主细胞的能力，重组DNA分子能否被噬菌 体包装蛋白、头部所识别而被包装，除必须含有cos位点 外，就是对重组DNA分子长度有严格的限制，必须不能大 于野生型基因组长度的105％或小于75％，否则均不能被 包装成有活性的噬菌体颗粒，因此噬菌体载体大致允许插 入外源基因的长度范围为15～25kb。
.
14
主要特点：氨苄青霉素抗性基因、lac Z基因、
复制起始点（ori）
.
15
（2）筛选原理及方法
含 有 来 自 大 肠 杆 菌 的 lacZ 操 纵 子 的 DNA 片 段 （lacZ基因），编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个片 段。此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖 苷酶实现基因内互补（α互补），形成完整的β-半乳 糖苷酶。该酶能分解X-gal，形成蓝色菌落。
基因工程及体外表达体系 （2）.载体
心血管病研究所 王佐
.
1
一、概述
外源DNA一般没有明显的遗传标志，如果 将其导入宿主细胞，没有有效的方法将导 入了外源DNA的细胞和未导入外源DNA的 细胞区分开来。
外源DNA导入宿主细胞后，不能随宿主细 胞的繁殖而复制，达不到使外源DNA片段 扩增的目的。
.
2
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35
YAC载体序列包括着丝粒序列（CEN1）、端粒序列（TEL 使
线形DNA的完全复制和保护染色体末端免于核酸酶的降解）、
自主复制序列（ARS1 主导染色体DNA的自主复制）、氨苄青
霉素抗性基因（Amp）、源于E.coli的复制起始区（ori）。
.
36
由于酵母细胞内真正必需的DNA片段主要 限于几百碱基对，因而就可以用酵母染色体 复 制 子 ARS 元 件 构 建 新 型 的 克 隆 载 体 。
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21
λ噬菌体载体在细菌中以溶菌状态生长。它有两种 形式：插入载体和替代载体。
DNA与λ噬菌体载体组成重组DNA分子后，还不能直接 转染宿主细胞，必须首先包装成有活性的成熟噬菌体颗粒 后才具有转染宿主细胞的能力，重组DNA分子能否被噬菌 体包装蛋白、头部所识别而被包装，除必须含有cos位点 外，就是对重组DNA分子长度有严格的限制，必须不能大 于野生型基因组长度的105％或小于75％，否则均不能被 包装成有活性的噬菌体颗粒，因此噬菌体载体大致允许插 入外源基因的长度范围为15～25kb。
第6章目的基因的分离克隆(植物基因工程)课件
一条互补DNA，即第一条 DNA链 ， 形 成 RNA- DNA 杂合双链。然后合成第2 条链。
12
13
14(2) 如何从cDNA中找到所需要的基因？15转录水平上的基因克隆方法
l 差别杂交筛选 l 扣除杂交 l 代表性差别分析 l 差异显示 l cDNA阵列杂交 l 基因表达系列分析 l 抑制差减杂交
筛选目的基因(核酸探针法、免疫结合法)因库应当能包括全部的基因组序 列。如果每一个克隆包括的DNA片段大，则总 克隆数目少，常选择能接受较大片段的载体。 令检测是否包括一个完整的基因组序列的公式：
令例:人类基因组3.0x106kb, 以λEMBL作载体， 插入片段的平均长度为17kb ，p为99%时, 基因 库应有8.1x105 个 重组噬菌体。
21
22
n基于EST信息的基因克隆
EST
23
由杨树EST库获得基因序列
PCNA
24
克隆的核酸酶
25
26
2、基因组水平上的克隆
将ry) ：将某种生物的基因组DNA切割成 一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进 行克隆。这些存在于所有重组
➢差别杂交筛选
含有表达 目的基因
不含有表 达目的基因cDNA 铺平板转膜 转膜提取分离 mRNA
cDNA 探针
提取分离 mRNA
cDNA 探针
比较 分析
用对照样品cDNA作探 针杂交的X光片中没有 而在检测样品cDNA作 探针杂交的X光片中有 的印斑，可对照X光片 从原平板挑出菌落进行 鉴定是否含有目的基因
31
菌落杂交技术寻找目标DNA克隆
32
文 库 的 抗 体 筛 选
33
(2) T-DNA标签克隆基因
12
13
14(2) 如何从cDNA中找到所需要的基因？15转录水平上的基因克隆方法
l 差别杂交筛选 l 扣除杂交 l 代表性差别分析 l 差异显示 l cDNA阵列杂交 l 基因表达系列分析 l 抑制差减杂交
筛选目的基因(核酸探针法、免疫结合法)因库应当能包括全部的基因组序 列。如果每一个克隆包括的DNA片段大，则总 克隆数目少，常选择能接受较大片段的载体。 令检测是否包括一个完整的基因组序列的公式：
令例:人类基因组3.0x106kb, 以λEMBL作载体， 插入片段的平均长度为17kb ，p为99%时, 基因 库应有8.1x105 个 重组噬菌体。
21
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n基于EST信息的基因克隆
EST
23
由杨树EST库获得基因序列
PCNA
24
克隆的核酸酶
25
26
2、基因组水平上的克隆
将ry) ：将某种生物的基因组DNA切割成 一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进 行克隆。这些存在于所有重组
➢差别杂交筛选
含有表达 目的基因
不含有表 达目的基因cDNA 铺平板转膜 转膜提取分离 mRNA
cDNA 探针
提取分离 mRNA
cDNA 探针
比较 分析
用对照样品cDNA作探 针杂交的X光片中没有 而在检测样品cDNA作 探针杂交的X光片中有 的印斑，可对照X光片 从原平板挑出菌落进行 鉴定是否含有目的基因
31
菌落杂交技术寻找目标DNA克隆
32
文 库 的 抗 体 筛 选
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(2) T-DNA标签克隆基因
基因的克隆PPT课件
载体的种类
质粒
1.大肠杆菌质粒 2.革兰氏阳性菌的质粒
噬菌体 真核细胞为宿主的克隆载体
1.酵母为宿主的载体 2.植物细胞为宿主的载体 3.DNA病毒载体
反转录病毒载体
大肠杆菌的质粒
pBR322质粒：它是由4361个核苷酸组成，属于松弛型质粒， 可以用抗氨苄西林和抗四环素基因作为标记，具有多种常用 内切酶的切点。
基因表达产物的鉴定
基因表达：指某基因在细胞中转录为mRNA继而翻译 成蛋白质的过程。
DNA
RNA
Protein
转录
翻译
研究基因表达的手段
1、RT-PCR (RNA) 2、Northern blot (RNA) 3、Western blot (蛋白质） 4、免疫组化 （蛋白质）
1、RT-PCR
基因的克隆 -----ＤＮＡ重组技术。
克隆：是用无性繁殖的方法产生一组遗传上相同的细 胞或生物群体的过程，而这些细胞或个体均来自无性 繁殖的单一原型细胞。
基因的克隆:用ＤＮＡ重组技术使一个基因或ＤＮＡ片 段产生出很多相同拷贝的过程。
基因克隆的技术路线的大体步骤
得出结论
步骤三： 步骤二： 步骤一：
多 克 隆 位 点
X-gal ：5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-半乳糖苷
表示 外源 基因 插入 编码 半乳 糖苷 酶的 基因 区段
带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落
不对 能照 是目 培的 养基 基因 变本 色身
使用含Amp+X-Gal的琼脂糖平板筛选克隆，可能出现三种情况。 1 . 载体自身环化，产生蓝色菌落； 2 带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落。 3 未转化的细胞，不能生长。
目的基因插入 到抗四环素基 因的位置，则 导入菌体后的 菌株则不能在 有四环素的培 养基上生长
植物分子生物学植物基因的同源克隆PowerPoint 演示文稿
18
植物总RNA提取的难点 1.内外源RNase的污染。 2.多酚类物质的干扰 3.蛋白质的干扰 4.多糖的干扰
19
创造一个无RNase的环境
20
1.器械的消毒：用0.1%DEPC—二乙基焦碳酸盐 （Diethyl Pyrocarbonate )浸泡处理2hr以上， 然后高压灭菌去除DEPC；或高温（250℃） 干热消毒4hr以上或200℃干热消毒过夜。
9
植物DNA提取的难点
1.多酚类物质的干扰:多酚类物质被氧化后，与DNA 分子发生不可逆的结合，使提取的DNA样品呈棕 褐色。
2.多糖类物质的干扰：多糖与DNA形成粘稠的胶状 复合物，DNA被包埋在这种复合物中难于溶解。
3.其它次生物质的干扰：乳胶、树脂等，与DNA共 沉淀。 这种褐色、粘稠的DNA不易被限制性内切酶和Taq DNA聚合酶所识别，从而导致PCR扩增和酶切的 失败 。
29
植物RNA提取过程中蛋白质污染的排除
30
1.在冷冻条件下研磨植物材料，以抑制 RNase的活性。 2.在提取缓冲液中加入蛋白质变性剂（苯 酚、胍、SDS、CTAB等）。 3.利用蛋白酶K降解蛋白质。 4.利用苯酚、氯仿抽提。 5.用70%高氯酸钠溶液沉淀蛋白质。
31
植物DNA和RNA的检测
5.研磨时加入大分子聚合物或吸附剂除多酚： PVP、PVPP：2-6.0%（W/V）；活性炭： 0.1-0.3%（W/V）。
13
6.高盐去多糖法：在氯仿/异戊醇的抽提后的水相 中加入0.5V的5MNaCl混匀，然后加入2V的无 水乙醇沉淀DNA，大部分多糖留在上清液中； 在DNA的水溶液中，加入5MNaCl使其终浓度 为0.5-3.0M，以2.0M除糖效果最好。
植物基因的同源克隆
植物总RNA提取的难点 1.内外源RNase的污染。 2.多酚类物质的干扰 3.蛋白质的干扰 4.多糖的干扰
19
创造一个无RNase的环境
20
1.器械的消毒：用0.1%DEPC—二乙基焦碳酸盐 （Diethyl Pyrocarbonate )浸泡处理2hr以上， 然后高压灭菌去除DEPC；或高温（250℃） 干热消毒4hr以上或200℃干热消毒过夜。
9
植物DNA提取的难点
1.多酚类物质的干扰:多酚类物质被氧化后，与DNA 分子发生不可逆的结合，使提取的DNA样品呈棕 褐色。
2.多糖类物质的干扰：多糖与DNA形成粘稠的胶状 复合物，DNA被包埋在这种复合物中难于溶解。
3.其它次生物质的干扰：乳胶、树脂等，与DNA共 沉淀。 这种褐色、粘稠的DNA不易被限制性内切酶和Taq DNA聚合酶所识别，从而导致PCR扩增和酶切的 失败 。
29
植物RNA提取过程中蛋白质污染的排除
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1.在冷冻条件下研磨植物材料，以抑制 RNase的活性。 2.在提取缓冲液中加入蛋白质变性剂（苯 酚、胍、SDS、CTAB等）。 3.利用蛋白酶K降解蛋白质。 4.利用苯酚、氯仿抽提。 5.用70%高氯酸钠溶液沉淀蛋白质。
31
植物DNA和RNA的检测
5.研磨时加入大分子聚合物或吸附剂除多酚： PVP、PVPP：2-6.0%（W/V）；活性炭： 0.1-0.3%（W/V）。
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6.高盐去多糖法：在氯仿/异戊醇的抽提后的水相 中加入0.5V的5MNaCl混匀，然后加入2V的无 水乙醇沉淀DNA，大部分多糖留在上清液中； 在DNA的水溶液中，加入5MNaCl使其终浓度 为0.5-3.0M，以2.0M除糖效果最好。
植物基因的同源克隆
克隆载体表达载体(课件)PPT课件
详细描述
组成型表达载体是将基因整合到宿主细胞的染色体上，使基因在任何生长条件下都能稳定表达。这种 表达载体适用于需要持续稳定表达的基因。
组织特异性表达载体
总结词
在特定的组织或器官中，表达载体才能 启动基因的表达。
VS
详细描述
组织特异性表达载体是将基因与特定的组 织或器官相关的调控序列结合，使基因只 在特定的组织或器官中表达。这种表达载 体适用于需要组织特异性表达的基因。
05
克隆载体和表达载体的未来发展
克隆载体和表达载体的新技术和新方法
基因编辑技术
利用CRISPR-Cas9等基因编辑技术，实现对克隆载体和表达载体的精确修饰，提高基 因治疗的效率和安全性。
人工染色体技术
开发人工染色体技术，实现对大型基因组的克隆和表达，为遗传病研究和治疗提供新的 工具。
克隆载体和表达载体的新应用和新领域
04
克隆载体和表达载体的应用
克隆载体在基因工程中的应用
基因克隆
克隆载体可以将目的基因插入到质粒 或病毒载体中，实现基因的复制和扩 增，为基因工程提供大量目的基因。
基因保存
基因突变
通过将目的基因插入到克隆载体中， 进行定点突变或随机突变，研究基因 功能和蛋白质活性。
克隆载体可以保存和传递目的基因， 为基因工程提供长期稳定的基因来源。
01
02
03
基因治疗
利用克隆载体和表达载体， 开发新型基因治疗策略， 针对遗传性疾病、肿瘤等 进行有效治疗。
生物制药
通过克隆载体和表达载体， 实现高效、大规模的蛋白 质药物生产，推动生物制 药产业的发展。
农业育种
利用克隆载体和表达载体， 培育抗逆、抗病、高产的 农作物新品种，提高农业 生产效益。
组成型表达载体是将基因整合到宿主细胞的染色体上，使基因在任何生长条件下都能稳定表达。这种 表达载体适用于需要持续稳定表达的基因。
组织特异性表达载体
总结词
在特定的组织或器官中，表达载体才能 启动基因的表达。
VS
详细描述
组织特异性表达载体是将基因与特定的组 织或器官相关的调控序列结合，使基因只 在特定的组织或器官中表达。这种表达载 体适用于需要组织特异性表达的基因。
05
克隆载体和表达载体的未来发展
克隆载体和表达载体的新技术和新方法
基因编辑技术
利用CRISPR-Cas9等基因编辑技术，实现对克隆载体和表达载体的精确修饰，提高基 因治疗的效率和安全性。
人工染色体技术
开发人工染色体技术，实现对大型基因组的克隆和表达，为遗传病研究和治疗提供新的 工具。
克隆载体和表达载体的新应用和新领域
04
克隆载体和表达载体的应用
克隆载体在基因工程中的应用
基因克隆
克隆载体可以将目的基因插入到质粒 或病毒载体中，实现基因的复制和扩 增，为基因工程提供大量目的基因。
基因保存
基因突变
通过将目的基因插入到克隆载体中， 进行定点突变或随机突变，研究基因 功能和蛋白质活性。
克隆载体可以保存和传递目的基因， 为基因工程提供长期稳定的基因来源。
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基因治疗
利用克隆载体和表达载体， 开发新型基因治疗策略， 针对遗传性疾病、肿瘤等 进行有效治疗。
生物制药
通过克隆载体和表达载体， 实现高效、大规模的蛋白 质药物生产，推动生物制 药产业的发展。
农业育种
利用克隆载体和表达载体， 培育抗逆、抗病、高产的 农作物新品种，提高农业 生产效益。
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图３真核生物12种mRNA的序列特点
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根据这12种mRNA序列可合成12种相应的反转录引物，即 M’N’TTTTTTTT……,用其分别进行反转录,即可将所有mRNA分类合成 12种cDNA(于12个试管内)，然后再用随机引物,以这12种cDNA分别做 模板进行PCR扩增(见图1和图4)，那么与表型相关的mRNA就很容易被 发现并克隆出来。但不论AP-PCR还是DD-PCR,都适用于2种种源近似生 物或不同发育阶段的同一个体之间的比较。因而,其PCR的模板必须是 来自2个生物或同一生物的不同发育阶段的mRNA。DD-PCR的优点是快 速、方便,可以检测表达量极低的mRNA，但其技术条件要求较高，所 扩增的mRNA的质量不能有差异,即mRNA不应降解。目前这一方法已广 泛应用于生物表型相关基因的克隆及比较研究。
2
目前,以Genbank的应用最频繁。这些基因库是相互联 系的,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。 要克隆某个基因可首先通过Internet查询一下该基因或相 关库中拿出来,根据整 个基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基 因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。值得注意的是,由于物 种和分离株之间的差异,为了保证PCR扩增的准确性,有必 要采用两步扩增法,即nested PCR。
基因克隆的几种常用方法
根据已知序列克隆基因 未知序列的基因打靶 根据已知探针克隆基因 用特异抗体克隆基因 特异基因的功能克隆
1
1、根据已知序列克隆基因
对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因 序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。 目前,世界上主要的基因库有: (1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,
6
3 未知序列的基因打靶
根据已知序列进行基因克隆,多数是重复 别人的工作,或者是在别人工作的基础上继 续自己的工作,因而不存在新基因的克隆过 程。对未知序列的基因克隆才是真正的创 造性研究。
7
3．1 随机引物法克隆未知序列基因
随机引物PCR(arbitrarily primed PCR,AP-PCR)首先被用于基因组DNA或
另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究,所使用的 PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测(reading proof)功能的酶,如pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点
突变或终止密码子而导致整个研究结论的错误。
5
2 根据已知探针克隆基因
这也是基因克隆的一种较直接的方法。首先将探针作放 射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理的基因组 DNA杂交,最后将所识别的片段从胶中切下来，克隆到特定 的载体(质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这 种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基 因组中的拷贝数。但在探针杂交后,要注意高强度(high stringent)漂洗,以避免干扰信号,即保证克隆的特异性,同时节 省时间。
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3.2 Differential display PCR(DD-PCR)
DD-PCR是在AP-PCR基础上发明的一种RT-PCR 方法,主要用于2种或多种类似生物个体在基因表 达上的差异分析。其基本原理是:所有真核生物的 成熟mRNA都含有不同长度的poly+(A)尾部序列,根 据poly+(A)内部的2个核苷酸排列的不同,可以将所 有的mRNA分子分为12类(见图3)。
其网上地址为:/ebi-home.html; (2)Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库,
其网上地址为:/web/search/index.html; (3)Swissport和TREMBL,Swissport是一蛋白质序列库,其所含序列的准确 度比较高,而 TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。
其长度不超过16 nt)对不同时期的虫体mRNA进行扩增比较,即可找出导致表
型变异的遗传学依据。这种方法是一种比较PCR,它要求至少有2种来自不同
表型但又很类似的基因组DNA或mRNA。AP-PCR扩增后的产物必须99%是一
致的,只有个别特异的产物出现在特异的表型个体中。该方法对表型或种源关
系相差甚远的生物个体之间没有比较意义(见图1)。
Байду номын сангаас
8
图1 应用AP-PCR法进行2种或多种表型特征类似的个体间指纹图谱分析或表型相关基因克隆 箭头所指扩增带为特异于个体(Ⅱ)的扩增产物
9
AP-PCR的操作一般采用两步法,即前10个循环多以较低的退火温度 (annealing temperature)进行扩增,后20个循环则采用较高的退火温度扩增。APPCR产物多较短,一般需高浓度的琼脂糖凝胶检测,也可用聚丙烯酰胺凝胶检测。 如扩增的模板为mRNA,通过比较扩增产物的强度,可以得知该基因在2种生物 或同一生物不同发育阶段的表达强度。另外,在AP-PCR检测到与某一表型相关 的基因或基因产物(mRNA)以后,下一步工作就是克隆出整个基因或mRNA。主 要操作程序为:(1)AP-PCR产物的提取、克隆及序列测定。首先将AP-PCR检测 到的特定片段从凝胶中切下,提取DNA克隆到适宜的载体内(如TA载体),再测定 其核苷酸组成。根据其核苷酸组成设计2个方向相反的引物(P-1,P-2,见图2)。引 物长度多在20 nt以上；退火温度在60℃以上；(2)将基因组DNA做适当酶切,然 后在其两端连接上相同的接头(见图2,这种接头可从生物制品公司购买)。
RNA的指纹图谱(finger print)分析,后来也有人将这种方法用于克隆与表型相
关的基因或mRNA。该方法的理论依据是:表型受基因支配,在一个生物体发
生了表型变化后,其基因组DNA很可能发生变化或出现不同基因的激活或关
闭等;另一方面,如在寄生虫的发育过程中,不同发育阶段的虫体所表达的基因
很可能不同,如将不同发育阶段的虫体mRNA提取出来,用单一引物(随机引物,
3
PCR反应模式图：
Nested PCR反应模式图
4
根据蛋白质序列也可或cDNA 序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1对简并引 物(degen做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。
图３真核生物12种mRNA的序列特点
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根据这12种mRNA序列可合成12种相应的反转录引物，即 M’N’TTTTTTTT……,用其分别进行反转录,即可将所有mRNA分类合成 12种cDNA(于12个试管内)，然后再用随机引物,以这12种cDNA分别做 模板进行PCR扩增(见图1和图4)，那么与表型相关的mRNA就很容易被 发现并克隆出来。但不论AP-PCR还是DD-PCR,都适用于2种种源近似生 物或不同发育阶段的同一个体之间的比较。因而,其PCR的模板必须是 来自2个生物或同一生物的不同发育阶段的mRNA。DD-PCR的优点是快 速、方便,可以检测表达量极低的mRNA，但其技术条件要求较高，所 扩增的mRNA的质量不能有差异,即mRNA不应降解。目前这一方法已广 泛应用于生物表型相关基因的克隆及比较研究。
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目前,以Genbank的应用最频繁。这些基因库是相互联 系的,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。 要克隆某个基因可首先通过Internet查询一下该基因或相 关库中拿出来,根据整 个基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基 因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。值得注意的是,由于物 种和分离株之间的差异,为了保证PCR扩增的准确性,有必 要采用两步扩增法,即nested PCR。
基因克隆的几种常用方法
根据已知序列克隆基因 未知序列的基因打靶 根据已知探针克隆基因 用特异抗体克隆基因 特异基因的功能克隆
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1、根据已知序列克隆基因
对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因 序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。 目前,世界上主要的基因库有: (1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,
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3 未知序列的基因打靶
根据已知序列进行基因克隆,多数是重复 别人的工作,或者是在别人工作的基础上继 续自己的工作,因而不存在新基因的克隆过 程。对未知序列的基因克隆才是真正的创 造性研究。
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3．1 随机引物法克隆未知序列基因
随机引物PCR(arbitrarily primed PCR,AP-PCR)首先被用于基因组DNA或
另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究,所使用的 PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测(reading proof)功能的酶,如pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点
突变或终止密码子而导致整个研究结论的错误。
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2 根据已知探针克隆基因
这也是基因克隆的一种较直接的方法。首先将探针作放 射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理的基因组 DNA杂交,最后将所识别的片段从胶中切下来，克隆到特定 的载体(质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这 种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基 因组中的拷贝数。但在探针杂交后,要注意高强度(high stringent)漂洗,以避免干扰信号,即保证克隆的特异性,同时节 省时间。
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3.2 Differential display PCR(DD-PCR)
DD-PCR是在AP-PCR基础上发明的一种RT-PCR 方法,主要用于2种或多种类似生物个体在基因表 达上的差异分析。其基本原理是:所有真核生物的 成熟mRNA都含有不同长度的poly+(A)尾部序列,根 据poly+(A)内部的2个核苷酸排列的不同,可以将所 有的mRNA分子分为12类(见图3)。
其网上地址为:/ebi-home.html; (2)Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库,
其网上地址为:/web/search/index.html; (3)Swissport和TREMBL,Swissport是一蛋白质序列库,其所含序列的准确 度比较高,而 TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。
其长度不超过16 nt)对不同时期的虫体mRNA进行扩增比较,即可找出导致表
型变异的遗传学依据。这种方法是一种比较PCR,它要求至少有2种来自不同
表型但又很类似的基因组DNA或mRNA。AP-PCR扩增后的产物必须99%是一
致的,只有个别特异的产物出现在特异的表型个体中。该方法对表型或种源关
系相差甚远的生物个体之间没有比较意义(见图1)。
Байду номын сангаас
8
图1 应用AP-PCR法进行2种或多种表型特征类似的个体间指纹图谱分析或表型相关基因克隆 箭头所指扩增带为特异于个体(Ⅱ)的扩增产物
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AP-PCR的操作一般采用两步法,即前10个循环多以较低的退火温度 (annealing temperature)进行扩增,后20个循环则采用较高的退火温度扩增。APPCR产物多较短,一般需高浓度的琼脂糖凝胶检测,也可用聚丙烯酰胺凝胶检测。 如扩增的模板为mRNA,通过比较扩增产物的强度,可以得知该基因在2种生物 或同一生物不同发育阶段的表达强度。另外,在AP-PCR检测到与某一表型相关 的基因或基因产物(mRNA)以后,下一步工作就是克隆出整个基因或mRNA。主 要操作程序为:(1)AP-PCR产物的提取、克隆及序列测定。首先将AP-PCR检测 到的特定片段从凝胶中切下,提取DNA克隆到适宜的载体内(如TA载体),再测定 其核苷酸组成。根据其核苷酸组成设计2个方向相反的引物(P-1,P-2,见图2)。引 物长度多在20 nt以上；退火温度在60℃以上；(2)将基因组DNA做适当酶切,然 后在其两端连接上相同的接头(见图2,这种接头可从生物制品公司购买)。
RNA的指纹图谱(finger print)分析,后来也有人将这种方法用于克隆与表型相
关的基因或mRNA。该方法的理论依据是:表型受基因支配,在一个生物体发
生了表型变化后,其基因组DNA很可能发生变化或出现不同基因的激活或关
闭等;另一方面,如在寄生虫的发育过程中,不同发育阶段的虫体所表达的基因
很可能不同,如将不同发育阶段的虫体mRNA提取出来,用单一引物(随机引物,
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PCR反应模式图：
Nested PCR反应模式图
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根据蛋白质序列也可或cDNA 序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1对简并引 物(degen做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。