靶向PCR CTC检测技术课件
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循环肿瘤细胞CTC检测 PPT
阴性富集流程图
全亚型、高效率、非依赖
通用于绝大部分实体肿瘤、非血源性循环稀有细胞的富集
我们的选择
imFISH
imFISH技术将基因水平的FISH技术与蛋白水平的 免疫荧光染色技术相结合,是兼具核遗传信息及细 胞形态改变的精准CTC鉴定分析方法。
技术优势： ➢ 核酸水平稳定性、灵敏度高（80％） ➢ 引入CD45染色，提高特异性（97％) ➢ 细胞计数、核型分析、表型分析、分子分型
便捷性
CTC只需采集少量外周静脉血便可进行检测，对人体基 本无创，取样便捷，适于动态连续性监测。
循环肿瘤细胞CTC临床应用方向
CTC临床重点应用：一、辅助诊断
判断病灶良恶性 无创便捷，发现早期隐匿转移
辅助传统TNM参考分期 提供适时诊断信息，实现精准治疗
辅助诊断
CTC检测应用于辅助诊断
诊断难
异常占位，良性? 恶性? 病灶位置不宜活检怎么办? 有创操作，是否有瘤细胞种植？
诊准难
肿瘤异质性的影响? 临床分期与病理分期不一致?如何针对肿瘤时空信 Nhomakorabea变化提供
即时诊断信息?
辅助诊断
CTC功能：
对尚未完善病理诊断的患者，CTC 可联合影像学、血清学作为辅助判断病灶良恶性的指标。 同时,CTC是对原发灶与转移灶信息的全面反映，可弥补现有传统TNM 分期的不足，提示早 期微转移的存在风险，指导临床调整诊疗策略，制定更加合理的个体化诊疗方案（如进一 步筛查转移、拟定新辅助化疗、辅助化疗方案等。
联合影像学更客观评价疗效 监测耐药发生
疗效评估、耐药性监测
胰腺癌
49.00% （单8）
75.49%
72.39% 70.3% 70.92%
（8+17） （8+17） （1+8） （8+3）
pcr培训ppt课件
实验操作人员应接受专业培训，熟悉安全操作规程，避免在实验过程 中受伤或感染。
07
总结与展望
Pcr技术的总结
PCR技术的原理
PCR是一种在生物实验室中广泛应用的分子生物学技术，其基本原理是通过特定的DNA 聚合酶，在DNA双链之间进行热循环，从而实现DNA的快速扩增。
PCR技术的应用领域
PCR技术在许多领域都有广泛的应用，包括遗传学、医学、生物技术和农业等。通过PCR 技术，科学家们可以快速、准确地检测和鉴定DNA序列，这对于遗传疾病的诊断、生物 多样性的研究和基因工程等领域具有重要意义。
安全问题
生物安全
PCR实验涉及的生物材料可能具有传染性，因此需要采取适当的生物 安全措施，如穿戴个人防护装备、实验室内消毒等。
废物处理
实验产生的废物应按照相关规定进行妥善处理，避免对环境和人类健 康造成危害。
防止污染
PCR实验过程中应采取措施防止污染，如设置阴性对照、定期检测实 验室环境等。
人员安全
PCR技术的优缺点
PCR技术具有高灵敏度、高特异性和操作简便等优点，但也存在一些局限性，如对模板 DNA的纯度要求高、易受污染等。因此，在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的 PCR方法。
Pcr技术的发展趋势
要点一
提高灵敏度和特异性
随着基因组学和分子生物学研究的深 入，对PCR技术的灵敏度和特异性提 出了更高的要求。因此，未来的PCR 技术需要进一步提高其灵敏度和特异 性，以满足更广泛的研究和应用需求 。
05
Pcr技术的拓展应用
基因克隆与表达
基因克隆
通过PCR技术，科学家可以快速、准 确地获取特定基因片段，为基因克隆 提供基础。
基因表达
利用PCR技术，可以检测基因在不同 条件下的表达水平，有助于理解基因 功能和调控机制。
07
总结与展望
Pcr技术的总结
PCR技术的原理
PCR是一种在生物实验室中广泛应用的分子生物学技术，其基本原理是通过特定的DNA 聚合酶，在DNA双链之间进行热循环，从而实现DNA的快速扩增。
PCR技术的应用领域
PCR技术在许多领域都有广泛的应用，包括遗传学、医学、生物技术和农业等。通过PCR 技术，科学家们可以快速、准确地检测和鉴定DNA序列，这对于遗传疾病的诊断、生物 多样性的研究和基因工程等领域具有重要意义。
安全问题
生物安全
PCR实验涉及的生物材料可能具有传染性，因此需要采取适当的生物 安全措施，如穿戴个人防护装备、实验室内消毒等。
废物处理
实验产生的废物应按照相关规定进行妥善处理，避免对环境和人类健 康造成危害。
防止污染
PCR实验过程中应采取措施防止污染，如设置阴性对照、定期检测实 验室环境等。
人员安全
PCR技术的优缺点
PCR技术具有高灵敏度、高特异性和操作简便等优点，但也存在一些局限性，如对模板 DNA的纯度要求高、易受污染等。因此，在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的 PCR方法。
Pcr技术的发展趋势
要点一
提高灵敏度和特异性
随着基因组学和分子生物学研究的深 入，对PCR技术的灵敏度和特异性提 出了更高的要求。因此，未来的PCR 技术需要进一步提高其灵敏度和特异 性，以满足更广泛的研究和应用需求 。
05
Pcr技术的拓展应用
基因克隆与表达
基因克隆
通过PCR技术，科学家可以快速、准 确地获取特定基因片段，为基因克隆 提供基础。
基因表达
利用PCR技术，可以检测基因在不同 条件下的表达水平，有助于理解基因 功能和调控机制。
2024版ctc检测技术ppt课件
2024/1/24
CTC单细胞分析
对单个CTC进行深入分析，揭示其生 物学特性和临床意义，为个性化治疗 提供依据。
CTC液体活检
利用CTC检测技术实现液体活检，为 肿瘤的早期诊断、预后评估和疗效监 测提供新的手段。
25
CTC检测技术的研究方向和发展重点
CTC捕获技术的优化
CTC鉴定标准的完善
改进现有的CTC捕获技术，提高捕获效率和 纯度，降低检测成本。
2024/1/24
检测方法的标准化
目前CTC检测方法尚未实现标准化，不同方 法之间的结果可比性差。
24
CTC检测技术的未来发展趋势和前景
高通量检测技术
随着技术的发展，高通量检测技术将 逐渐应用于CTC检测，提高检测效率 和准确性。
多模态检测技术
结合不同检测技术的优势，发展多模 态检测技术，提高CTC检测的灵敏度 和特异性。
建立更加完善的CTC鉴定标准，提高检测的 准确性和可靠性。
CTC临床应用的拓展
CTC检测技术的标准化和规范化
探索CTC检测技术在肿瘤以外的其他疾病中 的应用价值，如心血管疾病、神经系统疾病 等。
推动CTC检测技术的标准化和规范化进程， 促进不同方法之间的结果可比性和互认。
2024/1/24
26
06
CTC富集
采用免疫磁珠法、微流控芯片 技术等对CTC进行富集，提高
检测灵敏度。
CTC鉴定
利用特异性抗体或分子标记物 对富集的CTC进行鉴定，确保
准确性。
2024/1/24
18
CTC检测技术的数据分析方法
数据预处理
对原始数据进行清洗、 去噪和标准化处理，以
便后续分析。
2024/1/24
PCR详细讲解PPT课件
2021/3/7
CHENLI
26
引物设计的基本原则
1、引物应具有足够的特异性。
如果需要从基因组等较复杂的模板中扩 增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列 的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列 的非特异性。
引物与非特异序列的同源性不超过70% 或有连续8个互补碱基。
NCBI Primer BLAST
29
引物设计的基本原则
3、引物长度一般为18-30个碱基之间。
引物长度与反应的特异性和解链温度成
正相关。
过短：扩增特异性下降 过长：引物自身形成二级结构，以及引物二 聚体。
2021/3/7
CHENLI
30
引物设计的基本原则
4、G+C含量一般为40%-60%
引物的碱基组成也会对引物的解链温度 产生影响。
2021/3/7
CHENLI
68
退火温度与时间取决于引物的 碱基组成、长度和浓度。退火温度 可以通过计算推断，通常采用温度 梯度PCR的方法进行摸索。
PC1-P20 退火温度摸索
45.0 45.5 46.9 49.0 51.4 53.8 56.2 58.6 60.9 63.1 64.5 65.0 M
CHENLI
8
低温退火
2021/3/7
CHENLI
9
中温延伸
2021/3/7
CHENLI
10
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CHENLI
11
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CHENLI
12
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CHENLI
13
• 理论：2n递增（n为循环次数）， 如果扩增30循环，目标DNA可增加 230也就是109倍。
PCR详细讲解 ppt课件
2
PCR的基本原理
① DNA半保留复制的机理；
② 体外DNA分子于不同温度下可变 性和复性的性质。
2021/3/26
PCR详细讲解 ppt课件
3
PCR扩增体系
➢模板（Template）：基因组、质粒DNA、cDNA，也可
以是细菌、组织样品等。
➢引物（Primer）：确定扩增目的序列的特异性；确定
1、避免重复碱基，尤其是G。
2、引物退火温度在58-60℃之间。
3、G+C为30-80%。
4、3’端最后5个碱基内不能有多于2个
的G或C。
5、引物的产物大小一般在80-250bp之
间；80-150 bp最为合适（可以延长至
300 bp）。 2021/3/26
PCR详细讲解 ppt课件
38
Real-Time PCR引物设计原则
2021/3/26
PCR详细讲解 ppt课件
35
引物设计的基本原则
9、引物的3’端不可以A结尾。
引物3’端错配时，不同碱基引发效率存 在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即 使在错配的情况下，也能有引发链的合成， 而当末位链为T时，错配的引发效率大大降 低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所 以3’端最好选择T。
引物设计的最重要的原则：最大限度 地提高扩增效率和特异性；同时尽可 能减少非特异性扩增。
2021/3/26
PCR详细讲解 ppt课件
26
引物设计的基本原则
1、引物应具有足够的特异性。
如果需要从基因组等较复杂的模板中扩 增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列 的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列 的非特异性。
30
引物设计的基本原则
靶向PCRCTC检测技术PPT课件
在疗效评估中的应用
疗效评估
通过比较治疗前后血液中CTC的 数量和基因表达水平，可以评估 治疗效果，为调整治疗方案提供
依据。
耐药性分析
通过检测血液中的CTC耐药基因表 达水平，可以分析肿瘤细胞对药物 的耐药性，指导临床用药。
预后预测
通过分析血液中CTC的基因表达谱， 可以预测患者的预后情况，为制定 后续治疗方案提供参考。
展望
1 2 3
技术改进
未来研究将致力于改进靶向PCR-CTC检测技术的 灵敏度和特异性，降低假阳性率和假阴性率。
临床应用拓展
随着技术的不断完善，靶向PCR-CTC检测技术有 望在更多类型的癌症中得到应用，为更多患者带 来福音。
与其他技术的结合
未来研究将探索靶向PCR-CTC检测技术与免疫治 疗、基因治疗等其他肿瘤治疗方法的结合，实现 肿瘤的综合治疗和管理。
联合其他技术
结合其他技术如免疫组化、 基因测序等，提高对肿瘤 细胞的鉴定和功能分析能 力。
04
靶向PCR-CTC检测技术实验操作流程
样本采集与处理
血液样本采集
采集患者外周静脉血液，注意避 免溶血和污染。
细胞分离
将血液样本进行离心，分离出血 浆和细胞成分。
细胞洗涤与计数
洗涤细胞，去除杂质，并对细胞 进行计数，以便后续实验操作。
实时定量PCR
03
进行实时定量PCR扩增，通过荧光信号的检测对CTC进行定量分
析。
结果解读与报告
结果分析
根据实时定量PCR的结果，分析CTC的数量和基因表达水平。
结果解读
结合患者病情和临床表型，对结果进行解读。
报告撰写
撰写详细的实验报告，包括实验操作、结果分析和结论，为临床 提供参考依据。
pcr技术ppt课件
在适中温度下进行延伸，完成一个DNA的复制循环。
通过连续循环，DNA片段数量呈指数增长。
PCR技术的发明和发展
1985年，Mullis和Cetus公司的 合作者Michael Smith在《科学 》杂志上首次公开描述了PCR方 法。
1987年，Innis、Gelfand、 White等人建立了PCR技术的标 准化方案。
退火
将温度降至50℃左右，引物 与单链DNA结合，形成局部
双链。
延伸
温度上升至72℃，DNA聚合 酶从引物起始合成新的DNA
链。
降温及终止反应
每个循环结束后降低温度以终 止反应，准备进入下一个循环
。
03
PCR技术的操作步骤
准备PCR反应所需的试剂和设备
01
准备PCR仪、离心机、移液器等 设备，确保其正常工作。
按照设定的程序进行PCR扩增，记录 扩增曲线和数据。
分析扩增产物
将PCR产物进行电泳或荧光检测 ，观察扩增结果。
利用凝胶成像系统或荧光检测仪 对产物进行分析，确定产物的大
小和浓度。
根据需要，可以进行克隆、测序 等后续操作，进一步验证PCR产
物的准确性和特异性。
04
PCR技术的优缺点
优点
高灵敏度
PCR技术PPT课件
目录
• PCR技术简介 • PCR技术的基本原理 • PCR技术的操作步骤 • PCR技术的优缺点 • PCR技术的应用实例 • PCR技术的未来展望
01
PCR技术简介
什么是PCR技术
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生 物学技术。
它利用耐高温的DNA聚合酶（通常为Taq酶）在高温下将双链DNA分子 变性解旋为单链，然后通过低温退火使引物与单链DNA分子结合，最后
通过连续循环，DNA片段数量呈指数增长。
PCR技术的发明和发展
1985年，Mullis和Cetus公司的 合作者Michael Smith在《科学 》杂志上首次公开描述了PCR方 法。
1987年，Innis、Gelfand、 White等人建立了PCR技术的标 准化方案。
退火
将温度降至50℃左右，引物 与单链DNA结合，形成局部
双链。
延伸
温度上升至72℃，DNA聚合 酶从引物起始合成新的DNA
链。
降温及终止反应
每个循环结束后降低温度以终 止反应，准备进入下一个循环
。
03
PCR技术的操作步骤
准备PCR反应所需的试剂和设备
01
准备PCR仪、离心机、移液器等 设备，确保其正常工作。
按照设定的程序进行PCR扩增，记录 扩增曲线和数据。
分析扩增产物
将PCR产物进行电泳或荧光检测 ，观察扩增结果。
利用凝胶成像系统或荧光检测仪 对产物进行分析，确定产物的大
小和浓度。
根据需要，可以进行克隆、测序 等后续操作，进一步验证PCR产
物的准确性和特异性。
04
PCR技术的优缺点
优点
高灵敏度
PCR技术PPT课件
目录
• PCR技术简介 • PCR技术的基本原理 • PCR技术的操作步骤 • PCR技术的优缺点 • PCR技术的应用实例 • PCR技术的未来展望
01
PCR技术简介
什么是PCR技术
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生 物学技术。
它利用耐高温的DNA聚合酶（通常为Taq酶）在高温下将双链DNA分子 变性解旋为单链，然后通过低温退火使引物与单链DNA分子结合，最后
PCR及相关技术PPT课件
DNA是一种非常稳定的分子，其作为模板影响PCR效果 的因素有： 1. 模板的纯度； 2. 模板DNA的量；
2020/7/28
13
3. PCR引物：
PCR引物是与模板DNA互补的两条人工合成的寡核苷酸链 ，通常由15-30个核苷酸构成。引物与单链DNA模板的3’ 端互补且具有游离的3’羟基。引物互补于所需扩增DNA片 段的两端，使DNA片段的扩增只限于引物之间的区段。
核苷酸错误掺入的几率比较高
2020/7/28
9
3
掺入的 H-dNTTP微克分子数
3
掺入的 H-dNTTP微克分子数
Taq DNA聚合酶的特性
200 150
2
100
100
3
50
1
2020/7/28
3
掺入的 H-dNTTP微克分子数
温度
6 78
9 10
pH
1. 25 mM磷 酸 缓 冲 液 2. 25 mMTris-HCl缓 冲 液
2020/7/28
18
2020/7/28
6. PCR系统中的其他成分：
PCR反应缓冲液通常用10mMTris-HCl(pH8.3)；50mMKCl；明胶或 血清白蛋白（100ug/ml）及非离子去污剂等。
2020/7/28
16
PCR仪
2020/7/28
17
（四）PCR反应技术类型
1. 巢式PCR（nested PCR）：
设计两对引物，先用第一对引物扩增，然后以此扩增产物 为模板，再用第二对引物继续扩增。可增加扩增的灵敏度 ，比单一的一对引物PCR扩增灵敏度特异性增加1000倍 。
C.therm.聚合酶
1) 是一种以Mg2+为辅助因子的逆转录酶，最适温度在60-70度之间。在 RT-PCR系统中催化逆转录反应。
2020/7/28
13
3. PCR引物：
PCR引物是与模板DNA互补的两条人工合成的寡核苷酸链 ，通常由15-30个核苷酸构成。引物与单链DNA模板的3’ 端互补且具有游离的3’羟基。引物互补于所需扩增DNA片 段的两端，使DNA片段的扩增只限于引物之间的区段。
核苷酸错误掺入的几率比较高
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掺入的 H-dNTTP微克分子数
3
掺入的 H-dNTTP微克分子数
Taq DNA聚合酶的特性
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2
100
100
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50
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3
掺入的 H-dNTTP微克分子数
温度
6 78
9 10
pH
1. 25 mM磷 酸 缓 冲 液 2. 25 mMTris-HCl缓 冲 液
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18
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6. PCR系统中的其他成分：
PCR反应缓冲液通常用10mMTris-HCl(pH8.3)；50mMKCl；明胶或 血清白蛋白（100ug/ml）及非离子去污剂等。
2020/7/28
16
PCR仪
2020/7/28
17
（四）PCR反应技术类型
1. 巢式PCR（nested PCR）：
设计两对引物，先用第一对引物扩增，然后以此扩增产物 为模板，再用第二对引物继续扩增。可增加扩增的灵敏度 ，比单一的一对引物PCR扩增灵敏度特异性增加1000倍 。
C.therm.聚合酶
1) 是一种以Mg2+为辅助因子的逆转录酶，最适温度在60-70度之间。在 RT-PCR系统中催化逆转录反应。
肿瘤精准靶向治疗ppt课件
No. Patients 8 8
Median Survival 15.5 mos 6.8 mos
P 0.0028
ERCC1表达与铂类药物疗效相关 的临床数据
ERCC1低表达患者，能从铂类辅助化疗中获益.
BRCA1/2表达与铂类药物疗效 相关的临床数据
BRCA1过度表达 •铂类耐药的预测因子 •抗微管类药物的敏感因子
药物代表：西妥昔（默克）；贝伐单抗（罗 氏）。
基因EGFR热点突变位点
•EGFR主要突变在：外显子18，19，20，21 •耐药突变：T790M
➢靶向药物西妥昔单抗靶标——K-ras基因检测
✓ NCCN明确指出西妥昔单抗（爱必妥）用药 之前须检测K-ras基因突变检测；
野生型 突变型
✓ K-ras突变型患者并不能从抗EGFR治疗（爱 必妥）中获益,反而徒增不良反应危险和治 疗费用；
•化疗前后CTC数量都少于阈值 的患者无进展生存期和 总生存期明显高于只有一次测出CTC数量少于阈值的患
乳腺癌阈值5，结直者肠癌。阈值3，前列腺癌阈值5
为什么要选择使用CTC系统? 唯一的标准化，自动化循环肿瘤细胞计数系统 具可重复性和高敏感度 系统最低检测限度：7.5ml外周血中的1个肿瘤细胞
临床意义 预测无进展生存期和总生存期 转移性癌症的监护 疗效监控 复查（早于影像学发现疾病进展情况）
原发肿瘤血管 生成侵润
侵入血管内 凋亡的CTC
循环肿瘤细 胞（CTC）
循环肿瘤 微栓
（CTM）
上皮－间质 转化
（EMT）
侵润
转移
肿瘤细胞 扩增
血管生成
间质－上皮 转化
（MET）
侵入血管外 (CTC)
转移到骨 髓和其他
2024版ctc循环肿瘤细胞ppt课件
2024/1/27
9
CTC与肿瘤转移的关系
CTC与肿瘤转移潜能
CTC数量与肿瘤患者的预后密切相关，高数量的CTC往往预示着更高的转移潜能和 更差的预后。
CTC在肿瘤转移中的作用
CTC可作为肿瘤转移的“种子”，在适宜的微环境下重新生长形成转移灶。同时， CTC还可通过分泌生长因子、促血管生成因子等促进肿瘤转移。
流式细胞术
将血液样本通过高速流动的细胞悬液，利用光学、电学等原理对细胞进行快速检测和分类。 该方法可实现对CTC的定量分析和多参数检测，但操作复杂且成本较高。
2024/1/27
微流控芯片技术
利用微流控芯片模拟人体微环境，实现CTC的高效捕获和检测。该技术具有高通量、高灵敏 度和低成本的优点，是未来CTC检测的重要发展方向。
对未来CTC研究的展望与建议
01
02
03
04
深入研究CTC的生物学特性及 其与肿瘤转移的关系，为肿瘤
治疗提供新靶点。
开发高效、灵敏的CTC检测技 术，提高检测准确性和可重复
性。
开展大规模、多中心的临床研 究，验证CTC检测在肿瘤诊疗
中的价值。
加强跨学科合作，推动CTC研 究在临床转化和应用方面的发
19
CTC检测技术的改进与创新
提高检测灵敏度
通过改进现有技术或开发 新技术，提高CTC检测的 灵敏度，降低假阴性率。
2024/1/27
提高检测特异性
针对CTC的特异性标志物 进行深入研究，开发高特 异性的检测方法，减少假 阳性结果。
实现无创检测
探索基于血液或其他体液 的无创检测技术，减轻患 者痛苦，提高检测便利性。
4
CTC在肿瘤研究中的重要性
01
PCR技术PPT课件
一、PCR的定义：
PCR（polymerase chain reaction) ：
聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增 技术。
近年来发展起来的一种体外扩增特异 DNA片段的技术。
.
2
DNA扩增的传统方法： 一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基 因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛 选，牵扯到DNA酶切、连接、转化、培养及探针 杂交等技术，虽然技术上已无难点，但操作复杂， 需数周到数月的时间，且不利于普及。
.
6
3. 延伸 (Extension):
将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合
酶、4种 dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以引物 的 3′ 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的
新DNA链。72 ℃ 1′
上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本 中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新 一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增 106 ～ 109 倍。
.
28
四、PCR反应体系：
常用30μl 各种成分的实际用量应根据实验者选
用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓 度进行核算。
.
29
10×buffer： 1×30 / 10 = 3μl
MgCl2: dNTPs:
1.5×30 / 5 = 1.8μl 0.2×30 / 10 = 0.6μl
引物 P：
0.4×30×2 / 10 = 2.4μl
.
5
扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异 结合，基本反应步骤分三步：
1. 变性 (Denaturation)： 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两
条单链。94℃ 30″ 2. 退火 (复性) (Annealling):
PCR（polymerase chain reaction) ：
聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增 技术。
近年来发展起来的一种体外扩增特异 DNA片段的技术。
.
2
DNA扩增的传统方法： 一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基 因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛 选，牵扯到DNA酶切、连接、转化、培养及探针 杂交等技术，虽然技术上已无难点，但操作复杂， 需数周到数月的时间，且不利于普及。
.
6
3. 延伸 (Extension):
将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合
酶、4种 dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以引物 的 3′ 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的
新DNA链。72 ℃ 1′
上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本 中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新 一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增 106 ～ 109 倍。
.
28
四、PCR反应体系：
常用30μl 各种成分的实际用量应根据实验者选
用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓 度进行核算。
.
29
10×buffer： 1×30 / 10 = 3μl
MgCl2: dNTPs:
1.5×30 / 5 = 1.8μl 0.2×30 / 10 = 0.6μl
引物 P：
0.4×30×2 / 10 = 2.4μl
.
5
扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异 结合，基本反应步骤分三步：
1. 变性 (Denaturation)： 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两
条单链。94℃ 30″ 2. 退火 (复性) (Annealling):
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（格诺）
CellSearch®
CyttelTM （北京莱尔）
CanpatrolTM （益善）
核心技术
免疫磁珠负向富集 靶向配体PCR技术
流式正向富集技术荧光标 免疫磁珠负向富集、 ISET（滤膜）
记
Fish技术
原位杂交RNA分析
特异性
88%
80%
83%
75%
灵敏度
自动化
血样体积
适应症
早期（I期） 敏感性
优势：简单 劣势：漏掉小的CTC细胞
网 筛
靶向PCR CTC检测技术
“垃圾”
幸好没吃胖， 我们逃了
11
CTC检测技术
检测原理
•肺癌细胞FR(叶酸受体）高 度表达 •CTC：FR=1:50万 •EMT转化不影响FR丰度 •其他血细胞不表达FR
•CTC回收率接近100% •磁珠富集易操作和自动化
•灵敏度超高，负向富集可满足 检测要求 •信号二次放大，1个CTC信号 放大10^12倍 •无需人工经验判读，结果客观 准确 •可实现CTC的定量
mircoRNA LNC RNA
Others
传统的组织细胞学检测
靶向PCR CTC检测技术
3
液态活检在肺癌中的应用
事件 治疗策略
肺癌待查 辅助诊断
早癌肺癌
晚期肺癌
治疗方案选择
复发监测
靶向PCR CTC检测技术
疗效评估
癌症耐药
耐药机理
新药研发
4
CTC的临床应用价值
事件
疑似肺癌
早癌肺癌
晚期肺癌
癌症耐药
靶向PCR CTC检测技术
16
EpCAM阴性细胞中，存在大量 CTC
✓ Cell Research系统主要使用EpCAM（上皮粘附分子） 做为探针
✓ 研究证实，EpCAM阴性的细胞中也存在CTC
靶向PCR CTC检测技术
Jiatao Lou, et al. Plos On1e7 2013
Cell Search: 乳腺癌中检测出，但肺癌敏感性低
靶向PCR CTC检测技术 ——帮助临床医生更全面地评估肺癌
靶向PCR CTC检测技术
1
Lung Cancer in Solid Tumor in China
靶向PCR CTC检测技术
2
？
=
液态活检
通过外周血中的肿瘤细胞或者肿瘤基 因组信息来评估肿瘤
病理活检
通过原发灶肿瘤组织来评估肿瘤
CTC ctDNA
治疗策略
辅助诊断
复发监测
治疗 方案 选择
疗效 评估
耐药机理 新药研发
CTC(数量）
(负向富集+靶向PCR）
ctDNA (基因变异）
靶向PCR CTC检测技术
5
什么是循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell，CTC）？
CTC：在肿瘤发生过程中，具有干细胞特征
的肿瘤细胞和不具有干细胞特征的肿瘤细胞， 均由原发肿瘤脱落释放入外周血，两者统称循 环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell）CTC1
2004
2011
Cell Research: 采用的抗体(EpCAM)对 EMT细胞特异性差，而肺癌细胞转移入 血需要EMT的过程
靶向PCR CTC检测技术
18
靶向PCR CTC检测技术
19
检测流程
3 6 报告 mL血→ 个小时→得到
靶向PCR CTC检测技术
20
肺癌领域，CTC检测技术对比
CytoploRare®
CTC≠有转移：侵入第二器官CTCs，
称之为DTC（disseminated Tumor Cell）， 只有由具有干细胞特征的DTC所形成的微 转移灶，逃避免疫识别才可能发展成为肿 瘤远处转移2
肿瘤释放如外周血中CTCs数量的多少， 可间接反应肿瘤发生发展的功能状态
• 1、K. Pant靶e向l,PCeR CtTCa检l测.技N术at Rev Clin Oncol, 2009;62、
EpCAM 抗原
CD45 抗原
抗 EpCAM 磁流体
CK 抗原 上皮细胞
白细胞
荧光染料 抗 CD45-APC 染料
抗 CK-PE 染料
EpCAM – 上皮细胞粘附分子
APC – 异藻蓝蛋白荧光染料
CK – 细胞角蛋白
PE – 藻红蛋白荧光染料
DAPI – 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DNA荧光染料）
优势：回收率100% 劣势：纯度略低
没水了， 我们躲不了了
放 水
“方法”
“收获”
正向富集
优势：纯度高
蟹
劣势：回收率低（漏掉CTC）
饵
靶向PCR CTC检测技术
“垃圾”
幸好没贪嘴， 我们逃了
10
负向富集
优势：回收率100% 劣势：纯度略低
没水了， 我们躲不了了
放 水
“方法”
“收获”
大小富集（ISET）
什么时候可以检测到CTC？
早期肿瘤外周血中即可检出CTC
CK+ cells HER-2+ cells
第9周的乳腺管组织切片：
第30周的肿瘤组织切片：
乳腺管周围非典型性增生
新生的肿瘤上皮细胞形
成牙槽靶并向侵PC袭R C周TC围检基测质技术
7
早期肿瘤外周血中即可检出CTC
表达中等量FR的M109鼠肺癌细胞通过皮下注射的方式被移植到BALB/c小鼠的背部侧面 移植2周后，在小鼠耳部的血管中每分钟可以检测到大约1.4个CTC细胞 移植后第3和第4周，则每分钟可分别检测7个和18个CTC，随着肿瘤逐渐增大数量呈指数上升 在肿瘤移植的前4周内，没有在任何组织切片中发现到存在转移性癌症的迹象
靶向PCR CTC检测技术
12
CTC检测
靶向PCR，信号放大，保证高度敏感性
1个CTC信号 放大1012倍
靶向PCR CTC检测技术
13
CTC检测
优势三：PCR扩增信 号，确保高敏感性
优势一：阴性富集不 丢失循环肿瘤细胞
优势二：靶向探针特
优势四：PCR仪判断 异性高
CTC技术，避免人为误
差
靶向PCR CTC检测技术
靶向PCR CTC检测技术
8
• W He, et al. Proc Natl Acad Sci, 2007
CTC富集技术
CTC检测技术
CTC 检测方法
=
✓ 密度与大小
✓ 免疫磁珠（负向富集 or 阳性富集)
+
✓ 靶向PCR ✓ 免疫荧光
✓ 普通PCR
✓ 微流体
靶向PCR CTC检测技术
9
负向富集
14
3mL血
1个CTC/3mL血
50万FR/1个CTC
100万信号/1个FR
FR靶向PCR—— 1个CTC细胞信号方法10^12倍（万亿倍）
3mL血
细胞免疫荧光—— 1个CTC细胞信号几乎没有放大
1mL/3mL血
1个CTC/1slide 靶向PCR CTC检测技术
1个信号/1个CTC 15
Cell Search:正向富集+免疫荧光技术进行捕获和鉴定
CellSearch®
CyttelTM （北京莱尔）
CanpatrolTM （益善）
核心技术
免疫磁珠负向富集 靶向配体PCR技术
流式正向富集技术荧光标 免疫磁珠负向富集、 ISET（滤膜）
记
Fish技术
原位杂交RNA分析
特异性
88%
80%
83%
75%
灵敏度
自动化
血样体积
适应症
早期（I期） 敏感性
优势：简单 劣势：漏掉小的CTC细胞
网 筛
靶向PCR CTC检测技术
“垃圾”
幸好没吃胖， 我们逃了
11
CTC检测技术
检测原理
•肺癌细胞FR(叶酸受体）高 度表达 •CTC：FR=1:50万 •EMT转化不影响FR丰度 •其他血细胞不表达FR
•CTC回收率接近100% •磁珠富集易操作和自动化
•灵敏度超高，负向富集可满足 检测要求 •信号二次放大，1个CTC信号 放大10^12倍 •无需人工经验判读，结果客观 准确 •可实现CTC的定量
mircoRNA LNC RNA
Others
传统的组织细胞学检测
靶向PCR CTC检测技术
3
液态活检在肺癌中的应用
事件 治疗策略
肺癌待查 辅助诊断
早癌肺癌
晚期肺癌
治疗方案选择
复发监测
靶向PCR CTC检测技术
疗效评估
癌症耐药
耐药机理
新药研发
4
CTC的临床应用价值
事件
疑似肺癌
早癌肺癌
晚期肺癌
癌症耐药
靶向PCR CTC检测技术
16
EpCAM阴性细胞中，存在大量 CTC
✓ Cell Research系统主要使用EpCAM（上皮粘附分子） 做为探针
✓ 研究证实，EpCAM阴性的细胞中也存在CTC
靶向PCR CTC检测技术
Jiatao Lou, et al. Plos On1e7 2013
Cell Search: 乳腺癌中检测出，但肺癌敏感性低
靶向PCR CTC检测技术 ——帮助临床医生更全面地评估肺癌
靶向PCR CTC检测技术
1
Lung Cancer in Solid Tumor in China
靶向PCR CTC检测技术
2
？
=
液态活检
通过外周血中的肿瘤细胞或者肿瘤基 因组信息来评估肿瘤
病理活检
通过原发灶肿瘤组织来评估肿瘤
CTC ctDNA
治疗策略
辅助诊断
复发监测
治疗 方案 选择
疗效 评估
耐药机理 新药研发
CTC(数量）
(负向富集+靶向PCR）
ctDNA (基因变异）
靶向PCR CTC检测技术
5
什么是循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell，CTC）？
CTC：在肿瘤发生过程中，具有干细胞特征
的肿瘤细胞和不具有干细胞特征的肿瘤细胞， 均由原发肿瘤脱落释放入外周血，两者统称循 环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell）CTC1
2004
2011
Cell Research: 采用的抗体(EpCAM)对 EMT细胞特异性差，而肺癌细胞转移入 血需要EMT的过程
靶向PCR CTC检测技术
18
靶向PCR CTC检测技术
19
检测流程
3 6 报告 mL血→ 个小时→得到
靶向PCR CTC检测技术
20
肺癌领域，CTC检测技术对比
CytoploRare®
CTC≠有转移：侵入第二器官CTCs，
称之为DTC（disseminated Tumor Cell）， 只有由具有干细胞特征的DTC所形成的微 转移灶，逃避免疫识别才可能发展成为肿 瘤远处转移2
肿瘤释放如外周血中CTCs数量的多少， 可间接反应肿瘤发生发展的功能状态
• 1、K. Pant靶e向l,PCeR CtTCa检l测.技N术at Rev Clin Oncol, 2009;62、
EpCAM 抗原
CD45 抗原
抗 EpCAM 磁流体
CK 抗原 上皮细胞
白细胞
荧光染料 抗 CD45-APC 染料
抗 CK-PE 染料
EpCAM – 上皮细胞粘附分子
APC – 异藻蓝蛋白荧光染料
CK – 细胞角蛋白
PE – 藻红蛋白荧光染料
DAPI – 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DNA荧光染料）
优势：回收率100% 劣势：纯度略低
没水了， 我们躲不了了
放 水
“方法”
“收获”
正向富集
优势：纯度高
蟹
劣势：回收率低（漏掉CTC）
饵
靶向PCR CTC检测技术
“垃圾”
幸好没贪嘴， 我们逃了
10
负向富集
优势：回收率100% 劣势：纯度略低
没水了， 我们躲不了了
放 水
“方法”
“收获”
大小富集（ISET）
什么时候可以检测到CTC？
早期肿瘤外周血中即可检出CTC
CK+ cells HER-2+ cells
第9周的乳腺管组织切片：
第30周的肿瘤组织切片：
乳腺管周围非典型性增生
新生的肿瘤上皮细胞形
成牙槽靶并向侵PC袭R C周TC围检基测质技术
7
早期肿瘤外周血中即可检出CTC
表达中等量FR的M109鼠肺癌细胞通过皮下注射的方式被移植到BALB/c小鼠的背部侧面 移植2周后，在小鼠耳部的血管中每分钟可以检测到大约1.4个CTC细胞 移植后第3和第4周，则每分钟可分别检测7个和18个CTC，随着肿瘤逐渐增大数量呈指数上升 在肿瘤移植的前4周内，没有在任何组织切片中发现到存在转移性癌症的迹象
靶向PCR CTC检测技术
12
CTC检测
靶向PCR，信号放大，保证高度敏感性
1个CTC信号 放大1012倍
靶向PCR CTC检测技术
13
CTC检测
优势三：PCR扩增信 号，确保高敏感性
优势一：阴性富集不 丢失循环肿瘤细胞
优势二：靶向探针特
优势四：PCR仪判断 异性高
CTC技术，避免人为误
差
靶向PCR CTC检测技术
靶向PCR CTC检测技术
8
• W He, et al. Proc Natl Acad Sci, 2007
CTC富集技术
CTC检测技术
CTC 检测方法
=
✓ 密度与大小
✓ 免疫磁珠（负向富集 or 阳性富集)
+
✓ 靶向PCR ✓ 免疫荧光
✓ 普通PCR
✓ 微流体
靶向PCR CTC检测技术
9
负向富集
14
3mL血
1个CTC/3mL血
50万FR/1个CTC
100万信号/1个FR
FR靶向PCR—— 1个CTC细胞信号方法10^12倍（万亿倍）
3mL血
细胞免疫荧光—— 1个CTC细胞信号几乎没有放大
1mL/3mL血
1个CTC/1slide 靶向PCR CTC检测技术
1个信号/1个CTC 15
Cell Search:正向富集+免疫荧光技术进行捕获和鉴定