酶与细胞的固定化
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变化少，因而酶活力损失很少。 参与交联的基团有: a-氨基, -NH2（Lys）, -SH(cys),咪唑基(His),酚基（Tyr),等
发酵液中含菌体少，有利于产品的分离纯化，提高产品质量等
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
• 缺点：酶与载体相互作用力弱，酶易脱落等 1）引入功能团和间隔臂；
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方 固定化后酶的哪些主要性质发生了变化?变化的趋势及原因分析.
常见非共价法?常见共价法?
法。 少量的持续不断的配基的脱落;
交联法由于不需要活化基团,所以条件比较温和,酶活的回收率比较高? 活力回收:指固定化后固定化酶(或细胞)所显示的活力占被固定的等当量游离酶(细胞)总活力的百分比. 第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。颗粒状占 绝大多数，它和线条主要用于工业发酵生产 ，薄膜主要用于酶电极。酶管机械强度较大 ，主要用于工业生产。
固定化酶的优势：
① 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶 液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；
② 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱 连续反应
③ 酶反应过程能够加以严格控制； ④ 较游离酶更适合于多酶反应； ⑤ 在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； ⑥ 可以增加产物的收率，提高产物的质量； ⑦ 酶的使用效率提高、成本降低。
在中性pH下优先与a-氨基反应,因此有一定的选择性 缺点：在包埋过程发生的化学反应同样会导致酶的失活。
• 优点：酶活性中心不易被破坏，酶高级结构 二、载体活化程度和固定化配基密度的测定
固定化过程中，酶分子空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；
用此法制备的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等。
不溶性载体的固定化方法。（DEAE-纤维素 可以增加产物的收率，提高产物的质量；
（二）克隆基因产物高效表达并且稳定性也明显提高；
，DEAE-葡萄糖凝胶,CM-纤维素等） 固定化死细胞:比较适合于单酶催化反应,可以增加细胞的通透性.
其比例在一定程度上和酶的浓度与交联试剂的浓度有关，也与pH、离子强度有关。 包埋法属于共价还是非共价固定化?有什么优劣? 特点：一定的机械性能，能定向将酶等包裹物质携带到一定部位然后释放，具有更大的定向性； 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应 固定化酶的活力一般比天然酶小，专一性也有所变化。 固定化酶成本要低，以利于工业使用。
• 优点：操作简单，条件温和，酶活性中心和 发酵液中含菌体少，有利于产品的分离纯化，提高产品质量等
固定化酶必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮藏，利于反复使用；
高级结构不易受到破坏，酶活回收率比较高 用于酶的固定条件特别温和.
包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分子底物不能透过膜与酶接触。 用此法制备的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等。
酶与细胞的固定化
第一节：酶的固定化
一．固定化酶的定义及其特点
酶的固定化:利用一定措施将酶束缚或限 制于一定区域内，仍能进行其特有的催 化反应，并可回收及重复使用的一类技 术。
固定化酶:在一定空间内呈闭锁状态存在 的酶,能连续地进行反应,反应后的酶可以 回收使用.(不一定是固体)
固定化酶的形状:
固定化酶的缺点： 固定化时，酶的活力有损失；
只能用于可溶性底物，而且较 适用于小分子底物，对大分子 底物不适宜；
增加了生产的成本，工厂初始 大；
与完整菌体相比不适宜于多酶
二：固定化酶的制备原则：
1. 必须注意维持酶的催化活性及专一性。酶活性中 心不能受到破坏或与载体结合，尽量避免破坏酶 高级结构的条件，固定化的条件要温和。
2. 分散法：
提高水不溶溶剂中酶反应速率的途径 ：
• 正确的体系和贮存状态使酶粉充分分散（ 加入有利于分散的化合物,如PEG）；
• 通过与亲脂化合物的共价连接能增加酶在 有机相中的溶解度，包埋在膜体系中或通 过多相反应来实现酶的固定化；
• 将酶吸附到多孔载体中；
3. 物理吸附法：
少量的持续不断的配基的脱落; 包埋法属于共价还是非共价固定化?有什么优劣? 重氮法 是将带芳香族氨基的载体，先用NaNO2和稀盐酸处理成重氮盐衍生物，再在中性偏碱(pH8—9)条件下与酶蛋白发生偶联反应 ，得到固定化酶。
2. 固定化应有利于生产的自动化、连续化；
3. 固定化酶必须结合牢固，从而使固定化酶能回收 贮藏，利于反复使用；
4. 固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物 、产物或反应液发生化学反应；
5. 固定化酶成技术,固定化酶 • 为什么要进行酶的固定化? • 固定化酶有何优劣性? • 固定化酶技术的基本原则有哪些? • 固定化酶就是使酶从游离状态变成固体? • 固定化酶的活力比游离酶高? • 固定化酶更有利于多酶反应? • 固定化酶可以节省成本?
。 细胞标记、分离和性质研究：将细胞表面抗原分子对应地抗体偶联于载体上。
4. 离子结合法：
酶通过离子键结合于具有离子交换基的水 交联法由于不需要活化基团,所以条件比较温和,酶活的回收率比较高?
相对活力：固定化酶总活力/（加入酶总活力-上清液中末偶联的酶活力）*100% 长臂上另一端的氨基再与经过溴化氰CNBr活化了的琼脂糖偶联,从而得到固定化的辅酶.
三：酶的固定化方法
• 酶的固定化方法很多，但没有 普遍适应的方法，必须根据不 同酶及其不同的用途通过反复 试验选择。
常用的固定化方法有：
(按化学反应的类型分)
分类 固定化方法
固定化方法 分类
非共价结合法
结晶法 分散法 物理吸附法 离子结合法
化学结合法 包埋法
交联法， 共价结合法
微囊法， 网格法
固定化酶的模式图
（一）非共价结合法
包括：结晶法；分散法；物理吸附法；离子结合法
1. 结晶法：
就是使酶结晶从而实现固定化的方法,它提 供了非常高的酶浓度,从而提高了效率.刚性 强,结构稳定 • 其局限性是:在不断的重复循环中,酶会有所 损耗.
2. 分散法：
就是通过酶分散于水不溶相中 从而实现固定化的方法。关键 是解决酶在水不溶相中的分布 以及酶在有机溶剂中的稳定性.
发酵液中含菌体少，有利于产品的分离纯化，提高产品质量等
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
• 缺点：酶与载体相互作用力弱，酶易脱落等 1）引入功能团和间隔臂；
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方 固定化后酶的哪些主要性质发生了变化?变化的趋势及原因分析.
常见非共价法?常见共价法?
法。 少量的持续不断的配基的脱落;
交联法由于不需要活化基团,所以条件比较温和,酶活的回收率比较高? 活力回收:指固定化后固定化酶(或细胞)所显示的活力占被固定的等当量游离酶(细胞)总活力的百分比. 第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。颗粒状占 绝大多数，它和线条主要用于工业发酵生产 ，薄膜主要用于酶电极。酶管机械强度较大 ，主要用于工业生产。
固定化酶的优势：
① 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶 液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；
② 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱 连续反应
③ 酶反应过程能够加以严格控制； ④ 较游离酶更适合于多酶反应； ⑤ 在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； ⑥ 可以增加产物的收率，提高产物的质量； ⑦ 酶的使用效率提高、成本降低。
在中性pH下优先与a-氨基反应,因此有一定的选择性 缺点：在包埋过程发生的化学反应同样会导致酶的失活。
• 优点：酶活性中心不易被破坏，酶高级结构 二、载体活化程度和固定化配基密度的测定
固定化过程中，酶分子空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；
用此法制备的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等。
不溶性载体的固定化方法。（DEAE-纤维素 可以增加产物的收率，提高产物的质量；
（二）克隆基因产物高效表达并且稳定性也明显提高；
，DEAE-葡萄糖凝胶,CM-纤维素等） 固定化死细胞:比较适合于单酶催化反应,可以增加细胞的通透性.
其比例在一定程度上和酶的浓度与交联试剂的浓度有关，也与pH、离子强度有关。 包埋法属于共价还是非共价固定化?有什么优劣? 特点：一定的机械性能，能定向将酶等包裹物质携带到一定部位然后释放，具有更大的定向性； 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应 固定化酶的活力一般比天然酶小，专一性也有所变化。 固定化酶成本要低，以利于工业使用。
• 优点：操作简单，条件温和，酶活性中心和 发酵液中含菌体少，有利于产品的分离纯化，提高产品质量等
固定化酶必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮藏，利于反复使用；
高级结构不易受到破坏，酶活回收率比较高 用于酶的固定条件特别温和.
包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分子底物不能透过膜与酶接触。 用此法制备的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等。
酶与细胞的固定化
第一节：酶的固定化
一．固定化酶的定义及其特点
酶的固定化:利用一定措施将酶束缚或限 制于一定区域内，仍能进行其特有的催 化反应，并可回收及重复使用的一类技 术。
固定化酶:在一定空间内呈闭锁状态存在 的酶,能连续地进行反应,反应后的酶可以 回收使用.(不一定是固体)
固定化酶的形状:
固定化酶的缺点： 固定化时，酶的活力有损失；
只能用于可溶性底物，而且较 适用于小分子底物，对大分子 底物不适宜；
增加了生产的成本，工厂初始 大；
与完整菌体相比不适宜于多酶
二：固定化酶的制备原则：
1. 必须注意维持酶的催化活性及专一性。酶活性中 心不能受到破坏或与载体结合，尽量避免破坏酶 高级结构的条件，固定化的条件要温和。
2. 分散法：
提高水不溶溶剂中酶反应速率的途径 ：
• 正确的体系和贮存状态使酶粉充分分散（ 加入有利于分散的化合物,如PEG）；
• 通过与亲脂化合物的共价连接能增加酶在 有机相中的溶解度，包埋在膜体系中或通 过多相反应来实现酶的固定化；
• 将酶吸附到多孔载体中；
3. 物理吸附法：
少量的持续不断的配基的脱落; 包埋法属于共价还是非共价固定化?有什么优劣? 重氮法 是将带芳香族氨基的载体，先用NaNO2和稀盐酸处理成重氮盐衍生物，再在中性偏碱(pH8—9)条件下与酶蛋白发生偶联反应 ，得到固定化酶。
2. 固定化应有利于生产的自动化、连续化；
3. 固定化酶必须结合牢固，从而使固定化酶能回收 贮藏，利于反复使用；
4. 固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物 、产物或反应液发生化学反应；
5. 固定化酶成技术,固定化酶 • 为什么要进行酶的固定化? • 固定化酶有何优劣性? • 固定化酶技术的基本原则有哪些? • 固定化酶就是使酶从游离状态变成固体? • 固定化酶的活力比游离酶高? • 固定化酶更有利于多酶反应? • 固定化酶可以节省成本?
。 细胞标记、分离和性质研究：将细胞表面抗原分子对应地抗体偶联于载体上。
4. 离子结合法：
酶通过离子键结合于具有离子交换基的水 交联法由于不需要活化基团,所以条件比较温和,酶活的回收率比较高?
相对活力：固定化酶总活力/（加入酶总活力-上清液中末偶联的酶活力）*100% 长臂上另一端的氨基再与经过溴化氰CNBr活化了的琼脂糖偶联,从而得到固定化的辅酶.
三：酶的固定化方法
• 酶的固定化方法很多，但没有 普遍适应的方法，必须根据不 同酶及其不同的用途通过反复 试验选择。
常用的固定化方法有：
(按化学反应的类型分)
分类 固定化方法
固定化方法 分类
非共价结合法
结晶法 分散法 物理吸附法 离子结合法
化学结合法 包埋法
交联法， 共价结合法
微囊法， 网格法
固定化酶的模式图
（一）非共价结合法
包括：结晶法；分散法；物理吸附法；离子结合法
1. 结晶法：
就是使酶结晶从而实现固定化的方法,它提 供了非常高的酶浓度,从而提高了效率.刚性 强,结构稳定 • 其局限性是:在不断的重复循环中,酶会有所 损耗.
2. 分散法：
就是通过酶分散于水不溶相中 从而实现固定化的方法。关键 是解决酶在水不溶相中的分布 以及酶在有机溶剂中的稳定性.