以TNF—α刺激A549细胞构建急性肺损伤细胞模型

以TNF—α刺激A549细胞构建急性肺损伤细胞模型
目的构建急性肺损伤体外细胞模型。

方法以TNF-α 10ng/mL刺激肺泡Ⅱ型上皮A549细胞，采用酶联免疫吸附法检测细胞上清液中IL-4、IL-1 B浓度，比色法检测丙二醛浓度、总超氧化物歧化酶活力，RT-PCR及免疫印迹法分别检测NF-K B mRNA及蛋白的表达水平，流式细胞术检测细胞凋亡率。

结果以TNF-α刺激A549细胞，细胞上清液IL-1β、IL-4浓度上升；细胞内丙二醛增多，超氧化物歧化酶活力下降；NF-кB在基因及蛋白水平表达上调（P＜0.05）。

结论以TNF-α刺激肺泡Ⅱ型上皮A549细胞可诱导炎症反应放大、氧化应激失衡、NF-кB 通路活化、细胞凋亡增加，符合急性肺损伤的主要特点，可作为ALI体外细胞模型。

标签：急性肺损伤；细胞模型；炎症反应；肺泡Ⅱ型上皮细胞；核因子кB；
急性肺损伤（acute lung iniury，ALI）是临床常见急危重症，以进行性加重的呼吸困难、顽固的低氧血症为临床特征，其严重阶段可发展为成人呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）。

感染、有害物质吸入、外伤、休克、中毒等多种非心源性致病因素是引起急性肺损傷的常见因素，ALI/ARDs 缺乏特效治疗，发病率及病死率均处于高水平，因而其发病机制研究仍受科学家重视。

急性肺损伤模型构建是ALI机制研究的基础，在细胞模型上进行研究，再将实验成果在动物模型上进行验证，有利于降低动物实验的成本，提高成功率。

本研究结合急性肺损伤发生时，肺泡Ⅱ型上皮细胞在炎症反应、氧化应激、细胞凋亡、通路激活等方面的特点，对ALI细胞模型的构建进行探讨。

1材料与方法
1.1材料
A549细胞由福建医科大学附属第二医院中心实验室提供，RPMI-1640培养基、小牛血清、胰酶来自于Hyclone公司，重组人肿瘤坏死因子-α购自美国的Pepro Tech公司，NF-кB抗体、内参βactin抗体购自美国CST公司，Trizol购买于Invitrogen公司，PCR引物由上海英骏公司合成，RT-PCR及荧光定量PCR试剂购自TaKaRa公司，细胞因子IL-4、IL-1 β ELISA法检测试剂盒、RIPA细胞裂解液、SOD及MDA检测试剂盒、BCA法蛋白浓度测定试剂盒购自江苏碧云天公司。

AnnexinV/PI细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。

1.2细胞培养及实验分组
A549细胞在含100U/mL链霉素、100U/mL青霉素、10%灭活小牛血清的RPMI-1640培养基中培养，2～3天传代1次，取处于对数生长期的细胞用于实验。

本实验分为实验组和对照组。

将细胞以2×105/mL接种于6孔板，待贴壁细胞融合度达到70%，实验组更换为含肿瘤坏死因子-α（10ng/mL）的培养基继续培养，对照组未进行TNF-α刺激，24小时后分别收取培养上清及细胞标本备检。

1.3Real-time RT-PCR检测NNF-кB基因表达水平
TRIZOL法提取细胞总RNA，RT-PCR反应体系（20μL）：5×酶混合物4μL，RNA 1μg，DEPC水补足至20μL；逆转录条件：37℃，15min，85℃，5sec。

real-time PCR反应体系（25μL）：2×含酶混合物12.5μL，上、下游引物各1.0μL，cDNA 2.0μL，超纯水8.5μL。

real-time PCR反应条件：95℃预变性30s；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s（40cycles）。

设定在每个循环的退火期结束后程序自动记录该循环的荧光值，以表示在该循环结束时PCR产物的量。

同时扩增β-actin、NF-кB，以β-actinmRNA为参照进行相对定量，相对定量计算由Rotor-Gene Q 1.7.94软件完成。

相关引物序列见表1。

1.4免疫印迹法检测各组细胞总蛋白NF-кB的水平
按照说明书，提取细胞总蛋白，BCA法进行蛋白定量，加入loading buffer 后，金属浴100℃，5分钟变性后，取20ug进行SDS-PAGE电泳，电转90min，5%脱脂奶粉室温封闭2h，置于一抗（NF-KB抗体1：1000、内参β-actin抗体1：400）中4℃孵育过夜，TBST漂洗后，辣根过氧化物酶标记的二抗（1：2000）室温孵育1h，TBST洗膜3次，每次10min，ECL法发光，显影及曝光。

采用QuantityOne软件分析条带灰度值，计算NF-кB与β-actin的灰度比值，以此表示NF-кB蛋白相对量。

1.5酶联免疫吸附测定法检测细胞上清液中IL-4、IL-1β的含量
收集细胞培养液，离心并取得上清，根据说明书操作，应用酶标仪测定各样本OD值（波长450nm），根据所得标准曲线计算IL-4、IL-1β的含量。

1.6氮蓝四唑比色法检测细胞内总超氧化物歧化酶（SOD）活力
裂解各组A549细胞并测定蛋白浓度，根据说明书操作，酶标仪测定各样本OD值（波长450nm），根据公式计算单位重量蛋白的SOD活力单位，结果以“Unit/mg蛋白”为单位表示。

1.7硫代巴比妥酸比色法检测细胞的丙二醛（MDA）浓度
裂解各组A549细胞，测定蛋白浓度，结合说明书操作，酶标仪测定各样本OD值（波长530nm），计算获得标准曲线，进而计算样本MDA浓度，除以样本总蛋白量，即“μmoL/mg”为MDA水平。

1.8流式细胞仪检测细胞凋亡率（AnnexinV/PI法）收集各组细胞，根据说明书将细胞孵育染色后上机检测，Annenxin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

根据所获数据计算细胞凋亡率。

1.9统计学分析
应用SPSS21.0软件包，计量资料以（xs）表示，采用两独立样本的t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果
统计结果显示，实验组NF-к B mRNA相对表达量较对照组明显上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。

实验组NF-кB蛋白相对表达量较对照组明显上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。

实验组IL-1β浓度较对照组明显上调，实验组IL-4浓度较对照组明显上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。

实验组SOD浓度较对照组明显下降，实验组MDA浓度较对照组明显上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。

实验组细胞凋亡率较对照组明显上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。

见表2，图1。

3讨论
肺泡上皮细胞凋亡是ALI/RDS重要的病理生理过程之一。

肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡导致呼吸膜完整性受损，肺表面活性物质无法发挥正常作用，继而出现肺泡萎陷、微肺不张及肺水肿。

因此，以肺泡Ⅱ型上皮细胞作为研究对象進行ALI 模型构建具有代表性。

TNF-α是重要的前炎症因子，在ALI炎性反应中释放最早，能促发其他细胞因子的释放。

因此，本课题以TNF-α作为单一刺激因素，尝试模仿急性肺损伤时的细胞炎症-氧化损伤。

IL-1β出现在急性呼吸窘迫综合征早期，可与TNF-α协同启动炎性反应，是重要的促炎细胞因子；IL-4是作为抗炎细胞因子，能通过抑制IL-1、TNF-α等炎症介质的合成，或者干预某些炎症细胞的功能而发挥抗炎作用。

氧化应激也是ALI/ARDS发生、发展的机制之一，脂质过氧化生成大量新的ROS和高细胞毒性的丙二醛（MDA），测定丙二醛浓度可反应细胞损伤程度；超氧化物歧化酶（SOD）广泛存在于生物体内，能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，是重要的氧自由基清除剂。

本研究结果表明，经TNF-α刺激的A549细胞（实验组），其促炎因子IL-1β和抗炎因子IL-4浓度上升，提示炎症反应水平被放大；其氧化物MDA生成增加，抗氧化物SOD消耗增加，提示氧化应激失衡；实验组细胞的凋亡率较对照组升高；上述结果均符合ALI/ARDS发生、发展过程中TNF-α启动“瀑布式炎症级联反应”并继发氧化应激、细胞凋亡的病理生理特点。

NF-кB作为经典的转录因子，广泛参与了炎症反应、免疫反应、细胞增殖与凋亡等生理病理过程。

本实验结果表明TNF-α可上调NF-KBmRNA.活化NF-кB，提示NFкB信号通路参与TNF-α诱导A549细胞产生过度炎症反应、诱导细胞凋亡的过程。

综上本研究以TNF-α刺激肺泡Ⅱ型上皮细胞A549，成功地在体外细胞上模拟了急性肺损伤发生时过度炎症反应、氧化应激、细胞凋亡、细胞通路活化的病理生理过程，为急性肺损伤细胞模型研究提供参考依据。