细胞毒性实验总结

细胞毒性实验总结
一、抗HBV药物细胞毒性实验背景知识 (1)
二、细胞毒性实验方案的确立 (3)
三、细胞毒性实验方法稳定后的部分数据 (4)
四、细胞毒性实验质量评价指标 (5)
五、细胞毒性实验SOP (6)
（一）目的 (6)
（二）适用范围 (6)
（三）责任人 (6)
（四）规程 (6)
1. 试验准备 (7)
2. 试验操作 (8)
3．数据处理和分析 (8)
六、总结 (9)
一、抗HBV药物细胞毒性实验背景知识
细胞毒性是化学物质（药物）作用于细胞基本结构和/或生理过程，如细胞膜或细胞骨架结构，细胞的新陈代谢过程，细胞组分或产物的合成、降解或释放，离子调控及细胞分裂等过程，导致细胞存活、增殖和/或功能的紊乱，所引发的不良反应。

按作用机制可分3种类型：①基本细胞毒性，涉及一种或多种上述结构或功能的改变，作用于所有类型的细胞；②选择细胞毒性，存在于某些分化细胞上，主要通过化学物质的生物转化，与特殊受体结合或特殊的摄入机制所引发；③细胞特殊功能毒性，对细胞结构和功能损伤轻微，但对整个机体损伤非常严重。

类似毒性作用可通过细胞因子、激素和递质的合成、释放、结合和降解影响细胞与细胞间的交流或特殊的转运过程而实现。

毒性作用也可能来自化学物质对细胞外过程的干扰，任何一种非动物检测系统对多种因素都应加以考虑。

1983年Ekwall提出“基本细胞功能”的概念，即多数化学物质毒性作用是对细胞功能的非特异性损伤，却可引起器官功能的特异性改变甚至机体死亡。

有研究显示化学物质体外细胞毒性与其引起的动物死亡率及人体死亡的血药浓度之间都存在良好的相关性。

化学物质产生的损伤和死亡，最终可表现为细胞水平上的改变，由此推测体外细胞毒性可以预测体内急性毒性。

体外方法有助于预测化学物质急性暴露引发的全身和局部影响，并评估体内毒性浓度。

目前较为理想的抗HBV药物有拉米夫定（3TC）、恩替卡韦（ETV）等。

3TC是核苷左旋对呋体，早期用于艾滋病的治疗。

拉米夫定体外能抑制艾滋病毒1、2型及乙型肝炎病毒逆转录酶，在人淋巴细胞和单核细胞内抑制艾滋病毒逆转录酶活性，在HBV-DNA转染的人肝癌细胞内有抑制HBV-DNA复制，在HBV感染黑猩猩体内有抑制病毒作用。

拉米夫定作用原理是药物进入细胞器，为细胞脱氧胞嘧啶激酶和细胞激酶磷酸化为活性5-三磷酸拉米夫定，竞争性抑制
依赖于病毒DNA和RNA逆转录酶。

恩替卡韦（ETV）为环氧羟碳脱氧鸟苷，具有较强的抗HBV作用，也可抑制拉米夫定引起的YMDD变异病毒株感染。

在体外应用HBV DNA转染的HepG2 细胞作药敏试验，结果该药抗HBV作用最强。

恩替卡韦､拉米夫定､泛昔洛韦抑制HBV 的半数有效浓度(EC50)分别为0.00375 μmol/L、0.116 μmol/L（文献报道多在几nM到几个μM，范围较宽）、≥100 μmol/L。

在土拨鼠肝炎病毒（WHV）感染的土拨鼠动物模型，口服恩替卡韦0.1 mg/kg.d共12周，血清WHV转阴。

以后，每周口服0.1 mg/kg，血清WHV仍维持阴性。

因此3TC和ETV常被用作抗HBV药物筛选时的阳性对照药，用来评价筛选系统的正常与否。

3TC ETV
通常的做法是：将不同浓度的3TC加入到培养的细胞中，作用一定时间后检测药物对细胞的毒性。

检测方法有MTT法、XTT法、荧光检测法等。

其中MTT法和XTT法原理相同，由于其方法简单快速，不需特殊的仪器设备，因此得到了广泛应用。

MTT法是二十世纪八十年代发展起来的一种快速、简便的测试方法，目前已被广泛用于药物体外筛选实验。

MTT法是一种检测细胞活性的方法。

与以往细胞水平研究中检测细胞活性的两种常规方法--细胞计数法和同位素掺入法相比，MTT法具有操作简便、快速、准确、廉价及不使用同位素等优点，已广泛应用于生物医学的诸多领域。

同时，MTT法也是FDA及我国药品审批部门推荐的检测方法之一。

其基本原理如下：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够还原黄色的溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑[3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenylterazolium bromide，MTT]为蓝紫色的不溶于水的甲臜（formazan），甲臜的生成量在通常情况下与活细胞数成正比。

由于甲臜的多少可通过酶标仪测定其在570nm处的吸光度（OD值）而得知，因此可根据OD值推测出活细胞的数目，从而了解药物抑制或杀伤细胞的能力。

目前已有MTT的升级替代产品，如XTT、MTS、WST-8等，三种方法的比较见下表。

尽管CCK-8方法简便、准确、灵敏度高，但比MTT的价格要贵不少，所以一般来说，还是MTT 法用的多。

三种方法的比较
二、细胞毒性实验方案的确立
在确定MTT法作为细胞毒性实验的方法之后，我们对实验中可能涉及的各个参数进行了摸索和优化。

最初，由于一切都是未知，因此常常几个参数一起调整，使得各个参数对结果的影响不是很清楚，走了一些弯路。

后期逐渐摸清了参数对结果影响的权重，实验方案逐步确立。

考虑的实验参数有：细胞批次、细胞密度、孵育时间、加药次数、MTT量、MTT孵育时间、DMSO溶解时间（振荡时间）等。

经过实验，最终将实验参数确定如下：
seeding time 1d
incubation time 7d
FBS 2%
volume 180μl
其中，孵育时间采用7天，主要是希望缩短筛选周期，10天也取得了较好的结果。

培养基体积对结果影响不大。

采用180μl主要是和DNA增殖抑制实验保持一致。

三、细胞毒性实验方法稳定后的部分数据
在细胞毒性实验方案稳定之后，在各孔吸光度的标准差、变异系数和各孔抑制率的标准差都可以控制在很低的水平，表明该实验方案是稳定的，具有良好的重现性。

典型ETV的CC50实验数据
Date:09/07/07 Conc.(uM) value1 value2 value3 Mean STDEV %CV % Viability %STDEV compound: ETV 200 2 0.215 0.017 8.019 11.641 0.160 cell density:5x103 100 0.369 0.021 5.736 20.011 0.493 incubation time: 7 50 0.858 0.025 2.911 46.529 2.720 drug adding:2 times 25 1.227 0.135 10.967 66.540 9.949 2%FBS 1.480 0.067 4.504 80.278 0.320 180ul 1.620 0.068 4.179 87.834 0.051 1# plate 1.740 0.052 2.989 94.342 0.057 CC50= 40.4uM 0 1.844 0.042 2.251 100.000 0.000
典型3TC的CC50实验数据
Date:09/07/07 Conc.(uM) value1 value2 value3 Mean STDEV %CV % Viability %STDEV compound: 3TC 8000 0.209 0.039 18.815 11.796 1.902 cell density:5x103 4000 72 0.019 3.238 32.335 1.739 incubation time: 7 2000 0.842 0.050 5.994 47.598 4.990 drug adding:2 times 1000 1.307 0.015 1.111 73.884 3.056 2%FBS 500 1.588 0.034 2.166 89.768 4.966 180ul 250 1.648 0.009 0.529 93.160 2.795 2#plate 125 1.710 0.061 3.571 96.646 0.241 CC50= 2130uM 0 1.769 0.017 0.934 100.000 0.000
四、细胞毒性实验质量评价指标
对细胞毒性进行质量评价的指标初步定为以下7个：
1.OD平均值：反映复孔间OD值的平均水平，OD值越大，细胞数越多。

2.复孔OD值间的标准差（STDEV）：反映各复孔OD值之间的离散情况。

标准差越大，
说明复孔间不平行性越大，操作误差越大。

3.复孔OD值间的变异系数（CV）：也是反映复孔间OD值离散情况的指标。

由于OD
值间的标准差（STDEV）的单位和OD的单位是一致的，不能体现离散的权重，因此
引入变异系数（CV）。

这一指标以百分比的形式表现OD值的离散情况，形象、直观。

4.存活率（％Viability）：计算各药物浓度下细胞的存活率可以反映细胞存活情况，该值
越大，说明药物的细胞毒性作用越小。

5.存活率的标准差（％STDEV）：该值反映如以每个复孔均作为单独的实验，则同批的
复孔可以看作数批实验，此时存活率的分布情况。

该指标越大，说明复孔间越不平行。

6.存活率的变异系数（％CV）：该指标反映各复孔间存活率的离散情况，该值越大，说
明说明每一列细胞孔（即一系列稀释单孔）间不平行性越大。

7.半数致细胞毒性浓度（concentration of cytotoxicity 50%，CC50）：指对半数细胞产生
毒性作用所需浓度。

该指标可用来反映实验系统是否正常工作及评价未知药物对细胞
的毒性。

五、细胞毒性实验SOP
化合物抗HBV活性细胞毒性实验标准操作规程（MTT法）
（一）目的
使实验操作标准化，保证正常工作的进行。

（二）适用范围
本标准适用于MTT法检测抗HBV药物细胞毒性的操作及计算CC50。

（三）责任人
分子生物学组操作人员对本规程负责。

（四）规程
术语：
CC50（concentration of cytotoxicity 50％）：半数细胞毒性浓度，指对半数细胞产生毒性作用所需浓度。

在本实验中，指致50％细胞死亡所需的药物浓度。

本实验旨在通过MTT法检测未知化合物对转染了HBV基因组的细胞系HepG的细胞毒性。

背景知识：
MTT法是二十世纪八十年代发展起来的一种快速、简便的测试方法，目前已被广泛用于药物体外筛选实验。

其基本原理如下：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够还原黄色的溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑[3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenylterazolium bromide, MTT]为蓝紫色的不溶于水的甲臜（formazan），甲臜的生成量在通常情况下与活细胞数成正比。

由于甲臜的多少可通过酶标仪测定其在570nm处的吸光度（OD值）而得知，因此可根据OD值推测出活细胞的数目，了解药物抑制或杀伤细胞的能力。

MTT法是一种检测细胞活性的方法。

与以往细胞水平研究中检测细胞活性的两种常规方法--细胞计数法和同位素掺入法相比，MTT法具有操作简便、快速、准确、廉价及不使用同位素等优点，已广泛应用于生物医学的诸多领域。

同时，MTT法也是FDA及我国药品审批部门推荐的检测方法之一。

1.试验准备
1.1.试剂和耗材：
1.1.1试剂：胎牛血清（FBS）；G418；DMEM培养基（高糖）；0.25%Trypsin-EDTA；磷酸
盐缓冲液（无钙、镁）；DMSO；
1.1.2耗材：0.2 μm针头过滤器（有机相和水相）；1 ml和10 ml注射器；96孔细胞培养板；移
液管（5 ml、10 ml）；移液器Tip头。

1.1.3溶液配制：
1.1.3.1完全培养基：DMEM和FBS按9︰1（体积比）混和，并添加1/100～1/50（体积比）的hepes
和终浓度为380 μg/ml的G418。

维持培养基：DMEM和FBS按49︰1（体积比）混和，并添加1/100～1/50（体积比）的
hepes和终浓度为380 μg/ml的G418。

1.1.3.2磷酸盐缓冲液（无钙、镁）：8 g/L NaCl，0.2 g/L KCl，1.44 g/L Na2HPO4，0.24 g/L KH2PO4，
pH7.4，高压蒸汽灭菌121℃ 20 min，4℃保存。

（注意：实际配制时，有些试剂含多个分子的水，需将该部分的质量算进去。

）
1.2.细胞培养：HepG培养采用完全培养基，于37℃，5%CO2细胞培养箱培养。

接种时，细胞
密度控制在1×105/ml～2×105/ml左右。

1.3.细胞计数：见附件《细胞计数》。

1.4.细胞铺板：细胞计数后，用完全培养基稀释成×104 ml，在5%CO2，37℃培养24 h备用。

注意：在向96孔细胞培养板中接种细胞时，应注意每次吸取细胞悬液前，都应轻轻摇匀，尽量减少每次吸取的细胞数目的差异。

1.5.将药物用少量DMSO溶解，并用0.2 μm一次性针头过滤器（有机系）过滤除菌，此为母液
（其浓度通常为预先设计的最高待测浓度的1000倍或以上）；然后用维持培养基将母液稀释到实验预先设计的最高待测浓度。

如配制的母液体积过小（如低于1 ml），不便于过滤，可先用完全培养基将其稀释到最高待测浓度，再用0.2 μm一次性针头过滤器（水系）过滤后分装备用。

2.试验操作
2.1.药物稀释：药物采用倍比稀释。

可在EP管中稀释。

第一管为最高待测浓度的药液。

自第
二管分别加入一定量的维持培养基，然后从第一管吸取等量的药液至第二管，吹打混匀后，弃去tip头并换新tip头，从第二管吸取等量药液至第三管，吹打混匀。

依此操作直至倒数第二管。

最后一管为维持培养基，不含药物。

2.2.药物处理：弃去细胞培养液，注意吸除干净。

然后吸取已稀释的药液180 µl加到对应的细
胞孔中。

各浓度组均设三孔重复，最后一排孔为细胞对照。

另设培养基对照。

如图1。

2.3.加药后在5%CO2，37℃细胞培养箱培养72 h；按上述步骤换新鲜含药培养基，共2次。

最
后一次换药后再培养72 h，准备检测。

图1 黄色部分为PBS，无细胞；绿色为培养基对照；粉色、蓝色部分为两种不同的药物处理，每种药物设三个重复，8个浓度，红色部分为细胞空白对照。

2.4.MTT检测：将MTT母液（5mg/ml，10×）用PBS稀释为1×）。

去除各孔中的培养液（注
意：尽可能去除干净！），加入1×MTT，200 µl/孔，在37℃培养箱孵育1 h；去除MTT，向各孔加入DMSO，200 µl/孔，在酶标仪上振荡20 min，读取吸光度值（OD570），并打印结果。

3．数据处理和分析：
3.1将数据按药物种类、药物浓度、重复值整理到《Statistical Evaluation－CC50》工作表中，
并填写实验日期、相关参数（如细胞密度、药物名称等）。

文件自动计算吸光度值（OD 值）的平均值、平均值的标准差、吸光度值（OD）的变异系数、存活率、存活率的标准差等。

公式（借用Excel中的函数进行）：
平均值（mean）＝average[(value1-培养基对照平均值)：(value3-培养基对照平均值)]
标准差（STDEV）＝STDEV[(value1-培养基对照平均值)：(value3-培养基对照平均值)]
变异系数（%CV）＝标准差/平均值×100
存活率（%Viability）＝100×Mean(n)/Mean0
最后一列为存活率的标准差，由各孔的存活率计算获得，公式同上，平均值采用各孔吸光度值。

Date: Conc.(uM) value1 value2 value3 Mean STDEV %CV % Viability % value1 % value2 %value3 %STDEV compound: C1
cell density:C2
incubation time: C3
drug adding: C4
C5
C0
3.2利用作图软件对药物浓度和细胞存活率作图，进行S拟合，并计算半数细胞毒性浓度
（CC50），给出总结报告。

附：实验流程
六、总结
本文概述了抗HBV药物细胞毒性实验的背景、建立过程、部分结果、评价指标及实验标准操作规程，对该实验有一个整体的认识，并可指导新员工，使之尽快学会本实验操作，推进本组工作的进展。