核酸与核苷类药物PPT课件

生产菌株： （1）酶6、7缺失（为腺嘌呤缺陷型）积累IMP---肌 苷（肝炎辅助药）； （2）酶4缺失（为鸟嘌呤缺陷型）积累XMP---黄苷； （3）酶5缺失积累鸟苷。
• 发酵法生产肌苷
（1）肌苷生产工艺 （2）发酵工艺条件： ▪ 碳源为葡萄糖 ▪ 保证充足的氮源 ▪ 磷酸盐的影响 ▪ Mg+、Ca+有促进作用 ▪ 生长因子腺嘌呤或酵母粉要亚适量 ▪ 最适发酵温度为30--34℃，pH6.0—6.2 ▪ 需大风量,高溶氧和低CO2
发酵法生产核苷酸
1、发酵法生产肌苷酸（IMP） 肌苷酸钠是一种高效增鲜剂，在谷氨酸钠（味精）中加
2%，鲜度可增加3倍。因此，在味精中添加肌苷酸钠（或 鸟苷酸钠）后成为第二代特鲜味精。
产氨短杆菌嘌呤核苷酸生物合成途径、代谢调控和肌苷酸 发酵机制:
积累IMP的主要前提：
（1）阻断SAMP合成酶: 即选育缺该酶的菌株（嘌呤缺陷型），发酵前期提供适量
碱水解法生产2＇，3＇-混合核苷酸
RNA结构中的磷酸二酯键对于碱性条件不稳定，很容易生 成2′，3 ＇ -环状磷酸酯，此环状磷酸酯对碱更不稳定，很易 加水分解生成2＇，3＇-混合核苷酸。取RNA配成3％～3.5% 的水溶液，加氢氧化钠达0.3mol／L浓度，升温至38℃，保 温16～20小时，用6mol／L盐酸中和至pH7.0，从RNA水解 成2′，3＇-核苷酸的降解率达95％以上，将2′，3＇-混合核 苷酸制成每片含50～100mg的片剂，经临床使用，对非特异 性血小板减少症、对白血球减少症、癌肿的化疗和放疗后的 升白血球均有较好疗效。
后一类药物是治疗病毒感染性疾病、肿瘤的 重要手段，也是产生干扰素、免疫抑制的临 床药物。
正式用于临床的抗病毒核苷类药物有三氮唑 核苷、叠氮胸苷、阿糖腺苷等。
珍奥核酸
DNA药物
核苷类药物
恩替卡韦
二、核酸与核苷的一般理化性质
核酸
核苷酸
（DNA、RNA）
核苷 磷酸
核糖（核糖 脱氧核糖） 嘌呤（腺嘌呤、鸟嘌呤）
质。
1、RNA化学水解法制备核苷：
2、发酵法生产核苷
产率高、周期短、控制容易、产量大。 共同特点： （1）使用磷酸单酯酶活力很强的枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆 菌为诱变出发菌株； （2）具有特定标记的有变株； （3）发酵培养时需提供限量生长因素。 原菌株： （1）AMP强烈抑制PRPP转酰胺酶的活性，控制总代谢途径； （2）AMP抑制SAMP合成酶； （3）GMP抑制IMP脱氢酶
例二：鸟苷2mmol／L悬浮于5ml磷酸三甲酯中，温度控制 0℃，添加氯化氧磷6mmol／L，水2mmo/L，反应6h，5＇ -GMP摩尔产率达90%。
四、核苷的制备
核苷是多种核苷类药物的原料，在核酸类药物中占主导地位。 （1）以核苷及其结构类似物、衍生物为主药物多达几十种； （2）核苷类药物在抗病毒、抗肿瘤、增强免疫方面占重要地位； （3）核苷的发酵水平大大高于核苷酸，所以常做后者的前体物
碱基 嘧啶（胞、尿、胸腺嘧啶）
DNA和RNA是存在于细胞中的正常成分。 DNA主要存在于细胞核中，少量（2%）存在于线粒体和叶绿体中； RNA主要存在于细胞质中，少量（10%）存在于核仁、核浆和染色体中。
核酸的含量与细胞大小无关，以生长旺盛的组织细胞中含量较多，如 动物胰脏、脾脏、胸腺，植物的茎尖、根尖及各种分生组织等。
三、用酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸 1、酶解法及碱水解法制备核苷酸
酶解法制备脱氧核苷酸
桔青霉产生5`-磷酸二脂酶 红酵母产生3`-磷酸二脂酶
酶解法制备戊糖核苷酸
我国从60年代开始使用核酸酶P1降解核糖核酸生 产单核苷酸，日本年产呈味核苷酸（肌苷酸和鸟苷酸） 3000吨，其中60%是使用酶解法生产的。
第一节 概述
一、核酸与核苷类药物
核酸与核苷类药物是指具有药用价值的核酸、核 苷酸、核苷或者碱基
天然的、类似物、衍生物及其聚合物 作用：
➢ 影响生物的蛋白质合成和脂肪、糖类的代谢 ➢ 恢复正常代谢或干扰某些异常代谢
• 用途：放射病、血小板减少症、白细胞减少症、 急慢性肝炎、心血管疾病和肌肉萎缩、肿瘤、病 毒病
生物活性DNA的制备
[提取]
[洗涤3次]
5%SDS
动物内脏
沉淀
沉淀
上层液
（肝、脾）生理盐水
生理盐水
[再捣碎]
离心、30min
[沉淀]
[洗涤、干燥]
[提取]
纤维状DNA
粗品DNA
上清液
95%乙醇
冷乙醇、丙酮
水、5%SDS 离心
[沉淀]
[洗涤、干燥]
DNA沉淀
活性DNA
NaCL、95%乙醇
乙醇、丙酮
• 发酵法生产鸟苷和黄苷
鸟苷产生菌的特征： （1）嘌呤核苷酸分解酶活力强； （2）SAMP合成酶，GMP还原酶缺失； （3）解除AMP、GMP对PRPP转酰胺酶，肌苷酸
脱氢酶和GMP合成酶的反馈抑制；
• 发酵法生产腺苷
以肌苷生产菌（枯草杆菌）为诱变基础菌株。
诱变结果：
（1）腺嘌呤回复，腺嘌呤酶缺失； （2）黄嘌呤缺陷型，GMP还原酶缺失； （3）抗8杂氮黄嘌呤解除对PRPP转酰胺酶的抑制； （4）发酵不稳定的原因：黄嘌呤缺陷及腺嘌呤酶缺失与回复
工业用DNA的提取
[提取]
鱼精
[热变性]
[沉淀]乙醇
提取液
纤维状DNA
水、100℃ 冷却、离心
70%--80% （无生物活性）
15min 干燥
粗品DNA（热变性后无活性）
具有生物活性DNA的制备
动物内脏（肝、脾、胸腺）加4倍重量生理盐水经组织捣碎 机捣碎1分钟，匀浆于2500r／pm离心30分钟，沉淀用同样体 积的生理盐水洗涤3次，每次洗后离心，将沉淀悬浮于20倍重 量的冷生理盐水中，再捣碎3分钟，加入2倍量5％的（用45% 乙醇作溶剂）十二烷基磺酸钠，并搅拌2～3小时，在 0℃2500r／pm离心，在上层液中加入等体积的冷95％乙醇， 离心即可得到纤维状DNA，再用冷乙醇和丙酮洗涤，减压低 温干燥得粗品DNA。粗品DNA溶于适量蒸馏水，加入5％十 二烷基磺酸钠达1／10体积，搅拌1小时，经5000r／pm离心 1小时，清液中加入NaCl达1mol／L，再缓慢加入冷95%乙 醇，DNA析出，经乙醇、丙酮洗涤，真空干燥得具有生物活 性的DNA（活性DNA制备需在0～3℃操作）。
稀碱法：是用氢氧化钠溶液（1%），使细胞壁变性，使 核酸从细胞内释放出来。需用酸中和PH7。然后除去菌体， 将pH调至RNA的等电点（pH2.5），使RNA沉淀出来。上法 的缺点是制得的RNA Mr较低,(磷酸单脂酶、磷酸二脂酶降解 RNA，90 ℃保持3－4h破坏酶)。
浓盐法：是用高浓度盐溶液（6%－8%）处理，同时加热， 以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。
核酸类物质药物一般可分为两大类：
一类具天然结构的核酸类物质，
另一类是自然结构碱基、核苷、核苷酸的结 构类似物或聚合物。
前者是生物体合成原料或蛋白质、脂肪、糖生物合成
与降解以及能量代谢的辅酶，这一类药物有助于改善机体 的物质代谢和能量平衡，加速受损组织的修复，促使缺氧 组织恢复正常生理机能，临床上已广泛使用于放射病、血 小板减少症、白细胞减少症、急慢性肝炎、心血管疾病、 肌肉萎缩等病症的治疗，包括肌苷、辅酶A、GTP、CTP、 UTP、ATP、腺苷、辅酶I、辅酶Ⅱ等，多数是生物体自 身能够合成的物质，具有一定临床功能，毒副作用小，基 本都可经微生物发酵或从生物资源中提取。
在菌体内RNA含量的变化受培养基组成影响，其中关键 是铵离子浓度和磷酸盐浓度。培养酵母菌体收率高，易于提 取RNA。
很显然在许多酵母中，早期细胞中的RNA含量高，其确切 数值取决于碳、氮比例和培养基组成等。
（2）高RNA含量酵母菌株的筛选
可以从自然界筛选到RNA含量高的酵母菌株，也可用诱变 育种的方法提高酵母菌的RNA含量。
第二节 制备的一般过程与原理
一、RNA的提取与制备
工业用RNA的提取
（ 1 ） RNA 及 其 工 业 来 源 ： 从 微 生 物 中 提 取 RNA是工业上最实际和有效的方法。一些最 常见的菌体含有丰富的核酸资源，如酵母、白 地霉、多种抗菌素的菌丝体——青霉素，制霉 菌素等菌体。
通常在细菌中RNA占5％～25％，在酵母中 占2.7％～15％，在霉菌中占0.7%～28％。
RNA提取实例：
[提取]
[中和] HCl
[酸化、沉淀]HCl
酵母
提取液
上清液
RNA
NaOH、水
pH 7、离心
pH 2.5、离心
二、DNA的提取与制备
工业用DNA的提取
取新鲜冷冻鱼精20kg，用绞肉机粉碎2次成浆状，加入等体 积水，搅拌均匀，倾入反应锅内，缓慢搅拌，升温至100℃， 保温15分钟，迅速冷却至20～25℃，离心除去鱼精蛋白等沉 淀物，获得35L含热变性DNA的溶液，经精确测定DNA含量 后直接可用于酶法降解生产脱氧核苷酸。如要制成固体状DNA， 在热变性DNA溶液中逐渐加入等体积95％乙醇，离心可获得 纤维状DNA，沉淀用乙醇、丙酮洗涤，减压低温干燥得DNA 粗品，产品含热变性DNA50％～60％。
酶解法生产5‘—单核苷酸工艺流程
双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（I＋G）
呈味核苷酸的主要品种是肌苷酸钠和鸟苷酸钠， 商品名简称为（I＋G），用核酸酶Pl降解RNA可获得 GMP和AMP，其中AMP经脱氨生成IMP。双酶法生 产（I十G）工艺 。
菌体自溶法生产核苷酸
磷酸二酯酶在合适的条件下降解细胞内的RNA可产生5′核苷酸。在国内用谷氨酸产生菌体自溶法生产5‘-核苷酸。 （1）菌体自溶法生产核苷酸工艺流程：
（菌种传代中）。
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第三节 核酸与核苷类药物的制备举例
（一）叠氮胸苷（Azidothymidine，AZT） 1、结构与性质
AZT是1987美国FDA批准的治疗艾滋病的新药 。AZT的 药理作用是人体内经磷酸化后生成了3`-叠氮-2′-脱氧胸腺嘧 啶核苷酸，后者取代了正常的胸腺嘧啶核苷酸参与病毒DNA 的合成，含有AZT成份的DNA不能继续复制，从而达到阻止 病毒增殖的目的。
腺嘌呤，以满足菌体生长； （2）保持 PRA 合成畅通，即后期没有多余腺嘌呤阻遏该步
反应； （3）要使IMP渗出胞外，选育对Mn+不敏感菌株； （4）生成的IMP不被降解，恰好原菌株该酶活力低。
2、混合培养法发酵生产鸟苷酸（GMP）:
直接发酵法生产GMP必需满足以下条件
（1）解除GMP的反馈抑制（与GMP积累相勃）; （2）改变细胞对GMP的透性; （3）不分解生成GMP
只能先合成XMP，后转化为GMP： 方法如下：
选育鸟嘌呤、腺嘌呤缺陷型菌株，同时解除PRPP转酰胺 酶及XMP合成酶的阻遏，积累大量XMP(GMP合成酶及 SAMP合成酶缺失）。
XMP转化为GMP菌株的条件:
(1)GMP不被分解 (2)GMP合成酶活力要强化(抗生素激动剂) (3)增加细胞通透性
半合成法制备核苷酸
2、生产工艺
此合成路线的起始原料是胸苷，目前主要是从DNA水解 法制备，由于原料来源少，合成路线较复杂，成本很高。
已见报道的胸苷合成方法还有两条途径：
①从2′-脱氧胞苷或2′-脱氧鸟苷或2＇-脱氧腺苷与胸腺嘧啶 反应，经大肠杆菌产生的磷酸化酶催化生成胸苷。
②从鸟苷（300mmol／L）与胸腺嘧啶（300mmol／L） 反应，在欧文氏菌AJZ992所产生的嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶 核苷磷酸化酶的催化下生成5′-甲基尿苷，然后经化学法合成胸 苷。
要避免分子降解，可采用苯酚法制备RNA。用苯酚处理生 物材料，使蛋白质变性，然后离心，上层水溶液内含有全部 RNA，可用乙醇沉淀出来。脱氧核糖核蛋白溶于浓盐溶液 1mol/L,不溶于0.14mol/L,而核糖核蛋白溶于0.14mol/L盐 溶液。
（3）RNA的提取实例：
啤酒酵母是提取RNA的很好的资源。取100g压榨啤酒 酵母（含水份70%），加入230ml含NaOH 3g的水， 20℃以下缓慢搅拌30分钟。用6mol／L HCl调至pH7， 搅拌15分钟，离心得清液255m1。冷至10℃以下，6mol ／L HCl调pH2.5，置冷过夜，离心得RNA l.8g（纯度80 ％）。
由于发酵法生产核苷的产率很高，核苷悬浮于磷酸三甲酯 或磷酸三乙酯中，在冷却条件下加入氯化氧磷，进行磷酸化， 从核苷生成5′-核苷酸收率可达90%。
例一：肌苷2mmol／L悬浮于5ml磷酸三乙酯中，温度控制 0℃，添加氯化氧磷6mmol／L，水2mmol／L，反应2h， 5＇-IMP摩尔产率达91％。