《生物化学》实验讲义

实验一蛋白质及氨基酸的颜色反应
一、目的意义
1、学习几种鉴定氨基酸与蛋白质的一般方法及其原理。

2、学习和了解一些鉴定蛋白质的特殊颜色反应及其原理。

二、实验原理
1、双缩脲反应
当尿素加热到180℃左右时，2分子尿素发生缩合放出1分子氨而形成双缩脲.双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的紫红色化合物,这一呈色反应称为双缩脲反应。

蛋白质分子中含有多个与双缩脲相似的键，因此也具有双缩脲的颜色反应.借此可以鉴定蛋白质的存在或测定其含量。

应当指出，双缩脲反应并非蛋白质的特异颜色反应，因为凡含有肽键的物质并不都是蛋白质.
2、茚三酮反应
蛋白质与茚三酮共热,产生蓝紫色化合物，此反应为一切蛋白质及α-氨基酸（除脯氨酸和
羟脯氨酸）所共有。

含有氨基酸的其他化合物也呈此反应.
该反应十分灵敏，1:1500000浓度的氨基酸水溶液就能呈现反应。

因此，此反应广泛用于氨基酸的定量测定.
3、黄色反应
含有苯环侧链的（特别是含酪氨酸）蛋白质溶液与硝酸共热时，呈黄色（硝基化合物)，再加碱则变为橙黄色，此反应也称为黄蛋白反应。

OH+HNO
3HO NO2+H
2
O
HO NO2+O N
OH
三、仪器与试剂
1、试剂
(1) 蛋白质溶液：取10mL鸡蛋清,用蒸馏水稀释至100mL,搅拌均匀后用纱布过滤得上清液。

（2) 0。

3％色氨酸溶液、0。

3%酪氨酸溶液、0。

3％脯氨酸溶液、0。

5％甘氨酸溶液、0.5%苯酚溶液。

(3） 0.1％茚三酮－乙醇溶液:称取0。

1g茚三酮，溶于100mL 95％乙醇。

(4） 10%NaOH溶液、1％硫酸铜溶液、尿素、浓硝酸.
2、仪器：试管及试管夹、酒精灯。

四、操作方法
1、双缩脲反应
(1) 取一支干燥试管，加入少量尿素,用微火加热使之熔化,待熔化的尿素开始变硬时停止加热。

此时，尿素已缩合为双缩脲并放出氨气（可由气味辨别）.待试管冷却，加入约1mL10％NaOH溶液，振荡使其溶解，再加入1滴1%硫酸铜溶液。

混匀后观察出现的粉红色. (2）另取1支试管，加入1mL蛋白质溶液，再加入2mL 10%NaOH溶液摇匀，然后再加入2滴1%的硫酸铜溶液。

摇匀观察其颜色变化.
(3) 注意事项
加入的硫酸铜不可过量，否则会产生蓝色的氢氧化铜，从而掩盖了双缩脲反应的粉红色。

(4）记载上述实验过程和结果,并解释现象.
2、茚三酮反应
(1) 取3支试管,分别加入蛋白质溶液、0.3％脯氨酸溶液、0.5％甘氨酸溶液各1mL，再加0.5mL
0.1％茚三酮－乙醇溶液，混匀后在小火上加热煮沸1－2min,放置冷却，观察颜色变化。

(2) 在滤纸的不同部位分别滴上一滴0。

3％脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液，风干后再在原处
滴一滴0.1%茚三酮－乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察斑点出现及其颜色。

(3）记载上述实验过程和结果，并解释现象。

3、黄色反应
向6个试管中按下表加试剂,观察现象并记录。

实验二蛋白质的沉淀反应
蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶性盐类后，即自溶液中沉淀析出（浑浊现象），此现象叫蛋白质的沉淀反应。

（一）蛋白质的盐析作用
一、目的意义
了解盐析法及可逆沉淀的原理，学习用盐析法沉淀分离蛋白质.
二、实验原理
盐析现象是指—般蛋白质在高浓度盐溶液中溶解度下降，故向其溶液中加入中性盐至一定浓度时，蛋白质即自溶液中沉淀析出。

盐析作用与两种因素有关:①蛋白质分子被浓盐脱水；
②分子所带电荷被中和。

盐溶现象为低盐浓度可使蛋白质的溶解度增加,实验时要加足够量的盐。

蛋白质的盐析作用是可逆过程,用盐析方法沉淀蛋白质时，较少引起蛋白质变性，经透析或用水稀释时又可溶解。

三、仪器与试剂
1、试剂
⑴蛋白质溶液:取10mL鸡蛋清，用蒸馏水稀释至100mL，搅拌均匀后用纱布过滤得上清液。

⑵饱和硫酸铵溶液；
⑶10％氢氧化钠溶液；
⑷1%硫酸铜溶液.
四、操作方法
1、取蛋白质溶液约2mL于试管中,加入过量的饱和硫酸铵溶液,混匀后静置3分钟则析出沉淀。

（二）重金属盐类沉淀蛋白质
一、目的意义
了解重金属盐类沉淀法的原理，学习用重金属盐类沉淀法沉淀分离蛋白质。

二、实验原理
溶液pH在蛋白质等电点以上时,重金属盐类（如Pb2+、Cu2+、Hg2+及Ag+等）易与蛋白质结合成不溶性盐而沉淀。

重金属盐类沉淀蛋白质通常比较完全，故常用重金属盐除去液体中的蛋白质。

但应注意，在使用某些重金属盐（如硫酸铜或醋酸铅)沉淀蛋白质时，不可过量,否则将引起沉淀再溶解，此时的溶解为生成憎水胶体的缘故。

三、仪器与试剂
1、试剂
⑴蛋白质溶液（与双缩脲反应相同）；
⑵5％CuSO4溶液；
⑶3％AgNO3溶液。

四、操作方法
1、取试管2支各加蛋白质溶液1mL.
2、向各管分别滴加2－3滴加5％CuSO4溶液、3％AgNO3溶液，观察各管所生成的沉淀。

3、在硫酸铜产生蛋白质沉淀的试管中，倒掉大部分沉淀，留少量沉淀，继续加入5％CuSO4
溶液，观察沉淀的溶解。

(三）有机酸沉淀蛋白质
一、目的意义
了解有机酸沉淀法的原理，学习用有机酸沉淀法沉淀分离蛋白质。

二、实验原理
生物碱是植物中具有显著生理作用的一类含氮的碱性物质。

凡能使生物碱沉淀，或能与生物碱作用产生颜色反应的物质，称为生物碱试剂。

如鞣酸、苦味酸和磷钨酸等。

当蛋白质溶液pH值低于其等电点时,蛋白质为阳离子，能与生物碱试剂的阴离子结合成不溶性盐而沉淀.溶液中的蛋白亦能被有机酸沉淀，其中以三氯醋酸的作用最为灵敏而且特异，因此广泛地被用于沉淀蛋白质,为首选沉淀剂，只能沉淀蛋白质，不能沉淀其水解产物，加热可除去。

三、仪器与试剂
1、试剂
⑴蛋白质溶液(与双缩脲反应相同）;
⑵5％三氯醋酸溶液；
⑶5％单宁酸溶液。

四、操作方法
1、取蛋白质溶液1mL于试管中，加数滴三氯醋酸溶液,观察现象。

2、取蛋白质溶液1mL于试管中，加数滴单宁酸溶液，观察现象.
实验三氨基酸的纸层析
一、目的意义
1、了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法.
2、学习纸层析的操作技术，分离鉴定未知样品的氨基酸成分。

二、实验原理
纸层析法属于分配层析法的一种，是以滤纸作为惰性支持物。

滤纸纤维上分布大量的亲水性羟基，因此能吸附水作为固定相，通常把有机溶剂作为流动相。

将样品在滤纸上（此点称为原点）,用有机溶剂进行展层时，样品中的各种溶质即在两相溶剂中不断进行分配。

由于各种溶质在两相溶剂中的分配系数不同,因而不同溶质随流动相移动的速率不等，于是从点样的一端向另一端展开时，样品中不同溶质被分离开来，形成距原点距离不等的层析点。

样品被分离后在纸层析图谱上的位置，是用比移值Rf来表示的
在一定条件下（如温度、展层剂的组成、层析纸质量等不变）,某物质的Rf值是一个常数，借此可作定性分析依据。

三、仪器与试剂
1、试剂
（1）氨基酸标准溶液:1％的甘氨酸、脯氨酸。

（2) 混合氨基酸溶液：将1%的甘氨酸、脯氨酸也按1％浓度制成混合溶液。

（3）展层剂：将20毫升的正丁醇和5毫升的冰醋酸放入分液漏斗中，与15毫升水混合，充分振荡,静止后分层，放出下层水层后备用。

(4) 显色剂：0.1%茚三酮－正丁醇溶液.
2、仪器
层析缸（12＊12CM规格，垂直型）、层析滤纸（新华一号滤纸,事先裁成11＊11CM规格)、电吹风（学生自带,每组一个）、三角板、铅笔和干纸巾（学生自带，每组一套）、毛细管。

四、操作方法
1、准备滤纸：三个点，每隔2CM画一个“+”，用铅笔连起描成一条直线。

每个“+"点距离滤纸底端2CM。

2、点样：每个样品用毛细管点3次，每次点完后用电吹风吹干。

一个样品用一支毛细管。

3、饱和平衡:在缸底部玻璃突起的一侧加入10-15ml展层剂，另一侧先不加；让滤纸都放先放到未加展层剂的干燥一侧,然后盖上盖子平衡饱和20分钟.（可写试验报告，简单讲课)
4、开始层析：稍微拿出滤纸，再在干燥的一侧也加入10-15ml展层剂，然后让滤纸分别在该侧开始层析。

5、结束层析:等到展层剂上升到距离滤纸上端3cm左右，就拿出滤纸，用铅笔划线描出液体
的上边界，然后用电吹风吹干。

6、茚三酮显色:把滤纸放在桌面上，整张纸用滴管滴加满茚三酮溶液，再用热风吹干，直到有结果出现。

7、计算RF值：用铅笔描出每个氨基酸的区域，测量距离计算甘氨酸和脯氨酸的Rf值.(每个组需将该滤纸夹在组长的实验报告中，并注明是第几组）
五、结果计算
1、用铅笔将层析结果轮廓和中心点描出来，计算各种氨基酸的Rf值.
2、分析混合样品中未知氨基酸的组分。

六、作业题
1、若展开剂高于点样线，对最终的层析结果有何影响？
2、点样时，样品浓度太高或斑点之间间距过小，对最终的层析结果有何影响？
实验四牛奶中酪蛋白的制备
一、目的意义
1、学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。

2、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法.
二、实验原理
牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白,含量约为3。

5g/100mL。

酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，不溶于水、醇、有机溶剂,等电点为4。

7。

利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。

用乙醇洗涤沉淀物,除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。

三、仪器与试剂
1、试剂
（1） 95％乙醇；
（2）无水乙醚；
(3） 0.2mol/L pH4。

7醋酸—-醋酸钠缓冲液：先配A液与B液，
A液：0。

2mol/L醋酸钠溶液，称NaAC·3H2O 54.44g，定容至2000mL;
B液：0。

2mol/L醋酸溶液,称纯醋酸（含量大于99.8％)12.0g定容至1000mL；
取A液1770mL,B液1230mL混合即得pH4。

7的醋酸-醋酸钠缓冲液3000mL。

(4）乙醇—乙醚混合液：乙醇：乙醚=1：1(V/V）。

（5）10％醋酸溶液
2、仪器：新鲜牛奶；台式离心机、抽滤装置、精密pH试纸、恒温水浴锅、烧杯、温度计、50ml大离心管.
四、操作方法
1、酪蛋白的粗提
20mL牛奶加热至40℃，在搅拌下慢慢加入预热至40℃（实验前水浴锅提前预热到43℃)、pH4。

7的醋酸缓冲液20mL，对照精密pH试纸用10%醋酸溶液调pH至4.7（肉眼可见絮状物质如果牛奶与缓冲液混合后，絮状沉淀出现不充分,需要加入较多的醋酸溶液，否则离心后没有分层）。

将上述悬浮液冷却至室温。

离心10分钟（3000r/min).弃去清液，得酪蛋白粗制品。

2、酪蛋白的纯化
（1）加入40ml蒸馏水搅拌洗涤沉淀，直接抽滤（事先检查真空泵是否已加满水）。

(2) 在沉淀中加入30mL乙醇,搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤（注意不要沾壁）。

用乙醇-乙醚混合液洗沉淀1次（不要更换滤纸),最后用乙醚洗沉淀1次，抽干。

（3）将沉淀摊开在干燥滤纸上，电炉上烘干,得酪蛋白纯品。

（4) 准确称重,计算含量和得率。

五、结果计算
X ＝
100m
V
式中:X ──酪蛋白含量，g/100 mL 牛乳；
V ──量取牛奶的体积，mL ； m ──收获酪蛋白的质量，g 。

六、注意事项
1、由于本法是应用等电点沉淀法来制备蛋白质,故调节牛奶液的等电点一定要准确.最好用酸
度计测定。

2、精制过程用乙醚是挥发性、有毒的有机溶剂，最好在通风橱内操作.
3、目前市面上出售的牛奶是经加工的奶制品，不是纯净牛奶，所以计算时应按产品的相应指
标计算.
七、作业题
1、试验中,分别加入乙醇、乙醚洗涤沉淀的作用是什么？
2、试验中,你觉得影响最终酪蛋白纯度和得率的因素可能会有哪些？请简单分析
实验五 酵母RNA 的提取
一、目的意义
掌握稀碱法提取RNA 的原理和方法，学会抽滤操作。

二、实验原理
酵母细胞富含核酸，且核酸主要是RNA ，含量为干菌体的2.67%～10.0%,而DNA 含量较少，仅为0。

03％～0.516%。

为此提取RNA 多以酵母为原料。

工业上制备RNA 多选用低成本、适于大规模操作的稀碱法或浓盐法。

这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA,主要用作制备单核苷酸的原料,其工艺比较简单.
稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解,然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA 或调pH2。

5利用等电点沉淀。

提取的RNA 有不同程度的降解。

浓盐法是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性,使核酸从细胞内释放出来. 三、仪器与试剂 1、试剂
⑴ 0.2％氢氧化钠溶液；⑵ 酸性乙醇溶液：30mL 乙醇加0.3mL HCl ；⑶ 95%乙醇；⑷ 乙醚; 2、仪器：酵母粉、量筒、抽滤瓶、布氏漏斗、台式离心机、天平等。

四、操作方法
1、研磨：称取3g 干酵母粉于研钵中（如果是10个组，称取30克，大研钵中磨，再分装给各个组），加入30mL (10个组，是300 mL ）0。

2%NaOH 溶液中,加入少量石英砂，研磨均匀10min 。

2、沸水提取:将酵母匀浆转入100mL 小烧杯中沸水浴（提前打开水浴锅,加热到95度）加热20分钟,不断搅拌。

冷却后移到离心管，4000r/min 离心10分钟后,沉淀弃去,将上清液移到小烧杯中，慢慢倾入20mL 酸性乙醇，边加边搅。

静置10min.
3、离心:待RNA 完全沉淀，移到离心管,4000r/min 离心5分钟。

4、洗涤、抽滤：弃去上清液，加入30ml 95％乙醇洗涤沉淀并搅拌后,转移至布氏漏斗抽滤，继而再用20ml 无水乙醚洗涤，洗涤时可用细玻璃棒小心搅动沉淀。

沉淀在空气中干燥。

5、称重计算：称量所得RNA 粗品的重量。

五、结果计算
X ＝
100m
V
式中：X ──RNA 粗品含量，g/100g 酵母；V ──酵母的质量,g ；m ──收获RNA
粗品的质量，g 。

六、作业题
1、RNA 的含量测定还有其它方法吗？试举例简单说明
2、沸水浴的作用是什么？
实验六 糖的呈色反应和定性鉴定
（一）Fehling 试验
一、目的意义
了解鉴定还原糖的方法及其原理.
二、实验原理
费林试剂是含有硫酸铜和酒石酸钾钠的氢氧化钠溶液。

硫酸铜与碱溶液混合加热,则生成黑色的氧化铜沉淀。

若同时有还原糖存在,则产生黄色或砖红色的氧化亚铜沉淀。

为了防止铜离子和碱反应生成氢氧化铜或碱性碳酸铜沉淀，Fehling试剂中加入酒石酸钾钠，它与Cu2＋形成的酒石酸钾钠络合铜离子是可溶性的络离子，该反应是可逆的。

平衡后溶液内保持一定浓度的氢氧化铜。

费林试剂是一种弱的氧化剂，它不与酮和芳香醛发生反应。

三、仪器与试剂
1、试剂甲：称取34。

5g硫酸铜溶于500mL蒸馏水中。

2、试剂乙:称取125g NaOH 137g酒石酸钾钠溶于500mL蒸馏水中，贮存于具橡皮塞玻璃瓶中.
临用前，将试剂甲和试剂乙等量混合成Fehling试剂。

3、1％葡萄糖溶液;1％蔗糖溶液；1%淀粉溶液（先配好）.
四、操作方法
取试管，编号，各加入Fehling试剂1mL.摇匀后,分别加入4滴待测糖溶液，置沸水浴中加热2～3min，取出冷却，观察沉淀和颜色变化。

（二）Benedict试验(班氏试验）
一、目的意义
了解鉴定还原糖的方法及其原理。

二、实验原理
Benedict试剂是Fehling试剂的改良。

Benedict试剂利用柠檬酸作为Cu2+的络合剂，其碱性较Fehling试剂弱，灵敏度高，干扰因素少。

三、仪器与试剂
1、Benedict试剂（班氏试剂）：将170g 柠檬酸钠和100g 无水碳酸钠溶于800mL水中;另将
17g硫酸铜溶于100mL热水中。

将硫酸铜溶液缓缓倾入柠檬酸钠－碳酸钠溶液中，边加边搅，最后定容至1000mL。

该试剂可长期使用。

2、1％葡萄糖溶液;1％蔗糖溶液；1％淀粉溶液。

四、操作方法
取试管，编号，分别加入2mL Benedict试剂和4滴待测糖溶液,沸水浴中加热5分钟，取出后冷却，观察各管中的颜色变化。

五、作业题:1、除这两个试验方法外,还有其它何种办法鉴别还原糖和非还原糖？请简述
实验七淀粉的提取和性质实验
一、目的意义
1、熟悉淀粉与碘的呈色反应。

2、了解淀粉的提取方法和水解条件及产物。

二、实验原理
1、淀粉的提取
淀粉是一种重要的多糖,是一种相对分子量很大的天然高分子化合物,广泛分布于植物界，谷类、果实、种子、块茎中含量丰富。

工业用的淀粉主要从玉米、甘薯、马铃薯中制取。

淀粉是一种白色粉末，不溶于冷水，在热水里淀粉颗粒会膨胀，有一部分淀粉溶解在水里，另一部分悬浮在水里，形成胶状淀粉糊.
2、淀粉与碘的显色反应
直链淀粉遇碘呈蓝色，支链淀粉遇碘呈紫红色,糊精遇碘呈蓝紫、紫、橙等颜色。

这些显色反应的灵敏度很高，可用作鉴别淀粉的定量和定性的方法，也可用它来分析碘的含量。

淀粉和碘的显色反应除了吸附原因外,主要是由于生成包合物的缘故。

直链淀粉是由α-葡萄糖分子缩合而成螺旋状的长长的螺旋体,每个葡萄糖单元都仍有羟基暴露在螺旋外。

碘分子跟这些羟基作用,使碘分子嵌入淀粉螺旋体的轴心部位.碘跟淀粉的这种作用叫做包合作用,生成物叫做包合物。

淀粉跟碘生成的包合物的颜色,跟淀粉的聚合度或相对分子质量有关。

在一定的聚合度或相对分子质量范围内，随聚合度或相对分子质量的增加，包合物的颜色的变化由无色、橙色、淡红、紫色到蓝色。

例如，直链淀粉的聚合度是200－980或相对分子质量范围是32 000－160 000时，包合物的颜色是蓝色。

分支很多的支链淀粉,在支链上的直链平均聚合度20－28，这样形成的包合物是紫色的。

糊精的聚合度更低，显棕红色、红色、淡红色等。

表2－1 淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色
淀粉跟碘生成的包合物不稳定，易被乙醇、氢氧化钠和热等作用，使颜色褪去，而只在pH = 4时最稳定，所以它的显色反应在微酸性溶液里最明显。

3、淀粉的水解
淀粉进入人体后,一部分淀粉受唾液中淀粉酶的催化作用,发生水解反应,生成麦芽糖；余下的淀粉在小肠里胰脏分泌出的淀粉酶的作用下，继续进行水解，生成麦芽糖。

麦芽糖在肠液中麦芽糖酶催化下，水解为人体可吸收的葡萄糖,供人体组织的营养需要。

反应过程为：（C6H12O5）m→（C6H10O5）n→C12H22O11→C6H12O6
淀粉糊精麦芽糖葡萄糖
三、仪器与试剂
1、试剂
(1) 乙醇、0.1％淀粉液（1mL1%淀粉溶液加5 mL蒸馏水）、10％NaOH溶液、20%H2SO4溶
液、10％Na2CO3溶液。

（2）2％碘液:将碘化钾20g及碘10g溶于100mL水中。

使用前稀释10倍。

(3) 班氏（Benedict）试剂：见糖的呈色反应实验。

2、仪器:生马铃薯、组织捣碎机、纱布、布氏漏斗、抽滤瓶、水浴锅、试管夹、量筒、烧杯、
白瓷板、试管。

四、操作方法
1、淀粉的提取（演示,实验不再做）
生马铃薯去皮，切碎,称取50g，加少量水，捣碎匀浆,用四层纱布过滤，除去粗颗粒,滤液中淀粉很快沉淀，然后用水多次洗涤淀粉,再抽滤后滤饼放在表面上风干即可。

2、淀粉与碘的反应
（1) 取少量自制淀粉于白瓷板孔内，加碘液两滴，观察颜色。

（2) 取试管一支，加入0。

1％的淀粉液6mL,碘液两滴，摇匀，观察颜色变化。

另取试管两支，将前述淀粉液均分为三等份并编号做如下实验：
1号管在酒精灯上加热，观察颜色变化.然后冷却,又观察颜色变化。

2号管加入10％NaOH溶液几滴，观察颜色变化
3号管加入乙醇4mL,观察颜色变化。

记载上述实验过程和结果,并解释现象。

3、淀粉的水解
(1）在试管1中加入少量淀粉和4mL水，在试管2中加入0.5g淀粉和4mL 20%的硫酸溶液。

分别加热试管煮沸3～4min。

（2）把试管2中的一部分溶液倒入试管3中,留作下一步实验用。

(3）向试管1和试管2中加入几滴碘溶液，观察现象.
（4）向试管3中滴入20% Na2CO3溶液，中和溶液中的硫酸,把溶液调呈弱碱性，使溶液的pH值约为9~10（直到CO2气泡冒完为止）。

再加入2mL班氏试剂，加热煮沸后观察现象。

记载上述实验过程和结果，并解释现象。

六、作业题：1、在加热的过程中，为什么碘与淀粉会呈现不同的颜色反应？
实验八油脂氧化酸败的定性检验及定量测定
一、目的意义
1、进一步掌握油脂氧化酸败的机理。

2、学会油脂氧化酸败的定性检验及酸值测定的操作技术.
二、实验原理
油脂氧化酸败的过程是极复杂的化学变化过程,对食品质量影响很大。

酸败的油脂中某些分解产物对人体有害,例如环氧丙醛。

过氧化物是油脂自动氧化的主要初级产物，过氧化物可进一步分解,生成低级的醛、酮和羧酸，通过油脂中过氧化物、醛类的检出，可定性判断油脂是否已发生酸败.
环氧丙醛在酸败的油脂中不呈游离状态,而是成为缩醛。

在盐酸作用下，环氧丙醛逐渐释出,释出的游离环氧丙醛与间苯三酚发生缩合反应，生成红色的凝聚物（环氧丙醛—间苯三酚凝聚物）,由红色凝聚物的生成可判断油脂已发生酸败.
酸值是评定油品酸败程度的指标之一，它是指中和1g油脂中游离脂肪酸所消耗的氢氧化钾的质量(mg）。

油脂中游离的脂肪酸与氢氧化钾发生中和反应，从氢氧化钾标准溶液消耗量计算出油脂的酸值。

反应如下：RCOOH＋KOH → RCOOK＋H2O
三、仪器与试剂
1、试剂
⑴ 0.1%间苯三酚乙醚溶液；
⑵浓盐酸；
⑶中性乙醚－乙醇混合液(体积比为2∶1)，临用前用0.1 mol/L氢氧化钾溶液中和至酚酞指
示剂呈中性；
⑷酚酞指示剂：1％乙醇溶液；
⑸ 0.1000mol/L氢氧化钾标准溶液;
⑹花生油(新鲜与不新鲜样品各1种)。

2、仪器：恒温水浴、锥形瓶、试管及试管架、量筒、25mL比色管、滴定管、容量瓶。

四、操作方法
㈠油脂氧化酸败的定性检验
1、间苯三酚乙醚溶液法（克莱斯氏环氧丙醛反应)
取试样2mL于试管中，加入浓盐酸2mL，用橡皮塞塞好管口,剧烈振荡10s左右，再加0.1％间苯三酚乙醚溶液2mL，加塞剧烈振荡10s左右，使酸层分离。

观察下层溶液颜色。

结果表示：下层呈桃红色或红色表示油脂已酸败,下层呈浅粉红色或黄色表示未酸败。

㈡油脂酸值的测定
精密称取3g 试样置于锥形瓶中,加入30mL 中性乙醚－乙醇混合液，摇匀使油脂溶解（必要时可置热水中,温热使其溶解，冷至室温)。

加入酚酞指示剂2－3滴，用0.1mol/L 氢氧化钾标准溶液滴定至初现微红色,且30秒内不褪色为终点。

记下消耗0.1mol/L 氢氧化钾溶液的用量。

五、结果计算
X =
m
C V 11
.56⨯⨯
式中：X ──试样的酸值（以氢氧化钾计），mg/g ；
V ──试样消耗氢氧化钾标准溶液体积，mL; C ──氢氧化钾标准溶液实际浓度，mol/L ； m ──试样质量，g ；
56.11──与1.0mL 氢氧化钾标准溶液相当的氢氧化钾毫克数。

六、注意事项
1、间苯三酚乙醚法试验、酸值测定,切忌明火。

2、酸值测定中，如油样色泽深,可减少试样用量或适当增加混合溶剂的用量;如因色深判断终点困难，可改换指示剂,用碱性蓝6B 、百里酚酞做指示剂或用酚酞试纸作外指示。

3、测定蓖蔴油酸度时,只用中性乙醇而不用混合溶剂。

4、光线会促进空气对试剂的氧化,应注意避光存放试剂；
实验九 维生素C 的定量测定
一、目的意义
掌握2，6－二氯靛酚法测定维生素C的原理和方法。

二、实验原理
维生素C又称抗坏血酸，还原型抗坏血酸能还原染料2，6－二氯靛酚钠盐，本身则氧化成脱氢抗坏血酸。

在酸性溶液中,2，6－二氯靛酚钠离子呈红色,被还原后变为无色.
三、仪器与试剂
1、试剂
（1）2%草酸溶液；
(2) 0.001N 2,6－二氯靛酚钠溶液：称取碳酸氢钠52mg溶解在200mL热蒸馏水中,然后称取2，
6－二氯靛酚50mg溶解在上述碳酸氢钠溶液中。

冷却定容至250mL，过滤至棕色瓶内，保存在冰箱中.每次使用前，用标准抗坏血酸标定其滴定度。

2、仪器：匀浆机、小锥形瓶、酸式滴定管、研钵、容量瓶、移液管、小离心管等。

四、操作方法
1、样液的制备及滴定
称取100g青椒匀浆，取(x/8，x代表匀浆体积数，约为50；8代表组数)mL青椒匀浆液移入50mL容量瓶中，用2％草酸溶液定容摇匀。

每次量取20mL提取液放入锥形瓶内,用2，6－二氯酚靛酚钠溶液进行滴定呈现淡粉红色，并在15－30秒内不褪色，滴定过程必须迅速，不要超过2分钟.平行试验进行2次，记录消耗2，6－二氯酚靛酚钠溶液的用量。

2、滴定
滴定管装入，滴定至提取液,
另取10mL 2%草酸按上法作空白对照试验，记录消耗2，6－二氯酚靛酚钠溶液的用量。

五、结果计算
M=[（V A—V B) ×C×0。

088×100]/（D×W）
式中：M——100g样品中含抗坏血酸的质量，mg；
V A—-滴定样品管时所用去染料体积数，mL;
V B-—滴定时空白管时所用去染料体积数，mL；
C——提取液总毫升数，mL;
D—-滴定时所取的样品的提取液毫升数,mL；
W——被检样品的重量，g；
0。

088—-0。

001N 2，6－二氯酚靛酚钠溶液1mL相当于0.088mgV C。

实验十酶的特性实验
一、目的意义。