遗传代谢性疾病的基因诊断课件

卫生部“十一五” 规划教材
全国高等医药教材建设研究会规划教材
第十九章 遗传代谢性疾病 的基因诊断
遗传代谢性疾病的基因诊断
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主要内容
前言 一、基因诊断技术 二、遗传代谢性疾病的基因诊断
遗传代谢性疾病的基因诊断
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前言
细胞、组织、器官和机体的生存与功能维持都必须依 赖不断进行的物质代谢过程。
物质代谢包括合成代谢及分解代谢两个过程。 代谢性疾病是物质代谢过程的紊乱，多为酶或蛋白异
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基本流程：第1步
一个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入 酶混合物(包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、 Luciferase和三磷酸腺苷双磷酸酶Apyrase)和底物混合 物(包括腺苷酰硫酸APS和Luciferin)。
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焦磷酸测序技术
原理: 引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP
硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶等4种 酶的协同作用下，将每一个dNTP的聚合与一次荧 光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强 度，以荧光信号的形式实时记录模板DNA的核苷 酸序列。
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示例：BigDye™ Terminators
循环测序反应扩增到未端为BigDye™ Terminators 的一系列的核苷酸链。
循环测序反应产物经沉淀、洗涤和纯化，从而去除多 余的未反应的BigDye™ Terminators。
电泳与结果分析。
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能量供应不足
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遗传代谢性疾病的发病特点
父母双方或者某一方携带着致病基因。 多在新生儿期、幼儿或儿童期发病，有些虽然在成
人期发病，但在儿童期已有潜在病变。 临床表现无特异性，多为胃肠道、呼吸系统、神经
系统症状、代谢性酸中毒。 家族史中往往有同样病情的先证者存在，而且往往
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A
B
DNA Polymerase
ACCTTGAATTCGTCCTAGGA…… GGATCTT……
TT AA
dNTP Apyrase
(d)NMP
PPi ATP-sulphurylase
ATP Luciferase
Light
C
T
GC
A G TC A G TC AG TC A G TC
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dNTP
ATP双磷酸酶
dNDP+dNMP+Pi
ATP
ATP双磷酸酶 ADP+AMP+Pi
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基本流程：第5步 加入另一种dNTP，使
第2－4步反应重复进 行，根据获得的峰值 图即可读取准确的DNA 序列信息
DNA 序列
G
C
-
A GG CC T
GC
T
A
G
C
T
核苷酸递增
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第二节 遗传代谢性疾病的基因诊断
遗传代谢性疾病是指由于基因突变导致酶的质和量的改变， 从而所催化的酶促反应发生变化而引起的一系列疾
病。
一、代谢性疾病的特征及基因诊断策略
二、苯丙酮酸尿症（PKU) 八、家族性高脂蛋白血症
三、同型胱氨酸尿症(HCU) 九、肝豆状核变性
常所致。 根据代谢性疾病的病因，可将其分为原发性和继发性。
一、代谢性疾病的分类
二、代谢性疾病的诊断手段
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一、代谢性疾病的分类
原发性代谢性疾病： 又叫先天性代谢性疾病。是指当编码物质代谢所需酶
或蛋白的基因发生突变、不能合成或合成了无活性的产 物时，就会导致有关代谢途径不能正常运转，造成具有 不同临床表型的各种代谢缺陷病。 继发性代谢性疾病：
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病因
是由于人类肝细胞内苯丙氨酸羟化酶(PAH)缺乏或 活性降低所致。
上述酶的缺乏或活性降低直接导致体内来源于食物 的苯丙氨酸不能正常转化为酪氨酸，从而使苯丙氨 酸在体内异常蓄积，并打破大脑氨基酸的平衡而导 致PKU。
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临床表现
半乳糖激酶(GALK1)缺乏型。 尿苷二磷酸半乳糖-4-表异构酶(GALE)缺乏
型半乳糖血症。
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基因诊断
GALT位于9p13, GALT基因的大部分突变可导 致GALT酶活性急剧降低或完全缺失。
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病因
半乳糖代谢途径中酶的遗传性缺陷所造成的 代谢性疾病。
半乳糖
GAKL 1(2)
半乳糖-1-磷酸 UDP-葡萄糖
GALE (3) UDP-半乳糖
GALT (1)
葡萄糖-1-磷酸
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临床表现
半乳糖-l-磷酸尿苷酰转移酶(GALT)缺乏型 (最常见，病情最重)。
稳定简便 自动化程度高 数据准确可靠 公认为国际金标准
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双脱氧链终止法
原理: 测序基础是以ddNTP
为测序反应的链终止剂 掺入到延伸链中的
ddNTP可阻止后续 ddNTP或dNTP的掺 入
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基因诊断
目前的基因诊断主要集中于分析胱硫醚合成酶的 基因型。
可通过绒毛膜绒毛取样(CVS)和羊水诊断来对已 有HCU患儿的家庭中的其他成员进行产前诊断。
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四、酪氨酸血症
芳香族氨基酸代谢缺陷病 常染色体隐性遗传 发病率约为1/10,000 特征是血液中的酪氨酸水平增高
研究者已确认HPD基因的一些突变可导致酪氨酸血 症III型，其中一些突变影响该酶的正确组装。
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五、半乳糖血症
是一种糖代谢紊乱性疾病。 常染色体隐性遗传。 发病率大约为1/60,000。 机体无法处理半乳糖而导致1-磷酸半乳糖的
沉积而致病。
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基本流程：第2步
向反应体系中加入1种dNTP，如果它刚好能和DNA模 板的下一个碱基配对，则会在DNA 聚合酶的作用下， 添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷 酸(PPi)。
(DNA)n+dNTP
聚合酶
(DNA)n+1+PPi
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基本流程：第3步 在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形
继发性代谢性疾病是由其它原发性疾病导致的代谢性 疾病，如糖尿病导致的继发性高脂血症。
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二、代谢性疾病的诊断手段
过去：主要依靠与物质代谢相关的各种酶的 生物化学方面的诊断
现在：生化诊断+基因诊断
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基因诊断的概念
基因诊断就是利用现代分 子生物学和分子遗传学的技 术方法,直接检测基因结构及 其表达水平是否正常,从而对 疾病作出诊断的方法。
四、酪氨酸血症 五、半乳糖血症
十、先天性甲状腺功能低下 十一、溶酶体病
六、糖原累积症
十二、线粒体病
七、果糖不耐症
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一、代谢性疾病的特征及基因诊断策略
遗传代谢性疾病的病理生理改变特征
代谢途径的某些终末产物缺乏 受累代谢途径中间和或旁路代谢产物大量蓄积 由于代谢连径受阻而导致对肝、脑、肌肉等蛆织
因为饮食和应激等因素而发病。
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代谢性疾病的基因诊断策略
检测已知的能产生某种特定功能蛋白的基因 检测与某种遗传标志连锁的致病基因 检测表型克隆基因
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二、苯丙酮酸尿症(PKU)
氨基酸代谢障碍 属常染色体隐性遗传 我国发病率约为1/16,500
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基因诊断
酪氨酸血症的基因诊断主要依靠对FAH、HPD和 TAT基因的突变筛选。
研究者已经确认了可导致酪氨酸血症I型的40种 FAH突变，这些突变可导致该酶的不稳定或失活， 从而导致使该酶的活性降低或缺失。
研究者已经确认了10种以上的TAT基因突变，而且， 几乎所有的TAT基因突变可导致酪氨酸血症II型。
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焦磷酸盐测序法步骤
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二、聚合酶链反应技术
PCR是体外酶促合成特异 DNA片段的方法。
四种主要成分： DNA模板、引物、DNA 聚合酶和dNTP。
三个反复步骤： 高温变性、低温退火和 适温延伸。
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神经系统症状： 以智力发育落后为主的障碍。
外貌： 患儿在出生数月后因黑色素合成不足，毛发、皮肤 和虹膜色泽变浅。
其他： 呕吐和皮肤湿疹常见；尿和汗液有鼠尿臭味。
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基因诊断
PAH 基因定位于12号染色体的长臂上，即 12q24.1，包括13个外显子和12个内含子，编码 451个氨基酸的酶单体。
成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧 光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD 光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值高低则和相 匹配的碱基数成正比。
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基本流程：第4步
反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase 的作用下发生降解。
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临床表现
典型的症状见于胱硫醚合成酶缺乏型的病例,患儿 初生时正常，5～9个月间起病,主要症状是骨骼 异常、晶体脱位、血栓形成、智力发育落后、惊 厥等。
“甲基转移酶缺乏型”症状较轻，可有骨骼畸形， 体格和智力发育迟缓。
“还原酶缺乏型”以神经系统状为主，如惊厥、 智力低下、精神分裂症状、肌病等。
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基因诊断的特点
针对性强 特异性高 灵敏度高 适用性强 诊断范围广
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第一节 基因诊断技术
一.DNA测序技术 二.聚合酶链反应技术 三.毛细管电泳技术 四.基因芯片技术
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一、DNA测序技术
所有生物基因组序列的数 据均来自 DNA 测序 特点:
三、毛细管电泳技术
毛细管电泳统指以高压电场为驱动力， 以毛细管为分离通道，依据试样中各组 分间淌度和分配行为上的差异来实现分 离的一类分离技术。
基本原理是根据在电场作用下离子迁移 的速度不同而对组分进行分离和分析。
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变性高效液相色谱(DHPLC)是一种新的 高通量筛选DNA序列变异的技术，其原 理是利用离子对反向高效液相色谱原理, 通过一个DNA分离柱，进行核苷酸片段 的分离和分析。
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病因
酪氨酸在其分解代谢途径中需要一系列 酶的参与，当这些酶缺乏时会导致酪氨 酸在组织和器官的堆积，从而使血液的 酷氨酸水平增高，并最终导致一系列的 临床症状。
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分型
酪氨酸血症I型: 延胡索酸酰乙酰乙酸水解酶缺乏 酪氨酸血症II型:酪氨酸转氨酶缺乏 酪氨酸血症III型:对羟苯基丙酮酸双氧化酶缺乏
低导致尿中的同型胱氨酸和蛋氨酸增高。
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35Biblioteka Baidu
病因
胱硫醚合成酶缺乏型(简称“合成酶型”)，是由 同型胱氨酸变为胱硫醚的代谢途径发生阻滞,本型 最为多见。
甲基四氨叶酸-同型半胱氨酸甲基转移酶缺乏型 (简称“甲基转移酶型”)，是同型半胱氨酸变为 蛋氨酸的代谢途径发生紊乱。
5,10-N-甲烯四氢叶酸还原酶缺乏型(简称“还原 酶型”)。
PAH 基因除了缺失突变外，大多是点突变。 由于PKU 是第一个可以用饮食控制治疗的遗传病，
因此，对PKU 产前诊断的研究是非常有意义的。
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三、同型胱氨酸尿症(HCU)
是蛋氨酸先天代谢障碍所致的氨基酸代谢缺 陷性疾病。
常染色体隐性遗传病。 基本病因是胱硫醚合成酶(CBS)缺乏或活性降
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四、基因芯片技术
基因芯片技术就是指将大量特定的靶基因片段或 寡核苷酸片段作为探针有序和高密度地排列固定 于玻璃和硅等固相载体上，然后检测与待测的不 同荧光标记样品基因按碱基配对的原理进行杂交， 通过激光共聚焦系统检测探针分子的杂交信号强 度，经计算机分析处理数据资料，获取不同样品 分子的数量和大量生物信息，从而可对基因序列 及功能进行大规模和高通量的研究。