在小鼠脑血管内皮细胞中用发夹寡核苷酸调控由细胞因子诱导的iNOS的表达
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• 5. TNF-α +IFN-γ 处理后24h
TNF-α +IFN-γ 处理后， MCEC中iNOS mRNA瞬 时表达。大约3小时后增加达到峰值，大约是未处 理时的8倍！！！
图2 MCEC中HP寡核苷酸和它的突变体对TNFα+IFN-γ诱导iNOS表达的影响（RT-PCR检测）。
实验结果
HP寡核苷酸及其突变体对iNOS mRNA表达的抑制（图 2B） • 1. TNF-α +IFN-γ 处理后0h（未处理组） • 2. TNF-α +IFN-γ 处理后3h • 3. TNF-α +IFN-γ 处理后3h + HP寡核苷酸3h前预处理
发夹寡核苷酸调控MCEC中iNOS的表达
马酉初|2016.9.19|中南林业科技大学
在MCEC中，TNF-α 和IFN-γ 的组合可增强iNOS的表达；
在MCEC中，NF-κ B对由TNF-α 及IFN-γ 诱导iNOS的表达起介导作用； 设计了一个携带NF-κ B基序的双链发夹寡核苷酸，并证明该核苷酸可以抑制上述作用。
• 突变HP寡核苷酸
• 发夹由TTTTT连接环建立，在NF-kB的共识寡 核苷酸标有γ -32P-ATP AGTTGAGTCTACGCTAACAGGCTT T TCAACTCAGATGCGATTGTCCGTT
• 室温下孵育（结合反应，Binding reaction） 后非变性电泳
• 放射自显影
实验方法
• 并表明一个设计适当的发夹NF-kB的基序可以替代的药理学手段，来调节细胞因子诱导的iNOS表达
谢谢观赏~
马酉初|2016.9.19|中南林业科技大学
• 含TNF-α (20 ng/ml)、IFN-γ (1,000 units/ml)的培养基 • 时间梯度
实验方法
电泳迁移分析 HP寡核苷酸 AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGCTT • NF-kB的共有寡核苷酸 5‘-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’(32) TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCGTT T
促炎性细胞因子：
• 肿瘤坏死因子-α （Tumor necrosis factor alpha，TNF-α ） • 干扰素-γ (Interferon gamma， IFN-γ )
背景资料
• 细胞因子可通过核转录因子-κ B（Nuclear factor kappa-B， NF-κ B）的发挥它们的 作用，以改变基因表达。
实验结果
同一凝胶板下HP寡核苷酸及其突变体对NF-kB结合活性的 影响（图1B）
• 1.空白对照 • 2.核蛋白（同1A处理组）+ NF-kB标记探针 • 3. 20×NF-kB非标记探针 • 4. 20×HP寡核苷酸预处理影响组
• 5. 20×突变HP寡核苷酸预处理影响组
TNF-α +IFN-γ 处理后，发夹寡核苷酸预处理操作能 抑制NF-κ B结合活性，而突变发夹寡核苷酸预处理操 作对NF-κ B结合活性则没有效果！！！
核蛋白 的制备
蛋白印 迹
RNA分 离
RTPCR
实验方法
对iNOS表达的调节
MCEC核提取物的制备
• NF-kB发夹核苷酸(1μ M) 或突变型NF-kB发夹核苷酸(1μ M) • TNF-α 、IFN-γ 诱导前3h加入（预处理）
• 每样约500万个细胞
对iNOS表达的诱导
RNA分离（TRI reagent法）
实验结果
HP寡核苷酸对iNOS的表达的抑制作用（图3A）
• 1. iNOS 标准品
• 2. 未处理组 • 3. TNF-α +IFN-γ 处理后16h
• 4. TNF-α +IFN-γ 处理后16h + HP寡核苷酸 3h前预处理
• 5. TNF-α +IFN-γ 处理后16h + 突变HP寡核 苷酸3h前预处理 图3 MCEC中HP核苷酸及其突变体，还有CHX对TNFα+IFN-γ诱导iNOS表达的影响（蛋白印迹检测）。
实验结果
TNF-α +IFN-γ 增加MCEC中NF-kB的结合活性（图1A） • 1.空白对照
• 2.未处理（对照）组
• 3. TNF-α +IFN-γ 处理组
TNF-α +IFN-γ 处理后， MCEC中NF-kB的结合活性 是原来的3倍以上！！！ 图1 MCEC中HP寡核苷酸及其 突变体对NF-kB结合活性的影响
• （有效抑制细胞因子诱导的 iNOS表达）。
实验材料
• 化学试剂（CHX等，分子级）
• 核酸实验材料（引物、dCTP、32P-ATP等）
• 蛋白印迹（显色系统、iቤተ መጻሕፍቲ ባይዱOS标准样及其抗体等）
• 细胞（MCEC及其培养基、血清等）
技术路线
电泳迁 移分析
细胞 培养
(HP 核苷 酸预 处理)
iNOS 表达 的诱 导
当用TNF-α +IFN-γ 的同时给予一种蛋白质合成抑制剂——放线菌酮，可以废除iNOS表达！！！ 当CHX被加入到TNF-α +IFN-γ 处理10小时后的MCEC，则未能抑制iNOS的表达！！！
讨论与展望
• 使用了结构改性的寡核苷酸——发夹NF-kB的基序，以限定MCEC中NF-κ B在iNOS表达时的作用。 双链发卡寡核苷酸包含与TTTTT连接环中的NF-kB的共有序列。通过GGGACTTTCC被 TCTACGCTAA取代突变作为对照。
RT-PCR
• 亲环蛋白（内参基因引物）: • +5’-ATGGTCAACCCCACCGTGT-3’; • -5’-CGTGTGAAGTCACCACCCT-3’ (220 bp). 蛋白印迹（见Promega技术手册）
• iNOS（目的基因引物）: • +5’-TATGAAGTTATGGGATGTCGTGGCT-3’; • -5’-TAGATACATCCACACCGTTTAGCGG-3’ (300 bp).
• 1. iNOS 标准品
• 2. 未处理组 • 3. TNF-α +IFN-γ 处理后16h
• 4. TNF-α +IFN-γ 处理后16h + CHX（前者处理 10h后加入）
• 5. TNF-α +IFN-γ 处理后16h + CHX（与前者同 时加入） 图3 MCEC中HP核苷酸及其突变体，还有CHX对TNFα+IFN-γ诱导iNOS表达的影响（蛋白印迹检测）。
本文主要内容
背景资料
一氧化氮合酶（NOS）的三种同工酶：
• 神经元型一氧化氮合酶（Neuronal nitric oxide synthase，nNOS或NOS1）
• 内皮型一氧化氮合酶（Endothelial nitric oxide synthase，eNOS或NOS3）
• 诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOS或NOS2）
• CHX没有减少iNOS mRNA表达（数据未示出），而当MCECs用TNF-α +IFN-γ 和CHX同时进行处 理时却完全抑制iNOS的表达。但是CHX并不能对10小时TNF-α +IFN-γ 预处理后MCECS中iNOS的 表达进行抑制。这表明，iNOS的关键阶段合成发生在细胞因子刺激的早期阶段。
• 4. TNF-α +IFN-γ 处理后3h + 突变HP寡核苷酸3h前预 处理
根据RT-PCR， HP寡核苷酸对iNOS在相对mRNA 表达水平的降低率为80±15％ （平均值±SD， N=3） ！！！
图2 MCEC中HP寡核苷酸和它的突变体对TNFα+IFN-γ诱导iNOS表达的影响（RT-PCR检测）。
• 该发夹寡核苷酸（而非其突变体）可有效地对NF-kB结合力（ Binding ）起竞争作用。 • 发夹寡核苷酸也抑制由TNF-α +IFN-γ 的诱导iNOS的表达，这表明iNOS基因表达是由NF-κ B的在转 录水平调控。而通过蛋白印迹分析则进一步被发现该发夹寡核苷酸在蛋白质水平上的效果是不完整 的。这是因为iNOS这至关重要的基因表达不可能仅由一个转录因子调节。
图1 MCEC中HP寡核苷酸及其 突变体对NF-kB结合活性的影响
实验结果
TNF-α +IFN-γ 增加MCEC中iNOS的表达（图2A）
• 1. TNF-α +IFN-γ 处理后0h（未处理组）
• 2. TNF-α +IFN-γ 处理后1h • 3. TNF-α +IFN-γ 处理后3h
• 4. TNF-α +IFN-γ 处理后5h
实验目的
• 在小鼠脑血管内皮细胞（MCECs）中， IFN-γ 与TNF-α 的共同作用能增加的NF-kB （与DNA）的结合力（binding），进一步 增加iNOS的表达。
• 测试含有NF-κ B结合位点 （binding site）共有序列的双 链发夹（Hairpin，HP）寡核苷 酸的功效
• 转录因子活性可以通过反义寡核苷酸 （Antisense oligonucleotides）或双链哑 铃寡核苷酸（Double-stranded dumbbell oligonucleotides）来调节。
TNF-α + IFN-γ 处理也诱导iNOS在蛋白水平上的表达（增加倍数8±2，N=3）！！！ HP寡核苷酸（而非突变体）预处理，也抑制由TNF-α / IFN-G诱导iNOS在蛋白水平上的表达！！！
基于130 kD频带密度法，iNOS蛋白表达的减少率为90±20％ （N=3） ！！！
实验结果
放线菌酮( Cycloheximide ，CHX）对iNOS的表 达的抑制作用（图3B）
TNF-α +IFN-γ 处理后， MCEC中iNOS mRNA瞬 时表达。大约3小时后增加达到峰值，大约是未处 理时的8倍！！！
图2 MCEC中HP寡核苷酸和它的突变体对TNFα+IFN-γ诱导iNOS表达的影响（RT-PCR检测）。
实验结果
HP寡核苷酸及其突变体对iNOS mRNA表达的抑制（图 2B） • 1. TNF-α +IFN-γ 处理后0h（未处理组） • 2. TNF-α +IFN-γ 处理后3h • 3. TNF-α +IFN-γ 处理后3h + HP寡核苷酸3h前预处理
发夹寡核苷酸调控MCEC中iNOS的表达
马酉初|2016.9.19|中南林业科技大学
在MCEC中，TNF-α 和IFN-γ 的组合可增强iNOS的表达；
在MCEC中，NF-κ B对由TNF-α 及IFN-γ 诱导iNOS的表达起介导作用； 设计了一个携带NF-κ B基序的双链发夹寡核苷酸，并证明该核苷酸可以抑制上述作用。
• 突变HP寡核苷酸
• 发夹由TTTTT连接环建立，在NF-kB的共识寡 核苷酸标有γ -32P-ATP AGTTGAGTCTACGCTAACAGGCTT T TCAACTCAGATGCGATTGTCCGTT
• 室温下孵育（结合反应，Binding reaction） 后非变性电泳
• 放射自显影
实验方法
• 并表明一个设计适当的发夹NF-kB的基序可以替代的药理学手段，来调节细胞因子诱导的iNOS表达
谢谢观赏~
马酉初|2016.9.19|中南林业科技大学
• 含TNF-α (20 ng/ml)、IFN-γ (1,000 units/ml)的培养基 • 时间梯度
实验方法
电泳迁移分析 HP寡核苷酸 AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGCTT • NF-kB的共有寡核苷酸 5‘-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’(32) TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCGTT T
促炎性细胞因子：
• 肿瘤坏死因子-α （Tumor necrosis factor alpha，TNF-α ） • 干扰素-γ (Interferon gamma， IFN-γ )
背景资料
• 细胞因子可通过核转录因子-κ B（Nuclear factor kappa-B， NF-κ B）的发挥它们的 作用，以改变基因表达。
实验结果
同一凝胶板下HP寡核苷酸及其突变体对NF-kB结合活性的 影响（图1B）
• 1.空白对照 • 2.核蛋白（同1A处理组）+ NF-kB标记探针 • 3. 20×NF-kB非标记探针 • 4. 20×HP寡核苷酸预处理影响组
• 5. 20×突变HP寡核苷酸预处理影响组
TNF-α +IFN-γ 处理后，发夹寡核苷酸预处理操作能 抑制NF-κ B结合活性，而突变发夹寡核苷酸预处理操 作对NF-κ B结合活性则没有效果！！！
核蛋白 的制备
蛋白印 迹
RNA分 离
RTPCR
实验方法
对iNOS表达的调节
MCEC核提取物的制备
• NF-kB发夹核苷酸(1μ M) 或突变型NF-kB发夹核苷酸(1μ M) • TNF-α 、IFN-γ 诱导前3h加入（预处理）
• 每样约500万个细胞
对iNOS表达的诱导
RNA分离（TRI reagent法）
实验结果
HP寡核苷酸对iNOS的表达的抑制作用（图3A）
• 1. iNOS 标准品
• 2. 未处理组 • 3. TNF-α +IFN-γ 处理后16h
• 4. TNF-α +IFN-γ 处理后16h + HP寡核苷酸 3h前预处理
• 5. TNF-α +IFN-γ 处理后16h + 突变HP寡核 苷酸3h前预处理 图3 MCEC中HP核苷酸及其突变体，还有CHX对TNFα+IFN-γ诱导iNOS表达的影响（蛋白印迹检测）。
实验结果
TNF-α +IFN-γ 增加MCEC中NF-kB的结合活性（图1A） • 1.空白对照
• 2.未处理（对照）组
• 3. TNF-α +IFN-γ 处理组
TNF-α +IFN-γ 处理后， MCEC中NF-kB的结合活性 是原来的3倍以上！！！ 图1 MCEC中HP寡核苷酸及其 突变体对NF-kB结合活性的影响
• （有效抑制细胞因子诱导的 iNOS表达）。
实验材料
• 化学试剂（CHX等，分子级）
• 核酸实验材料（引物、dCTP、32P-ATP等）
• 蛋白印迹（显色系统、iቤተ መጻሕፍቲ ባይዱOS标准样及其抗体等）
• 细胞（MCEC及其培养基、血清等）
技术路线
电泳迁 移分析
细胞 培养
(HP 核苷 酸预 处理)
iNOS 表达 的诱 导
当用TNF-α +IFN-γ 的同时给予一种蛋白质合成抑制剂——放线菌酮，可以废除iNOS表达！！！ 当CHX被加入到TNF-α +IFN-γ 处理10小时后的MCEC，则未能抑制iNOS的表达！！！
讨论与展望
• 使用了结构改性的寡核苷酸——发夹NF-kB的基序，以限定MCEC中NF-κ B在iNOS表达时的作用。 双链发卡寡核苷酸包含与TTTTT连接环中的NF-kB的共有序列。通过GGGACTTTCC被 TCTACGCTAA取代突变作为对照。
RT-PCR
• 亲环蛋白（内参基因引物）: • +5’-ATGGTCAACCCCACCGTGT-3’; • -5’-CGTGTGAAGTCACCACCCT-3’ (220 bp). 蛋白印迹（见Promega技术手册）
• iNOS（目的基因引物）: • +5’-TATGAAGTTATGGGATGTCGTGGCT-3’; • -5’-TAGATACATCCACACCGTTTAGCGG-3’ (300 bp).
• 1. iNOS 标准品
• 2. 未处理组 • 3. TNF-α +IFN-γ 处理后16h
• 4. TNF-α +IFN-γ 处理后16h + CHX（前者处理 10h后加入）
• 5. TNF-α +IFN-γ 处理后16h + CHX（与前者同 时加入） 图3 MCEC中HP核苷酸及其突变体，还有CHX对TNFα+IFN-γ诱导iNOS表达的影响（蛋白印迹检测）。
本文主要内容
背景资料
一氧化氮合酶（NOS）的三种同工酶：
• 神经元型一氧化氮合酶（Neuronal nitric oxide synthase，nNOS或NOS1）
• 内皮型一氧化氮合酶（Endothelial nitric oxide synthase，eNOS或NOS3）
• 诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOS或NOS2）
• CHX没有减少iNOS mRNA表达（数据未示出），而当MCECs用TNF-α +IFN-γ 和CHX同时进行处 理时却完全抑制iNOS的表达。但是CHX并不能对10小时TNF-α +IFN-γ 预处理后MCECS中iNOS的 表达进行抑制。这表明，iNOS的关键阶段合成发生在细胞因子刺激的早期阶段。
• 4. TNF-α +IFN-γ 处理后3h + 突变HP寡核苷酸3h前预 处理
根据RT-PCR， HP寡核苷酸对iNOS在相对mRNA 表达水平的降低率为80±15％ （平均值±SD， N=3） ！！！
图2 MCEC中HP寡核苷酸和它的突变体对TNFα+IFN-γ诱导iNOS表达的影响（RT-PCR检测）。
• 该发夹寡核苷酸（而非其突变体）可有效地对NF-kB结合力（ Binding ）起竞争作用。 • 发夹寡核苷酸也抑制由TNF-α +IFN-γ 的诱导iNOS的表达，这表明iNOS基因表达是由NF-κ B的在转 录水平调控。而通过蛋白印迹分析则进一步被发现该发夹寡核苷酸在蛋白质水平上的效果是不完整 的。这是因为iNOS这至关重要的基因表达不可能仅由一个转录因子调节。
图1 MCEC中HP寡核苷酸及其 突变体对NF-kB结合活性的影响
实验结果
TNF-α +IFN-γ 增加MCEC中iNOS的表达（图2A）
• 1. TNF-α +IFN-γ 处理后0h（未处理组）
• 2. TNF-α +IFN-γ 处理后1h • 3. TNF-α +IFN-γ 处理后3h
• 4. TNF-α +IFN-γ 处理后5h
实验目的
• 在小鼠脑血管内皮细胞（MCECs）中， IFN-γ 与TNF-α 的共同作用能增加的NF-kB （与DNA）的结合力（binding），进一步 增加iNOS的表达。
• 测试含有NF-κ B结合位点 （binding site）共有序列的双 链发夹（Hairpin，HP）寡核苷 酸的功效
• 转录因子活性可以通过反义寡核苷酸 （Antisense oligonucleotides）或双链哑 铃寡核苷酸（Double-stranded dumbbell oligonucleotides）来调节。
TNF-α + IFN-γ 处理也诱导iNOS在蛋白水平上的表达（增加倍数8±2，N=3）！！！ HP寡核苷酸（而非突变体）预处理，也抑制由TNF-α / IFN-G诱导iNOS在蛋白水平上的表达！！！
基于130 kD频带密度法，iNOS蛋白表达的减少率为90±20％ （N=3） ！！！
实验结果
放线菌酮( Cycloheximide ，CHX）对iNOS的表 达的抑制作用（图3B）