牦牛DRA基因克隆测序及生物信息学分析

框共编码 个氨基酸共有个 其中第 外显子分别存 !
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在& 个\#[的同义突变和\#O的错义突变"P#g#!这两个突变均降低了大通牦牛@J!基因EaTO二级
结构的稳定性(S/#"&<\lO突变前后编码蛋白质的分子量%原子总数%脂肪系数%不稳定系数%总平均亲水性
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8TO
相比!表现出一定的特殊性!其产肉性能%繁殖性
双蒸水 扩增步骤为 ";C !P!
%;' !P, _\a
$(' c
能%抗逆性能等均优于一般家养牦牛!遗传性能 预变性$ E=2(($ c变性#" 退火 >! #" >"退火温
更加稳定, 为了解和找出高寒高海拔地区牦牛 度见表&#!%! c延伸#" >!#$ 个循环(%! c延伸
核苷酸序列和氨基酸序列与T\i:中黄牛序列同
!K结果与分析
源性达到了((L以上, !;#K突变前后大通牦牛@J!基因编码蛋白基本
信息比较
!;&K大通牦牛@J!基因扩增琼脂糖电泳图
大通牦牛@J!基因发生S/#"&<\lO碱基
大通牦牛@J!基因' 个外显子_\a扩增片 突变后!编码蛋白质第&<! 位氨基酸由亮氨酸
牦牛,%-基因克隆测序及生物信息学分析
张K丽王媛媛王K瑞刘丽霞!
"西北民族大学生命科学与工程学院!甘肃兰州%#""#"#
摘K要为全面解析牦牛gY\$类基因结构与功能!采用分子克隆测序技术对大通牦牛@J!基因编码区进
行等位基因频率估算并进行生物信息学分析, 结果显示$大通牦牛@J!基因编码区含有%<! 5, 的开放阅读
各NT_>测序峰图如图! 所示, 序列测序结 定系数增加了";(%!总平均亲水性减少了";""%!
果表明!大通牦牛@J!基因共有# 个NT_>!以该 其他基本信息未发生改变" 表!#, 突变前后
基因全序列第& 个碱基为基准!在@J!基因的第 @J!基因编码蛋白均为疏水蛋白!且均为稳定
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浙江农业学报K第#$ 卷K第% 期
养&! *!经转化后的克隆菌液送至杭州金唯智有 ! #%< 5, 处存在\#[突变!位于第! 外显子(第
限公司进行测序, 使用i=HD^=+和PF>W]SW2W软件 ! C$& 5, 处存在\#Z突变!位于第! 内含子(第
因既是一个高度表达的基因座位!又是gY\$类 根据ZW2iF2d 数据库中@J!基因序列"登
抗原最主要的组成部分!主要负责编码"链, 大 录号 和 利用 在线软件 O7$"$""" g#"&!"#! T\i:
多数gY\基因具有丰富的多态性!但@J!基因 _]=EW]?iPON[设计' 对特异性引物如表&!送至
&#' ! gY\$
8TO浓度!加蒸馏水调整样品8TO浓度至&""
原基因是由编码$类抗原"链的@!基因和编码
每 个 构建个总 池 2S-!P)&! !" 8TO &
8TO ! )!"
'链的@Q基因构成!@!基因含有@J!%@_!% c冷冻保存备用,
@3!%@P!和@I!共$ 个基因座位!其中@J!基 &;!K引物设计
A$Z[\OZ\\[\ZO[ZZZO\ZOO a$\[\O\\\\OZ[Z\[[ZOZOO
A$Z[Z\[OOZ\[Z\[\\\[O a$[\\[\[ZO\\O\OZ\OZO\[\
退火温度
O22WFG=2S+WE,W]F+V]W-c $%;# $C;$
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<&;!
片段长度
A]FSEW2+GW2S+* -5, (# !'<
主要组织相容性复合物 KK
" EF1H]*=>+H6HE,F+=?
gY\基因的遗传多样性水平降低可导致畜禽种
5=G=+36HE,GW4! gY\#是一组紧密连锁的基因簇! 群内个体对突发性%传染性病原体的易感性增
收稿日期!"!&?&!?&' 基金项目西北民族大学中央高校基本科研业务费资金资助项目"#&(!"!"""%'! #&(!"!&""<&#(西北民族大学研究生科研创新项目
较保守&'' ,
苏州金唯智生物有限公司合成,
大通牦牛是生长于高寒高海拔地区的唯一 &;#K_\a扩增与测序
一个培育品种!具有明显的野牦牛特征!在生理
反应体系为 _\a
!" !P$! fD$Z_\agF>+W]
生化%行为生态等方面与同海拔的其他牦牛亚种
上下游引物各 基因组 g=4&& !P! %
";' !P!
细胞表面转膜蛋白!通过向[细胞提供抗原!从 传统苯酚氯仿抽提法进行全基因组8TO提取!
而调节免疫反应!在疾病抵抗中起主要作用!与 去离子水溶解稀释, 经&L琼脂糖凝胶电泳检测
牛的疾病呈强相关&!' ,
可分为 类 gY\
gY\# %
8TO提取效果!用紫外分光光度计检验每个样品
类和 类抗原基因 类抗 gY\$ gY\%
础!为牦牛遗传育种方面研究提供基因方面的参 &;'K克隆测序
考数据,
为保证结果准确性!将清晰无杂带的_\a产
&K材料与方法
物用凝胶纯化回收试剂盒纯化回收后连接到[ 载体!并转化到大肠埃希菌8Y$"细胞内!阳性
菌落接种于含氨苄青霉素的Pi液体培养基中培
表;<大通牦牛@J!基因引物序列
?,80#;K_]=EW]>WJVW26WHB@J!SW2W=2 8F+H2S3Fd
gRN2F, 软件对各NT_>等位基因峰高进行测量, 第&<! 位原来的亮氨酸"PWV#变成蛋氨酸"gW+#,
按照文献&$ )%'中介绍的在线软件对大通牦牛 S/!#%<\l[属于沉默突变!不影响氨基酸的表
@J!基因编码区进行突变前后的生物信息学分 达, iPON[比对发现!所得大通牦牛@J!基因
析比较,
浙江农业学报!"#$ !%&'"()#(&$*+,*-'$.%*./'/! !"!#!#$"%#$ &$<' )&$%"
*++,$ --.../012345/62
张丽!王媛媛!王瑞!等/牦牛@J!基因克隆测序及生物信息学分析&7'/浙江农业学报!!"!#!#$"%#$ &$<' )&$%"/
89:$ &";#(<( -1/=>>2/&""'?&$!';!"!&!"!&
张丽! 等/牦牛@J!基因克隆测序及生物信息学分析
-&$<$-
高!致使畜禽抗病能力单一%生存力下降&&', 牛 &;&K血样采集及全基因组8TO提取
又称牛白细胞抗原 gY\
" 5H`=2WGWV6H63+WF2+=?
青海省大通种牛场采集大通牦牛血样$$
SW2! iHPO#!是一类高度多态的基因座位组成的 份!医用采血管保存, 全基因组8TO提取采用
" @4E!"!&"%'#
作者简介张丽"&(C"+#!女!宁夏石嘴山人!博士!副教授!主要从事现代生物技术与动物遗传育种研究, D?EF=G$!C""C!#'#I45EV/W^V/62
通信作者刘丽霞 !
!
!D?EF=G$>dGG4I45EV/W^V/62
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抗病性的遗传基础!本研究对大通牦牛gY\$类 &" E=2!'c保存, 扩增后的_\a产物经GL琼脂
@J!基因编码区进行_\a扩增%克隆及测序!筛 糖凝胶电泳检测!凝胶成像仪拍照并记录结果,
查该基因单核苷酸多态性">=2SGW2V6GWH+=^W,HG3? 检验良好的_\a产物经琼脂糖凝胶回收试剂盒
位置
引物序列
PH6F+=H2
外显子& 外显子 D4H2&"& M(# 5,#
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分析测序峰图并判断突变位点及突变方式, # "&< 5, 处存在\#O突变!位于第# 外显子!分
&;$K等位基因频率的估算及生物信息学分析 别命名为S/!#%<\l[%S/!C$&\lZ%S/#"&<\l
利用i=HW^=+软件查看测序结果! 并运用 O, 其中S/#"&<\lO突变为错义突变"图##!使
段条带清晰!特异性较好!片段大小与理论大小 "PWV#突变为蛋氨酸"gW+#!其蛋白的分子量增
符合!如图& 所示, !;!K大通牦牛@J!基因测序峰图结果
加了 原子组成是 原 &C;"# V! 子总数减少了个脂肪系数减少了 不稳 ! !
\&#"' Y!"!C T##" 9#<& N&" ! &;$'!
EH],*=>E! NT_#突变位点!通过生物信息学的方 纯化回收后直接送至苏州金唯智生物有限公司
法对大通牦牛@J!基因突变前后编码蛋白质的 进行正反双向测序!测序结果用PF>W]SW2W%;" 软
理化性质%结构与功能进行对比分析!为全面解 件比对%校正!最终获得大通牦牛@J!基因序列!
析牦牛gY\$类基因结构与功能的研究奠定基 结合iPON[分析并确定NT_>位点,