免疫分析技术研究进展

免疫分析技术研究进展
摘要：目的：综述免疫分析技术的最新研究进展。

方法：通过查阅国内外有关免疫分析技术的研究论文，对放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、荧光免疫分析(FIA)、化学发光免疫分析(CLIA)等免疫分析技术进行了综述，同时指出了发展前景和尚待解决的问题。

结果：多种免疫分析方法相互结合，可大大提高分析方法的灵敏度，增大检测范围；CLIA和TRFIA是非放射免疫分析的两大主流，其中，CLIA更具有竞争力。

结论：目前还没有一种免疫分析技术是完美无缺的，各种技术还需要不断发展和完善，以开发出更新、更理想的免疫分析技术。

关键词：药物分析学；免疫分析；放射免疫分析；酶免疫分析；荧光免疫分析；化学发光免疫分析
免疫分析法(immunoassay ，IA)是基于抗原和抗体特征性反应的一种技术。

由于免疫分析试剂在免疫反应中所体现出的独特的选择性和极低的检测限，使这种分析手段在临床、生物制药和环境化学等领域得到广泛应用。

各种标记技术(放射性标记、荧光标记、化学发光、酶标记等)的发展，使免疫分析的选择性更加突出。

免疫分析法起始于本世纪50年代，首先应用于体液大分子物质的分析，1960年，美国学者Yalow和Berson等将放射性同位素示踪技术和免疫反应结合起来测定糖尿病人血浆中的胰岛素浓度，开创了放射免疫分析方法的先河。

1968年，Oliver将地高辛同牛血清白蛋白结合，使之成为人工抗原，免疫动物后成功获得了抗地高辛抗体，从而开辟了用免疫分析法测定小分子药物的新领域。

在RIA的基础上，随着新的标记物质的发现及新的标记方法的使用，以及电子计算机、自动控制技术的广泛应用，派生出许多新的检测技术[1]，使免疫分析法逐渐发展成为一门新型的独立学科。

1 免疫分析方法分类
(1)根据标记物的不同，可以免疫分析主要分为放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)、酶免疫分析(enzyme immuoassay，EIA)、化学发光免疫分析(chemiluminescent immunoassay，CLIA)、荧光免疫分析法(fluorescence immunoassay，FIA)等。

(2)按反应机制的不同，可以分为竞争法和非竞争法。

非竞争法是将待测抗原与足够的标记抗体充分反应形成抗原-标记抗体复合物，产生的信号强度与抗原的量成正比。

竞争法是将过量的待测抗原与定量标记抗原竞争结合形成定量的特异性抗体，待测抗原的量越大，与抗体结合的标记抗原量越少，产生的信号强度越小，由此定量待测抗原的量。

(3)还可以按测定过程中的某些步骤的差异分为均相免疫分析和非均相免疫分析两大类。

均相酶免疫测定法的特点是抗原-抗体反应达到平衡，对结合与游
离的标记物无需进行分离，可在自动生化分析仪器上直接测定。

非均相酶兔疫测定法的特点是必须对结合和游离的标记物进行分离，才能测定各自的浓度。

2 放射免疫分析(RIA)
放射免疫分析是以放射性同位素为示踪物，与免疫反应相结合的一种分析方法，提供的检测信号是不断发出的放射线。

常用来标记的放射性同位素有3H、14C、1251、1311等。

放射免疫分析在应用上的优点是准确灵敏、特异性强，仪器试剂价格低廉、技术成熟，在我国仍将在相当长一段时间内被应用、推广和发展。

然而，其在应用上的缺点也是显而易见的，如药盒的使用寿命短，批间、批内变异较大，虽涉及放射性微小，但仍会面临公众反核的负面影响。

此外，放射免疫分析较难进行自动化分析，将面临新一代更灵敏、稳定、快速而且自动化程度高的测量技术的挑战。

3 酶免疫分析(EIA)
酶免疫分析是一种非放射性标记免疫分析技术，以酶标记抗原或抗体作为示踪物，由高活性的酶催化底物显色或发光，达到定量分析的目的。

最初应用的EIA技术，多采用HRP标记抗体或抗原，灵敏度不高。

后来逐步发展了各种放大体系，如底物循环放大体系、酶联级放大体系、生物素-亲和素放大体系、脂质体或红细胞等作为标记物载体以包载大量标记物的放大体系，以及采用PCR 技术的PCR-EIA分析，使灵敏度有很大改进。

3.1 生物素-链亲和素酶免分析(biotin avidin sys-temBAS-EIA)
生物素(botin)广泛存在于动植物组织中，在生物体内是羧化酶的辅酶；亲合素又名抗生物素蛋白，与生物素具有高度的亲和性，利用这一点，以生物素和亲和素为中介，可增强抗原-抗体反应的结合提高检测方法的灵敏度。

但亲和素的非特异性结合高，后又发现另一种亲合素，称之为链亲合素(Streptavin，SA)，克服了亲合素非特异性结合高的缺点[2]。

免疫分析技术中，目前均采用SA供标记酶或其它示踪剂。

一个完整的SA分子上的4个相同亚基，都可以和一个生物素
分子结合，其Ka值达1015L/mo1，是抗体抗原反应的10～100万倍。

又加之一个抗体或抗原分子结合多个生物素分子，不改变其免疫活性。

BAS-EIA的基本模式是以SA和酶的结合物作酶标记物，借助生物素、亲和素的高亲和力达到放大的目的，目前主要采用BSA-多层夹心法[3]：固相抗体-待测样品-生物素化抗体-链亲合素辣根过氧化物酶(SA-HRP)结合物；BSA-固相抗体竞争法[4]：固相抗体-抗原(生物素化抗原)-(SA-HRP)；BSA-固相抗原竞争法：固相抗原(样品抗原)-生物素化抗体-(SA-HRP)；BSA-固相二抗竞争法：固相抗抗体-抗体-生物素化抗原-(SA-HRP)。

3.2 脂质体免疫分析法(liposome immunoassay LIA)
脂质体是一种生物摸拟膜，它是磷脂分子分散于水相介质中形成的密闭的双子单层或多层的囊泡。

其膜内可包容上万个标记物分子，具有很高的信号放大作用。

因此，将脂质体用于免疫分析是提高非放射免疫分析灵敏度的有效途径之一，由此所建立起来的方法即为脂质体免疫分析法。

3.2.1 LIA的分类
LIA的测定模式主要有补体介导法、细胞膜溶解素介导法、凝集法和六角相变法。

补体介导法是依赖于补体的脂质体免疫的分析法，利用脂质体膜表面抗原抗体反应激活补体使脂质体溶解。

补体介导法的优点是均相、快速、灵敏、样品用量少及可实现自动化，既可以测定小分子的半抗原[5]，又可以测定大分子的蛋白或抗体[6，7]。

其不足在于测定结果受脂质体膜表面形成的抗原-抗体复合物的数目、抗体的亲和力以及补体的活性等影响较大；参与经典途径激活的补体成分较多且不稳定，其中任何一个失活，都将导致脂质体溶解的减少或失败；所使用的补体活性有差异，每一批新的补体在使用之前都需测定其理想的浓度或稀释度。

细胞膜溶解素介导法是依据细胞膜溶解素及其与半抗原(或半抗原类似物)的复合物使脂质体膜溶解并释放出内含的标记物，而相应的游离抗体则抑制它的溶解建立起来的分析方法。

该方法具有通用性，一种脂质体的制备可用于不同分析物的测定，并且脂质体不致敏，避免了使用易变的补体，整个试验快速，可在5～10min内完成。

不过，该测定模式的敏感性受抗体的亲和力及半抗原-细胞膜溶解康的复合物的溶解活性影响较大。

六角相变法是依据某些磷脂如磷脂酰乙醇氨或心磷酯在一定条件下可分别形成脂质体和极不稳定的六角形相II(Hexagona，HII，)两种结构，且两者可以发生相变的性质，建立LIA，统称为六角相变法。

又可分为二价阳离子非双层构型诱导抑制法、靶敏感免疫脂质体测定法、接触敏感的脂质体免疫分析法[8]。

3.2.2 LIA的标记物及信号测量
LIA应用研究的早期，人们以顺磁分于做标记物[9]，采用电子自旋共振技术测量信号。

这种检测体系安全而灵敏，但仪器昂贵，而且实验中还必需避免自旋信号为生物液所猝灭。

用天然酶如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶(GOD)[10]等作标记物，优势在于信号可以用分光光度计测量，利于LIA的普及和推广；天然酶不会从脂质体中渗漏出来，从而保证了低的检测背景；脂质体和酶的双重放大作用使体系具有更高的灵敏度。

缺点是该体系脂质体溶解后不能直接进行信号测量，而必须先进行酶与底物的反应；脂质体制备期间，酶不可避免
地会部分失活。

用荧光分子如羧基荧光素(CF)、钙黄绿素等作标记物，则脂质体溶解后无需进一步的反应，可直接用荧光分光光度计测量信号，此外，这类标记物以高浓度包裹在胎质体内时发生荧光自摔灭作用，从而保证了低的检阅背景和高的检阅灵
敏度。

但荧光分子体积太小，能够从脂双层中渗漏出来，另外，Stoke s位移小
于50 nm的荧光物质还存在着光散射的影响。

3.3 PCR-EIA分析
PCR-EIA技术是运用PCR的高度敏感性来放大抗原抗体反应的特异性，它以一段特定的双链或单链DNA来标记抗体，用PCR扩增抗体所连接的DNA，由PCR产物的量来反映抗原分子的量。

由于PCR的高扩增能力，只需数百个抗原分子即可检测，甚至在理论上可检测到一至数个抗原分子。

3.3.1 PCR-EIA模式
最初Sano等建立的免疫PCR模式为：固定化抗原-抗体-蛋白Ao链亲和素-生物素oPUC19，可以检测到600个BSA抗原，比用碱性磷酸酶作为标记物的ELISA敏感度高106。

虽然这种方法有极高的灵敏度，但所用的连接分子链亲和素-蛋白A嵌合体还没有商品化，限制了它在实际应用中的广泛普及。

Ruzicka[11]等人以生物素化的抗体取代Sano PCR-EIA系统中的抗体，采用固定化抗原-抗体o链亲和素-生物素oPUC19模式。

这种方法不需要特殊的试剂，生物素和亲和素(链亲和素)都已经商品化，因此在实际操作中得到广泛应用[12]。

3.3.2 PCR扩增产物的检测
一般是通过琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色来检测并定量的，也有在凝胶电泳后用Southern杂交来检测PCR产物[13，14]。

1997年，Niemeyer[15]提出所谓免疫PCR和PCR-ELISA检测并定量PCR产物。

它主要是用一对分别标记生物素和地高辛的引物来扩增标记DNA，以亲和素作为捕获抗体固定扩增产物，用标记上碱性磷酸酶的抗地高辛抗体进行双抗夹心ELISA，即固相亲和素-生物素oDNAo地高辛-抗体o碱性磷酸酶，使结果具有更高的稳定性和可重复性。

4 荧光免疫分析(FIA)
FIA是以荧光物质标记抗原或抗体，形成的标记物发生免疫反应后，引起荧光强度发生变化，从而达到定量分析的目的。

荧光免疫分析的方法很多，如荧光偏振免疫分析(fluroescence polaruzation immunoassay PFIA)、荧光猝灭免疫分析(fluorescemt enchancement immumoassay)、荧光增强免疫分析(Flurorescent Enhancement Immunoassay FEIA)。

传统荧光免疫分析受到散射光、样品的背景荧光和荧光淬灭等因素的干扰，
分析灵敏度较低。

而时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluorescence immunoassay TRFIA)弥补了这一缺陷。

其原理是应用镧系元素结合有机配体形成三价离子态时，在特定波长的紫外线激发下，从基态跃迁到高能态，经200us的固定时间延迟，返回基态时发射特定荧光。

由于时间延迟以及激发光与发射光的频移，有效地屏蔽了由血清等生物物质产生的荧光，降低了本底，与RIA和EIA 相比，TRFIA具有更好的特异性和精密度[16，17]。

时间分辨荧光免疫分析方法根据不同的激发源及分析体系，现有三种分析体系。

一类以芬兰Wallac-ABCU8为代表。

这类免疫分析方法中，免疫结合物镧系离子必须在酸性的增强液内解离出来，并与另一种螯合剂结合，达到增强荧光的作用，称为解离增强澜系荧光免疫分析(DE-LFIA)；另一类以加拿大Cyberfluor 系统为代表，采用BCPDA为螯合剂，引入生物素-链亲合素系统以提高灵敏度，直接进行固相测量；还有一类以美国Packard-HTBF微板系统为代表，配合特殊替合剂，可进行均相法检测。

目前，正在发展的TRFIA技术有：应用多标记、共包被等技术实现多个待测物同时检测；研制具有足够络合稳定性、良好的亲和性和优良的可检测性的配基作为标记物，以克服易受外源性污染影响的缺陷；选择活性基团密度高的载体实现多重标记以提高分析灵敏度；以及荧光极化的均相免疫分析技术等。

5 化学发光免疫分析(CLIA)
化学发光免疫分析是将高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，借以检测抗原或抗体的分析技术。

它包含化学发光反应与免疫反应两个部分。

化学发光反应是利用某些特定的化学反应所产生的能量使其产物或反应中间态分子激发，形成电子激发态分子，当这种激发态分子回到稳定的基态时，所释放的能量以可见光形式发射。

直接化学发光物质标记法常用的发光标记物是吖啶酯和吖啶酰胺类，将其直接标记于抗原或抗体，通过启动发光试剂(NaOH-H2O2)即可发出快速的闪烁光；化学发光酶免分析是将EIA与CL结合起来，以化学发光物质作为酶底物，在酶的催化放大和启动发光试剂的共同作用下发光。

常用的的化学发光物为鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物类、(金钢烷)-1，2-二氧乙烷及其衍生物类，为提高灵敏度，还可以加入发光增强剂，如3-氯-4-羟基-乙基苯胺。

60年代以来，逐步发展为电化学发光免疫分析。

文献报道了很多物质的电化学发光，最常见的是利用稀土元素“钌”进行标记，磁颗粒作B/F分离及电极上的氧化还原反应来进行分析，测定结果十分稳定。

近10年来CLIA发展迅猛，是目前发展和推广应用最快的免疫分析方法之一，尤其是ECLIA。

它具有实现均相测量和多元检测等独特的优点，同时化学发光仪已发展为全自动化，全部工作由计算机控制，即从加样、传输、温育、分离、洗涤和测量到数据处理和结果打印，全部实行自动化。

以上介绍了多种免疫分析方法，它们之间还可相互结合、互相补充，如将
EIA与荧光技术或化学发光技术结合，形成荧光酶免疫分析(FEIA)及化学发光酶免疫分析(CLEIA)，从而大大提高灵敏度，增大检测范围。

CLIA和TRFIA是非放免分析的两大主流，但从发展速度和市场应用推广来看，CLIA更具有竞争力。

但不管怎样，目前还没有一种免疫分析技术是完美无缺的，因此，各种技术还需要不断发展和完善。

人们正在不断研究，以开发出更新、更理想的免疫分析技术。