坛紫菜丝状体辐射诱变后的筛选与培养

核农学报2023，37（12）：2327~2333
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
坛紫菜丝状体辐射诱变后的筛选与培养
许万涛秦欣陈海敏骆其君 *
（宁波大学海洋学院，浙江宁波315211）
摘要：为建立合适的筛选坛紫菜丝状体突变体的方法，将经60Co-γ射线诱变的丝状体分别接种到海水和扇贝壳中，观测丝状体的突变率。

结果表明，丝状体经γ射线辐射后，仍具有钻入扇贝壳的能力，在扇贝壳上发生了丰富的颜色突变，在1 000 Gy辐射剂量下丝状体突变率最高，各不同诱变梯度下，在自由丝状体阶段的突变率均低于在扇贝壳丝状体的阶段。

此外，为探究突变体的适宜生长温度和培养介质，将60Co-γ射线辐射诱变得到的粉色和绿色突变体为材料，选取扇贝壳、琼脂培养基和海水等基质，设置4个温度梯度（14、17、20、23 ℃），观测突变藻丝细胞的长度、宽度及分枝数量变化。

结果表明，粉色和绿色突变体在23 ℃的培养温度和扇贝壳基质中，突变性状较稳定，生长状况较佳，粉色突变体藻丝细胞的长度、宽度及分枝数量分别为190.35 μm、12.23 μm、10.00个，藻丝细胞的宽度和分枝数量的增长率约为19.43%和28.21%；绿色突变体藻丝细胞的长度、宽度及分枝数量分别为115.89 μm、11.26 μm、3.80个，藻丝细胞的宽度增长率约为9.96%。

本研究结果为坛紫菜自由丝状体突变体的筛选提供了新的方法，为探索突变体适宜生长发育的培养温度及基质提供了参考。

关键词：坛紫菜；60Co-γ射线；丝状体；诱变；突变体
DOI：10.11869/j.issn.1000‑8551.2023.12.2327
γ射线是一种波长短于X射线的电离辐射线，不带有电荷，属于中性射线，其产生的电离可以直接或间接改变DNA的结构［1］。

辐射诱变增加了突变的频率，能够缩短育种周期［2］，在短时间内培育出农作物新品种，是植物品种改良的重要途径［3-5］。

藻类学者已利用该诱变源培育出了坛紫菜申福1号和申福2号等品种［6-8］。

匡梅等［9］用60Co-γ射线诱变坛紫菜和条斑紫菜，发现紫菜的形态、色素产生了特殊变异。

此外，前人研究发现，牡蛎壳、扇贝壳、文蛤壳［10］和鸡蛋壳［11］均可作为紫菜种苗培养的基质。

扇贝壳作为被广泛应用的紫菜育苗培养基质之一，适合紫菜的丝状体生长且容易获得［12］。

当前对紫菜育苗培养技术的研究主要聚集于培养环境条件，如光照强度、光周期与培养水温等［13-15］，以及黄斑病［16-17］等病害防治方面，对丝状体培育介质性能的系统性研究较少。

而辐射诱变后的自由丝状体生长不稳定，需要探究适宜的培养条件来稳定藻丝的存活及突变体的性状。

因此，本研究将60Co-γ射线辐射诱变得到的坛紫菜（Neoporphyra haitanensis）自由丝状体接种到扇贝壳上，比较在海水和扇贝壳上的突变率，筛选突变体；以辐射诱变得到的粉色、绿色突变体为试验对象，选取扇贝壳、琼脂培养基等基质，设置4个温度梯度（14、17、
20、23 ℃），测定丝状体在不同培养条件下的生长结果，探究突变株的适宜生长温度和培养介质，以期为突变体的培养提供参考。

1　材料与方法
1.1　材料与试剂
坛紫菜浙东1号自由丝状体来自浙江省海洋生物技术重点实验室。

1.2　仪器与设备
Eclipse Ti 倒置荧光显微镜，SMZ 18 解剖镜，尼康仪器（上海）有限公司；GXZ型智能光照培养箱，宁波江南仪器厂。

1.3　试验方法
1.3.1　突变率的检测　将经60Co-γ射线辐射处理2 d 后的坛紫菜丝状体接种于扇贝壳上，培养21 d后，发现
文章编号：1000‑8551（2023）12‑2327‑07
收稿日期：2023‑04‑29 接受日期：2023‑06‑15
基金项目：宁波市重大科技项目（2021ZDYF020081），现代农业产业技术体系专项资金（CARS-50），浙江省重大科技专项（2021C02069-9）作者简介：许万涛，男，主要从事海藻资源研究。

E-mail：1324615088@
*通讯作者：骆其君，男，教授，主要从事海藻栽培研究。

E-mail：luoqijun@
2327
核农学报37 卷
在贝壳上长成不同颜色的藻落，在13.5倍解剖镜下检查40个视野下的突变藻落数，对突变率进行统计，突变率=（变异藻落数/视野下检查到的藻落数）×1
000‰。

将经辐射诱变后的自由丝状体进行培养，筛选出与对照组具有明显差异的丝状体，并在不同温度和基质下对突变体的生长参数进行检测。

1.3.2　初始藻落密度的检测　称取60Co-γ射线辐射处理后的0（对照组）、50、125、400、1 000、1 600 Gy辐射组藻球各0.02 g，用吸水纸吸干，置于200 mL灭菌海水中打碎至藻丝长度为100~300 μm，将扇贝壳洗刷水煮消毒后铺满直径为8.5 cm的培养皿，用吸管将藻丝混匀取45 mL置于培养皿中暗处理2 d，后转移至培养条件为温度20 ℃、光照强度18 μmol∙photons∙m-2∙s-1、光周期为光照14 h/黑暗10 h的光照培养箱中，培养液为灭菌海水加入Ⅲ号营养母液（990 nmol∙L-1KNO3，57 nmol∙L-1 K2HPO4，9 nmol∙L-1 FeSO4·7H2O，54 nmol∙L-1 Na2EDTA，1 nmol∙L-1 MnSO4·H2O）以促进丝状体生长。

24 d后，在解剖镜下计数统计每个扇贝壳5个视野（10 mm×10 mm）内的平均藻落数。

待藻丝生长至布满整个扇贝壳后再转移到光照培养箱中，培养条件为：温度28 ℃，光照强度15 μmol∙photons∙m-2∙s-1，光周期为光照8 h/黑暗16 h，培养液为灭菌海水加入磷酸氢二钾，灭菌海水与磷酸氢二钾体积比为1 000∶1，以促使孢子囊枝的形成，显微观察诱变后的丝状体形态。

1.3.3　丝状体辐射诱变后的筛选和培养　将扇贝壳表面的泥沙清洗干净，放至2%~3%的稀盐酸溶液中浸泡12 h，清水冲洗至pH值呈中性，烘干备用；配置2%的琼脂培养基备用；准备盐度为25的灭菌海水。

将自
由丝状体打碎至100~300 μm的小段，接种到扇贝壳、2%琼脂培养基、无菌海水3种基质上。

扇贝壳打碎平铺至培养皿中，加入灭菌海水30 mL，琼脂培养基和灭菌海水也倒置在同样大小的培养皿中，共设置3组平行，培养条件为光照强度18 μmol∙photons∙m-2∙s-1，光周期为光照12 h/黑暗12 h，培养时间为15 d，设置4个温度梯度，分别为14、17、20、23 ℃。

将粉色和绿色突变体，分别接种在扇贝壳、琼脂培养基和海水上，15 d 后分别测量藻丝细胞的宽度、长度和分枝数量。

1.3.4　数据处理分析　数据采用Excel 2007进行处理，用SPSS 20.0进行相关性分析，Origin 2018进行绘图，P<0.05为统计显著。

2　结果与分析
2.1　丝状体辐射诱变后的突变率
结果表明，丝状体在不同剂量60Co-γ射线辐射下会出现一些突变体，如不同颜色、色素嵌合体、生长与对照组存在明显差异的丝状体。

在相同辐射剂量下，丝状体的突变率在不同培养基质中有明显差异，均表现为扇贝壳基质高于海水基质。

在海水基质中，随着辐射剂量的增加，在辐射剂量低于1 000 Gy时，突变率呈升高趋势（表1），辐射剂量1 000 Gy时突变率最高（0.243‰），辐射剂量高于1 000 Gy时，突变率显著降低（P<0.05）。

在贝壳基质中，辐射剂量低于1 000 Gy 时，丝状体突变率随着辐射剂量增强显著提高，并在辐射剂量为1 000 Gy时具有最高突变率（0.382‰），出现了更为丰富的突变表型。

2.2　丝状体辐射诱变处理的初始藻落密度
试验结果表明，自由丝状体经γ射线诱变后仍具有钻壳和萌发生长的能力，由图1可知，对照组（0 Gy）贝壳丝状体的颜色最浅，随着60Co-γ辐射剂量的增加，贝壳丝状体的藻落密度整体呈现上升的趋势，其中，辐射组（1 000 Gy）贝壳丝状体颜色最深。

由图2可知，辐射组的自由丝状体初始藻落密度均极显著高于对照组（P<0.01），与对照组相比，50 Gy辐射组的初始藻落密
度为2 948个∙cm-2，1 600 Gy辐射组的初始藻落密度最高（3 593个∙cm-2）。

上述结果表明，经60Co-γ射线处理过的丝状体更容易钻进贝壳，可能适用于贝壳丝状
体的采苗。

2.3　丝状体突变体在不同温度下的显微结构及生长
如图3所示，随着培养温度的升高，藻丝生长逐渐
表1　丝状体辐射诱变后接种于不同基质中21 d后的突变率
Table 1　Mutation rates after conchocelis radiation mutagenesis inoculated in different matrix for 21 days/‰
基质 Matrix
海水 Seawater 贝壳 Shell
辐射剂量Radiation dose/Gy
50
0.024±0.012d
0.031±0.006e
125
0.052±0.014c
0.068±0.004d
400
0.125±0.015a
0.233±0.003b
1 000
0.243±0.023a
0.382±0.002a
1 600
0.124±0.017b
0.210±0.001c
注：不同小写字母表示丝状体在同一基质不同辐射剂量之间差异显著（P<0.05）。

Note： Different lowercase letters indicate significant differences in the radiation dose between the same matrix of conchocelis at 0.05 level. 2328
12 期坛紫菜丝状体辐射诱变后的筛选与培养加快。

结合表2可知，对照组藻丝在不同温度下接种于扇贝壳培养15 d 的生长发育情况如下：14 ℃下，藻丝钻入贝壳内部，主分枝在2条左右，长度为45.21 μm ；在17和20 ℃下分枝数量、长度和宽度都有所增加，在23 ℃下，藻丝在贝壳内部呈辐射生长，主分枝数量明显增加，长度和分枝数量分别是14 ℃下的4.56和3.90倍，
藻丝有少量单侧分枝，丝状体继续生长，宽度逐渐增加至10.24 μm ，形成较多的盘状体，向四周辐射生长。

粉色突变体藻丝在不同温度下接种于扇贝壳培养15 d 的生长发育如下：14和17 ℃下，藻丝钻入基质内生长，长度、宽度及分枝数量相近，生长状况无明显差异；
20 ℃下，藻丝的长度大幅度增长，为144.63 μm ，相比
对照组增加了14.34%，分枝数量增多；23 ℃下，藻丝的生长加快，向外生长类似自由丝状体，分枝数量为10个，比对照组极显著增加了28.21%（P <0.01），分枝的顶端细胞体积变大，呈纺锤形或其他不规则形状。

绿色突变体藻丝在不同温度下接种于扇贝壳培养15 d 的生长发育情况如下：14 ℃下，视野中仅定位到个别单根藻丝，17和20 ℃下，发现藻丝的长度无明显增加，可见个别分枝；20 ℃下，藻丝颜色加深，说明藻丝已稳
定生长于基质上，色素含量有所回升，分枝清晰可见；23 ℃下，藻丝的分枝颜色加深，藻丝明显增粗，宽度为11.26 μm ，比同温度下对照组增加了9.96%。

2.4　丝状体突变体在不同基质上的显微结构及生长
由图4可以看出，丝状体突变体接种于不同基质上，在23 ℃下培养14 d 生长发育有所差异。

由表3可知，绿色突变体在琼脂培养基中生长较为缓慢，长度与对照组相比无明显差异，分枝数量少于对照组，仅为1.31个；在海水中藻丝颜色与对照组一致，颜色变浅，主枝长度为101.46 μm ，与对照组相比无明显增长；在扇贝壳中藻丝颜色加深，长度和分枝数量显著低于对照组，宽度与对照组相比差异不显著。

粉色突变体在琼脂培养基中长度和分枝数量增加，颜色正常；在海水中色素呈弥散状，主枝长度增加；在扇贝壳中主枝和侧枝呈散开状向周围生长，分枝数量极显著高于对照组，为10个。

3　讨论
近20年，使用γ射线处理观赏植物种子的报道中，多数使用的剂量范围为0~500 Gy ［18-19］。

宋佳宝等［20］研究发现，辐射剂量超过50 Gy 会抑制丁香花的生长。

在坛紫菜丝状体的研究中，陈昌生等［21］发现，不同60Co-γ射线辐射剂量对丝状体存活率影响不同，
同时经γ射线辐射后的坛紫菜自由丝状体容易出现色素突变。

严兴洪等［22］发现辐射剂量500 Gy 是诱导条斑紫菜叶状体色素突变的最合适的剂量。

本研究发现，经60Co-γ射线辐射后的自由丝状体，仍具有钻入扇贝壳的能力，不同诱变梯度的丝状体接种在扇贝壳上培养21 d 的密度均高于对照组，表明辐射刺激了丝状体的生长，促使自由丝状体固着在扇贝壳基质上。

在坛紫菜丝状体的辐射诱变过程中，辐射剂量为1 000 Gy 时突变率最高，扇贝壳上出现了不同颜色的藻落，发生了丰富的颜色突变，这与王素娟等［23］和陈昌生等［21］研究得到γ
射线处理的条斑紫菜自由丝状体附着贝壳上注：**表示在P <0.01水平与对照有极显著差异。

Note ： ** indicate extremely significant difference at 0.01 level.
图2 不同辐射剂量处理对自由丝状体所形成的初始藻落密度
的影响
Fig.2　Effect of different irradiation dose treatments on the
density of initial conchocelis colony
注：A ：对照组（0 Gy ）；B ：50 Gy ；C ：125 Gy ；D ：400 Gy ；E ：1 000 Gy ；F ：1 600 Gy 。

Note ： A ： Control （0 Gy ）. B ： 50 Gy. C ： 125 Gy. D ： 400 Gy.
E ： 1 000 Gy.
F ： 1 600 Gy.
图1 辐射诱变处理后的丝状体钻壳情况
Fig.1　Drilling of conchocelis after radiation mutagenesis
treatment
2329
核农学报37 卷
后发生不同颜色变异的结果相符。

同时，本研究中相同辐射剂量下丝状体在海水基质中的突变率均低于扇贝壳基质，推测是由于扇贝壳基质更有利于自由丝状体的生长，并稳定和放大了突变型丝状体的突变特性。

由于自由丝状体采苗［24］、单孢子采苗［25］、紫菜叶状体细胞酶法采苗［26］等无培养基质采苗量达不到生产实践要求，目前已被市场淘汰，当前紫菜种苗产业大多依然沿用基质培养技术进行种苗培育，丝状体虽然
在不同基质上的生长发育情况不一，但每种基质有其自身的优缺点。

天然的贝壳由碳酸钙和蛋白质构成［27］，贝壳丝状体具有特殊的生长方式，浮游状态的果孢子遇贝壳基质后会萌发形成丝状体后钻入贝壳生长［28］，硅藻、蓝藻等杂藻不具备钻入贝壳的能力，因此生产实践中，通过简单清洗贝壳表面即可去除大部分杂藻、纯化、大规模培养贝壳丝状体，而在海水中筛选扩繁自由丝状体则容易受到杂藻的污染［29］。

扇贝壳
注：A ：对照组；B ：绿色突变体；C ：粉色突变体。

下同。

Note ： A ： Control. B ： Green mutant. C ： Pink mutant. The same as following.
图3 贝壳丝状体在不同温度下的显微图
Fig.3　Micrographs of the shell-borne conchocelis grown at different temperature
表2　不同温度对贝壳丝状体生长发育的影响
Table 2　Effect of different temperatures on the growth and development of the shell-borne conchocelis
组别
Group
对照组
Control group
粉色突变体Pink mutant
绿色突变体Green mutant
温度
Temperature/℃
141720231417202314172023
长度Length/μm
45.21±2.4663.95±3.21
126.53±4.21206.35±9.21
53.57±3.46**52.48±4.89
144.63±6.87**
190.35±7.9552.41±3.86**57.83±4.92
104.74±7.96115.89±5.34宽度Width/μm
8.13±1.428.31±2.519.24±1.23
10.24±2.158.52±2.428.81±2.369.91±1.5112.23±2.798.12±1.718.54±2.579.83±1.7011.26±2.52分枝数量
Number of branches
2.00±0.63
3.00±0.64
4.80±0.757.80±0.753.00±0.633.80±1.47
7.00±0.89**10.00±1.41**
1.20±0.75
2.00±0.632.40±0.49
3.80±0.75注：**表示在P <0.01水平上与对照具有极显著差异。

下同。

Note ： ** indicate extremely significant difference at 0.01 level. The same as following.
2330
12 期坛紫菜丝状体辐射诱变后的筛选与培养为采苗常用的纯天然材料，主要成分为碳酸钙、几丁质及蛋白质；琼脂固体培养基是在海水培养液中加入凝固剂琼脂而制成的，主要是提供固体支撑面，便于丝状体地钻入，丝状体在两种固态基质中的生长及发育水平有差异，可能与培养基质的结构和有机成分等因素有关。

扇贝壳的内层由文石晶体组成［30］，扇贝壳内层的方解石晶体具有16°~28°的倾斜角度，乳突层的晶体取向是随机的，这些天然生物基质中均含有1%~5%的有机成分［31］，区别于琼脂培养基中的单一营养成分。

丝状体在琼脂培养基上的生长发育水平劣于在贝壳上，说明丝状体的生长能力可能与基质的有机成分有关，琼脂的硬度可能会影响丝状体的钻入能力，厚度可能会直接影响后期壳孢子放散水平，说明丝状体的生长能力还可能与琼脂的硬度和厚度有关，有必要进一步开展不同浓度和厚度的琼脂培养基对自由丝状体的影响试验。

本研究中，粉色突变体和绿色突变体的显微结构
和生长形状存在明显差异。

粉色突变体分枝的顶端细
图4 自由丝状体生长于不同介质下的显微图
Fig.4　Micrographs of free-living conchocelis cultured in different matrix
表3　不同基质对贝壳丝状体生长发育的影响
Table 3　Effect of different matrix on the growth and development of the shell-borne conchocelis
组别Group
对照
Control group
粉色突变体Pink mutant 绿色突变体Green mutant
基质Matrix 海水琼脂培养基扇贝壳
海水琼脂培养基扇贝壳海水琼脂培养基扇贝壳
长度Length/μm
103.26±5.56127.37±8.74206.35±9.21
130.67±9.56**157.84±9.96**190.35±7.95101.46±5.97105.56±9.52115.89±5.34**宽度Width/μm
8.01±1.738.24±1.52
10.24±2.158.45±2.358.74±2.5112.23±2.7910.21±2.41
10.78±2.69**11.26±2.52分枝数量
Number of branches
1.23±0.243.25±0.237.80±0.75
3.24±0.64**5.13±0.31**10.00±1.41**0.95±0.211.31±0.253.80±0.75**
2331
核农学报37 卷
胞体积变大，呈纺锤形或其他不规则形状。

在相同温
度下，粉色突变体的长度、宽度和分枝数量均高于对照
组，其中，23 ℃条件下宽度和分枝数量均最高。

同时，
相对于对照组，粉色突变体在各种培养基质中生长状
态更好。

裘叶帆等［32］研究发现，红色突变体的叶状体
生长快于野生坛紫菜；绿色突变体能稳定生长于基质
上，分枝清晰可见，藻丝宽度略高于对照组。

60Co-γ射线辐射会影响植物体内叶绿素含量，导致不同程度上
影响植物的光合作用［33-34］，综上，推测是由于红色突变
体和绿色突变体之间存在生长差异。

4　结论
本研究对坛紫菜自由丝状体进行60Co-γ辐射，发现射线促进了丝状体的钻壳能力，辐射后的丝状体在贝壳上表现出了丰富的突变特性，1 000 Gy处理组的贝壳丝状体突变率最高，为0.382‰，高于自由丝状体阶段的突变率。

对筛选到的粉色和绿色突变体进行适宜基质和温度探究，发现两种突变体在23 ℃的培养温度和贝壳培养基质下，生长发育水平达到最佳，且粉色突变体的生长性能优于对照组，说明粉色突变体可能具有良好的培育潜力。

绿色突变体在海水、琼脂培养基、贝壳上的生长优势均低于对照组，但其钻壳能力相对弱于对照组，下一步可开展更多的基质筛选试验。

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Screening and Culture of Free-Living Conchocelis in Neoporphyra haitanensis After Radiation Mutagenesis
XU　Wantao QIN　Xin CHEN　Haimin LUO　Qijun *
（School of Marine Science， Ningbo University， Ningbo， Zhejiang 315211）
Abstract：To establish an appropriate method for screening free-living conchocelis mutants of Neoporphyra haitanensis， the conchocelis were exposed to 60Co-γ-ray irradiation. Subsequently， the irradiated conchocelis were separately cultured in seawater and on scallop shells to observe the mutation rate of the conchocelis. The results indicated that， after exposure to γ-ray irradiation， conchocelis retained the ability to penetrate scallop shells， and showed rich color mutations. The highest mutation rate was observed at a radiation dose of 1 000 Gy，with the mutation rates of free-living conchocelis being consistently lower than those of shell-borne conchocelis under different radiation intensities.Furthermore，to investigate the optimal growth temperature and culture medium for mutants， pink and green mutants induced by 60Co-γ-ray radiation were cultured on scallop shells，agar medium， and in seawater. Four temperature gradients （14， 17， 20， 23 ℃） were set， and the changes in the length，width，and branching of mutant conchocelis cells were observed.The results revealed that the pink and green mutants exhibited relatively stable mutation and the growths were optimum when grown at a temperature of 23 ℃ on scallop shell substrates. In the case of the pink mutant， the conchoceli had a length of 190.35 μm， a width of 12.23 μm， and branches numbers of 10.00. The growth rates for width and branching numbers were approximately 19.43% and 28.21%， respectively. For the green mutant， the conchoceli’s length，width， and branching numbers were 115.89 μm， 11.26 μm， and 3.80， respectively， with a width growth rate of approximately 9.96%. Hence， the results provided a new method for screening free-living conchocelis mutants of N. haitanensis， and could be beneficial for exploring the optimal cultivation temperature and substrates for the growth and development of mutants.
Keywords：Neoporphyra haitanensis，60Co-γ-ray， conchocelis， mutagenesis， mutant
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