扫描电镜标本制备技术[资料]

扫描电镜标本制备技术
扫描电镜Scanningelectronmicroscope，SEM)与透射电镜在观察中获得的超微结构信息各有所长，并互相补充。

透射电镜样品制备技术主要用于观察生物样品内部的二维平面的微细结构，而扫描电镜所收集的主要是电子束照射在样品上所产生的二次电子。

由于扫描电镜景深长，故其图像层次丰富，立体感强，可显示生物样品表面及其断面的三维立体结构。

一、SEM生物样品制备的基本要求及操作程序
生物样品与金属、矿物等材料不同，具有质地柔软、容易变形、导电性能差、二次电子发射率低、含水量多(有的含水达80%以上)等特点，因此对热、干燥、电子轰击等十分敏感，所以扫描电镜生物样品的制备有以下基本要求：
1.注意表面的清洁，防止污染。

2.样品要干燥，不能变形，尽量保持样品表面的微细结构。

3.导电性能要好，应进行导电处理。

4.二次电子的发射率要高。

5.注意确认和保护样品的观察面。

尽管不同的生物样品可以采用不同的制备方法，但一般情况下除了比较坚硬的组织(骨骼、牙齿、指甲、毛发、贝壳、昆虫及某些植物样品)和需采用某些特殊制备技术者(管道铸型扫描、低电压观察法
等)外，均需要经过取材、清洗、固定、脱水、干燥及金属镀膜等基本操作程序。

(一)取材
1.取材前应作好药品及器材的准备，每次取材的品种及数量不宜过多，以免延误时间、影响制样效果。

2.动作要迅速，材料应尽快进入固定液。

3.取材部位要准确。

观察组织细胞表面结构为主的样品，直径最大不宜超过5mm，高度可在3～5mm之间。

观察组织细胞内部结构为主的样品，直径应小于2mm，高度可在3mm左右。

为了提高固定、脱水、干燥及镀膜效果，在满足所需要观察内容的条件下，样品块以尽量小一些为宜。

4.机械损伤要小，解剖器械要锋利，取材动作要轻巧，避免牵拉和钳夹，并做好对观察面的标记。

5.操作应在低温(0～4℃)下进行。

(二)样品情况在样品制备过程中，应注意清除覆盖于样品表面的粘液、分泌物、组织液、血液、细胞碎片、药物反应沉淀物等所造成的污染，否则不仅会掩盖样品表面的微细结构，甚至会得出错误的判断。

清洗的方法很多，不同的样品可选用与之相适应的清洗方法。

1.比较干净的组织可在固定后清洗，常用磷酸缓冲液。

具体方法是将样品放入干净的玻璃小瓶内，倒入不少于20倍的清洗液，按一定方向轻轻摇动小瓶，并反复更换新清洗液，至充分洗净为止。

2.表面覆盖大量粘液和杂质的样品，宜在固定前清洗。

对一些粘着杂质多而紧密的样品，可利用振荡器或用注射器(或喷射瓶)加压冲洗，所用时间可根据样品附着物的情况而定。

3.游离细胞、微生物及其他微小生物样品的清洗，一般采用离心清洗法。

具体步骤是将固定后的样品放入刻度离心管内，加入10ml 与固定液相应的缓冲液或PBS，摇匀或轻轻搅匀后，4000r/min离心3～5分钟，弃去上清液，再重复洗3～4次即可。

4.对于较坚硬的组织可用软笔或橡胶的吹风球清理。

5.超声波清洗法，用于表面形态结构复杂、皱折、凹陷多，而又嵌有细小杂质，或孔洞较多，不易清洗的样品。

在超声清洗时，应根据样品的大小及污染的程度，严格控制频率和功率的强弱，谨防因强度过大或超声时间过长而引起样品破碎变形。

6.酶解法。

某些生物样品表面覆盖一些粘液，或其他的分泌物，可用水解酶处理。

如胃肠粘膜等，可在样品初固定后，选用不同的低浓度蛋白水解酶，如胰蛋白酶、糜蛋白酶等或其他具有水解作用的溶液(N-2酰半胱氨酸等)，进行处理。

7.酸碱腐蚀法。

生物样品表面有一些特殊的物质附着时，先用合适的酸或碱溶液腐蚀掉，然后才能清洗干净。

如覆盖于内耳壶腹嵴表面的胶质状膜，需用5%～10%的盐酸浸泡才能被清除。

(三)样品固定
1.固定方法：固定方法有物理固定和化学固定两种方法。

物理方
法包括采用高温、冰冻、干燥等手段保存细胞结构，不过这种方法易使样品结构损伤，所以只适用于一些比较坚硬的材料。

化学固定剂常用的有醛类(戊二醛，glutaraldehyde和多聚甲醛，paraformaldehyde)和四氧化锇(osmiumtetroxide，OsO4，亦称锇酸，osmicacid)，戊二醛常用浓度为2.5%，OsO4为1%。

2.固定的温度和时间：固定时的温度不宜超过4℃。

戊二醛固定一般软组织的时间是1～3小时或稍长，固定培养细胞和游离细胞为30分钟左右，四氧化锇的固定时间一般为30～60分钟。

目前多采用“戊二醛——锇酸”双重固定法，即首先用戊二醛固定1～3小时，经1/15mol/L的PBS、pH7.2～7.4充分清洗后，再用四氧化锇固定30～60分钟。

双蒸水洗3次。

(四)脱水SEM标本与透射电镜相同也用梯度酒精或丙酮脱水。

只是由于一般SEM样品块比透射EM略大，所以脱水的时间要相应延长，但也要视具体情况而定。

如样品块较小，则脱水时间可缩短至3～5分钟。

脱水剂的浓度由低到高，依次为50%、70%、80%、90%、100%(2次)。

在脱水的过程中，特别是在100%的脱水剂中脱水时，要注意防止样品暴露于空气中，以防发生干燥变形。

(五)样品干燥经过脱水以后的生物样品中所含的水份被脱水
剂替代了，但还必须使样品中的脱水剂挥发干燥而又不影响样品的原貌。

常用的干燥方法有以下几种。

1.自然干燥法(空气干燥法)：这是一种最简便而比较原始的干燥法，即将样品放在空气中自然干燥。

此法只适用于体表比较坚硬，或
具有磷片及含水分较少的生物样品。

2.真空干燥法：真空干燥是将固定和脱水的样品直接放入真空喷镀仪内，在低真空状态下，使样品内的溶液逐渐挥发，当达到高真空时样品即可干燥，接着便对样品进行金属镀膜。

但在真空干燥过程中仍存在一定的表面张力问题，因而仍难于避免某种程度人为变形的假象。

3.冷冻干燥法：是将未经处理的新鲜样品或仅作固定及脱水处理的标本，迅速投入液氮及其他骤冷剂中，使样品冷冻，尔后将样品中已结为冰的“水分”及溶剂在高真空状态下升华为气体，样品乃随之得到干燥。

由于在升华过程中，固态直接转为气态，不经过中间的液体状态，因此不存在气相与液相之间的表面张力问题，故对样品损伤较小。

不过冷冻干燥法费时长(有时达数小时或几十小时)，需要特殊的低温条件，而且也容易出现冰晶损伤。

4.临界点干燥法(criticalpointdryingmethod，CPD法)：这是目前比较理想的样品干燥法。

国内外均有定型商品仪器(临界点干燥器)出售，已被广泛推广使用。

(1)简明工作原理：当温度、压力达到一定的数值时，气体的密度可增大到与液态一样，因此气相与液相的界面消失。

液体表面张力亦会随之消失，物理学将上述情况称为临界状态，将此时的温度和压力分别称为临界温度和临界压力。

临界点干燥就是利用物质在临界状态下，液体表面张力消除的特性，克服样品干燥过程中所发生的变形，保持样品原状，达到干燥的目的。

(2)媒介液与中间液的选择：一般将临界干燥器内起临界干燥作用的液体称为“媒介液”。

媒介液的选择条件是临界温度及压力较低、易于获得、价格便宜且保存方便。

液态CO2的临界温度为31.5℃，临界压力为72.8kg/cm2，与其他媒介液相比更符合条件，因此常用液态CO2。

在上述临界点干燥之前的样品，已经脱水处理，样品内含有的乙醇或丙酮，与CO2的互溶性很差，在干燥过程中不易被CO2替换出来。

所以在干燥处理以前，必须先用一种与CO2互溶性好的中间液(亦称置换液)取代样品中的乙醇或丙酮。

目前都选用醋酸异戊酯作为中间液，只要将样品置入此液内约15～30分钟(可过夜)，即可全部替换出样品中的乙醇或丙酮。

由于醋酸异戊酯与液体CO2极易互溶，所以在随后进行的临界点干燥效果较为理想。

(3)临界点干燥操作程序：
1)样品预处理：包括取材、固定、脱水、中间液置换(醋酸异戊酯15～30分钟);
2)放入样品：将预处理样品放入不锈钢篮内，再将篮放入干燥器高压样品室内密盖;
3)注入液态CO2：开启干燥器进气阀，使CO2进入样品室，约占70%～80%空间。

关闭CO2钢瓶阀和进气阀。

4)CO2置换：将样品室的温度控制钮调至15～20℃，室内压力60～70kg/cm2，持续10～20分钟，使样品中的醋酸异戊酯被液态CO2所置换。

5)临界处理：使样品室的温度升高至35～40℃的条件下，打开放气阀门，缓缓放出气态CO2，约100～500ml/min。

当气压下降至
30kg/cm2以下时，切断加热器，待样品室温度降至室温或压力降为0以后，打开室盖，取出样品，此时的样品呈完全干燥状态。

(4)临界点干燥的注意事项：
1)放置样品以前，要对进液管道及样品室作冷却处理，以避免液体CO2过早气化而影响干燥效果。

具体作法：放好样品室盖，打开阀门，放入液体CO2，每次2～3秒，反复多次冲洗，使样品室温度降至5～10℃，随后即可放置样品。

2)为防止对样品的污染，应保证液体CO2的纯净度，并注意用乙醇或丙酮清洗管道及样品室。

3)样品篮的顶部及底部要垫好滤纸，每次装样品不宜过多，以免影响干燥效果。

4)经处理后的样品，干燥易碎，所以在放取时动作要轻，避免钳夹损伤。

5)遵守操作规程，严格控制样品室的温度、压力。

6)有条件时也可用干冰(固体CO2)代替液体CO2。

两者的方法步骤基本相同，且可省去CO2钢瓶，并具有容易控制、不易污染，有利于微小样品的干燥等优点。

5.叔丁醇干燥法(t-丁醇干燥法)：是日本学者提出的一种新干燥法。

其将脱水后的样品经梯度叔丁醇处理，最后置换于纯叔丁醇中，
当温度降至10℃左右时(放入冰箱或液氮罐口处)，叔丁醇和样品随之一起固化(叔丁醇的融点为25.5℃)，然后放入真空镀膜机钟罩内抽气，固态的叔丁醇遂逐渐升华，变成气态被抽出，样品乃完全干燥。

实验证实，其干燥效果优于临界点干燥法。

(六)样品的粘胶与安置SEM样品在干燥处理后，金属镀膜前，需用特制导电胶或其他代用品，将其粘敷在金属样品台或样品托上。

常用的导电胶有两种，一种由银粉和低电阻树脂液配制而成，另一种是将石墨粉拌以低电阻树脂液而成，两者均为粘稠的糊状物，并有商品出售。

导电胶需具有粘着力强、容易挥发固化、干后表面电阻率低、导电性能好等特点，所以它除能粘牢样品以利SEM观察的作用外，尚可增加导电性能和减少充放电效应。

在SEM样品的粘胶与安置操作过程中，应注意：①应根据样品的大小和形状采取相应的粘胶方式。

要确实贴牢，但也不能涂胶过多而掩盖所要观察的结构;②安放样品以前，确实认准样品的观察面，要保证观察面向上;③经过脱水和干燥处理后的样品脆而易碎，故在胶粘时必须动作轻柔，安放准确，防止粗暴或反复夹持样品。

④粘胶样品以后，要待导电胶干透再放入镀膜机真空室或SEM镜筒内，以防止对真空室或镜筒的污染。

(七)样品的导电处理经过干燥的生物样品导电性能很差，电阻率很高，当接受电子束照射时，极易造成电子的堆积，此时受电子束照射(轰击)的部分，样品表面形成负电荷区，可对随之而来的初极电子束产生排斥作用，并能改变样品本身的二次电子运动方向，致使在
显示荧光屏上的成像出现忽明忽暗、模糊不清等现象。

上述现象被称为充放电效应或滞电斑，俗称“打火”。

此外，生物样品的元素成分的原子序数大都较低，不仅二次电子的发射率低，而且不能耐受电子轰击，这样就难以得到反差适当的理想图像，更无法实现高倍率及高分辨的SEM观察。

为了改善上述缺点，目前常用的办法有金属镀膜法和组织导电技术(非镀膜法)两种。

1.金属镀膜法：
(1)真空镀膜法：将样品放在真空喷镀仪的真空罩内，在0.133×10-4～0.133×10-6kPa(1×10-4～1×10-6Torr)高真空状态下，使金或铂等金属在高温下蒸发，因而样品表面被喷镀上1层厚约10～25nm 的金属导电层。

真空喷镀法虽能基本达到SEM观察对生物样品的有关要求，但由于喷镀时散发的金属颗粒粗大，成膜后可掩盖样品的某些微细结构。

再者，由于喷镀发射角所限，对于一些形貌复杂的样品，常易形成“影子”和“死角”。

另外，喷镀时产生的热辐射，易对样品产生损伤。

(2)离子镀膜法(ioncoating，又称离子溅射，ionsputter)：是当前增强生物样品导电性能比较理想的技术方法。

1)离子镀膜机的工作原理。

在离子镀膜机真空罩的顶部和底部分别装有阴极和阳极，阴极内表面覆盖一层镀膜所用的金属箔片(由金、铂、金-钯或铂-钯合金制成)，又称作金属靶。

样品放在下面的阳极上，真空罩事先通入氩、氖、氮等惰性气体，亦可用新鲜空气代替。

当罩
内真空达0.133×10-1～0.133×10-2kPa(1×10-1～1×10-2Torr)时，开通1000～3000V的直流电压，此时由于电场的作用，真空罩内残留的气体分子被电离为阳离子和电子，它们则分别飞向阴极和阳极，并不断地与其他气体分子碰撞，表现为紫色的辉光放电现象。

此外，阳离子也可轰击阴极上的金属靶，使部分金属靶原子被溅射出来，这些金属原子在电场的加速作用和气体分子的撞击下，可以通过不同的方向和角度飞向阳极，并呈漫射的方式覆盖在样品的表面，结果形成1层连续而均匀的金属镀膜层。

2)离子镀膜的注意事项。

a.确实作好样品的预处理。

在离子镀膜前，必须进行严格的脱水、干燥等前处理。

若样品干燥不充分，金属离子不仅不能很好附着，反而会损伤样品，特别是能放出内含的有机气体，这些有机气体受电离而分解，会给样品带来“黑化污染”。

经过临界点干燥的样品，若其内尚残留醋酸异戊酯，则需经较长时间的抽气才能加高压。

加高压时若出现样品被白色光柱包围现象，应停掉高压继续抽气;严重者要对样品重新进行临界点干燥。

b.控制离子溅射条件。

样品要放在金属靶极的正下方，不要超过阳极板面积的80%，样品的数目虽不限，但其总面积应控制在靶极面积的三分之一内。

离子溅射速度与样品到靶极的距离成反比，距离愈大溅射的速度愈慢。

当两极间的电压与样品到靶极的距离不变时，可通过对溅射时间的控制掌握镀膜厚度。

2.组织导电技术：
(1)组织导电技术的基本概念：组织导电技术是利用金属盐类，特别是重金属盐类化合物处理样品，使之与生物组织内蛋白质、脂类和淀粉起化学结合作用，以达到样品表面离子化、增强样品导电率、防止组织变形损伤及增强样品对电子束轰击耐受力的一项技术。

这种技术成本低、操作简单，经导电处理后，样品内部和表面都导电，可进行解剖观察。

(2)常用的组织导电法：常用的组织导电法为单宁酸-锇酸法。

方法是将经过常规取材固定的样品放入2%～4%的单宁酸溶液中，换液两次，(表面扫描每次约30min，观察内部结构则需8h以上)。

每次处理后均需充分清洗，然后将样品放入1%～2%锇酸中30分钟至数小时，经常规脱水及干燥处理，送SEM观察。

(3)组织导电技术的注意事项：
1)导电液易产生沉淀，故应在临用时配制。

导电液处理后的样品，要充分洗涤，以防对组织结构和镜筒的污染。

2)经组织导电处理后的样品变硬变脆，所以如欲重点观察表面结构，应注意勿损坏观察面;若需观察内部构造，可将样品折断或切断，以获得具有参差不齐断面的结构图像。

3)经组织导电处理后的样品，其图像的反差较强，所以在SEM 观察时，应予以调节和控制，以便得到反差适当的图像。

4.单纯采用组织导电处理的样品，导电效果和二次电子发射率尚不够理想，样品的分辨率亦较差，所以现在多主张与其他镀膜法结合
使用。

二、观察组织或细胞内部结构的割断法
本法用于观察组织细胞内部断面的微细结构。

样品割断时，均包埋在一定的包埋介质中。

依据包埋剂不同，可有下述几种不同的割断方法：
(一)树脂割断法
1.环氧树脂割断法
2.苯乙烯树脂割断法
(二)有机溶剂割断法
1.酒精割断法
2.醋酸异戊酯割断法
3.70%酒精断裂法
(三)水溶性包埋剂割断法
1.二甲基亚砜(DMSO)割断法
2.甘油割断法
3.乙基甘油醇割断法
(四)其他割断法
1.冷冻切断法
2.干燥样品新观察面剖出法
3.氟里昂割断法
4.切断法及切片法
以上各种方法各有特点。

二甲基亚砜(DMSO)法操作简便，重复
率高。

现介绍如下。

DMSO冷冻割断法操作程序：
1.取材。

麻醉动物后以生理盐水灌流，采取2mm×2mm×5mm 左右的样品。

为了便于辨认割断面可将样品修切成梭形;
2.固定。

1%OsO4固定液，4℃，1h;
3.清洗。

磷酸缓冲液20min×3;
4.割断前处理：25%DMSO20min×2
50%DMSO20min×2
主要目的在于防止或减少样品在下述冷冻过程中发生冰晶损伤;
5.割断：向割断装置内注满液氮，待割断台充分冷却后，用吸管将50%的DMSO滴在割断台上，使呈直径约6～8mm的液珠，并迅速将样品放入此液珠中，待数秒后DMSO冷却固化，样品遂被包埋于DMSO冰珠中。

割断样品时首先用止血钳夹住液氮预冷后的刀片，然后将刀刃置于液珠的适当部位，再以木锤轻轻扣击刀背，使液珠内的样品断裂为二，而后再以冷却的镊子将此裂块投入50%的DMSO中(室温);约10～15min后，固化的DMSO被融化，样品遂全部暴露于液体中;
6.1/15mol/L、pH
7.2～7.4的磷酸缓冲液清洗10min×6;
7.0.1%的锇酸10min×3，为了便于工作上的安排，第3次置入锇酸后，可在4℃冰箱中停留过夜;
0.1%的稀锇酸具有浸软和溶掉细胞质内非膜性成分的作用，所以经本液处理后，可使细胞内的膜性结构得以清晰的显示出来。

故这一步称为细胞基质软化。

8.双蒸水清洗，20min×3;
9.1%OsO41h，后固定;
10.双蒸水清洗10min×6;
11.2%单宁酸30min×2，增加样品的导电性;
12.双蒸水清洗，10min×6;
13.1%OsO430min终未固定;
14.双蒸水洗，10min×3;
15.酒精梯度脱水;
16.醋酸异戊酯30min或过夜;
17.临界点干燥;
18.镀膜。

三、高分辨SEM样品制备法——ODO法
ODO法即“锇酸-二甲基亚砜-锇酸”法，是日本学者田中敬一在DMSO基础上发展起来的样品制备法。

利用此法可获得高分辨的SEM图像。

ODO法的操作程序与DMSO法基本相同，为了提高样品的分辨率，主要作了以下几点改进。

1.严格控制第一步OsO4的固定时间，否则固定时间过长样本不易软化。

2.将锇酸后固定提到细胞基质软化前，以提高对割断面的固定效果。

3.严格控制0.1%锇酸对细胞基质软化过程中的温度，并适当延长软化时间，以期尽量浸软并去除细胞内的非膜性成分和突出膜性结构，以利于高分辨观察。

具体要求是：作用温度以20℃为宜，作用时间可长达72h左右。

4.为了加强组织的导电性能，将单宁酸的作用时间增至2～24h，并将其作用温度掌握在5～15℃之间，以防在高温状态下单宁酸溶液可能出现的分解破坏。

5.为了防止药物间的相互作用，ODO法加强了试剂更换之间的样品清洗，且将整个操作过程的清洗液全部改用1/15mol/L的磷酸缓冲液(pH7.2～7.4)，清洗时间均为60min，每10min更换1次液体。

四、SEM样品的消化制样法
消化制样法主要用于显示细胞近基底面或深层细胞的表面形态。

一般系利用盐酸或消化酶，如胰蛋白酶、胶原酶等消化去除上皮细胞的基底膜及其下面的结缔组织，或去掉深层细胞表面的有关组织，以充分显示在此之前观察中无法显示的、被掩盖的细胞面。

消化制样法中以盐酸消化法较经济节约、简单易行，现简单介绍如下。

1.灌流固定：将动物以戊巴比妥钠麻醉，开胸后自左心室插管，用生理盐水和固定液灌流，自下腔静脉开口流出液体。

固定液为
2.5%戊二醛与2%福尔马林的1∶1混合液，用0.2mol/L二甲砷酸钠缓冲
液配制，pH7.2～7.4。

2.取材与前固定：灌流固定后立即取材，一般以3mm×3mm×2mm为宜。

将取下的组织块放入固定液中作前固定，所用固定液与灌流固定液相同。

固定时间为2～3小时，亦可过夜。

3.清洗样品：用生理盐水或缓冲液振荡、彻底清洗样品5～6次，每次5～120min。

4.盐酸消化：将组织块放入8NHCl内酸内消化与腐蚀，60℃，20～60min，或50℃，1～3h，或40℃，1～6h。

5.Tween20浸泡：将组织块放入缓流的自来水中洗涤30～60min 或用生理盐水清洗10次;然后放入2%～5%Tween20(生理盐水配制)内浸泡3小时，必要时可在此阶段过夜(40℃)。

6.后固定：样品经生理盐水振荡清洗20次后放入1%锇酸内1～2小时(4℃)。

7.脱水：梯度乙醇或丙酮(50%、60%、70%、80%、90%、100%)脱水，每级脱水15min，最后100%浓度重复两次。

8.干燥：用醋酸异戊酯置换样品中的脱水剂及残留水分，然后进行常规二氧化碳临界点干燥。

9.镀膜观察：将样品放于立体显微镜下确认观察面，而后用导电胶将样品贴于样品托上进行金属喷镀。