拟南芥AtERF1蛋白的原核可溶性表达及多克隆抗体的制备

拟南芥AtERF1蛋白的原核可溶性表达及多克隆抗体的制备张钰;李亚会;屠唯一;陈晨;高菊芳
【摘要】转录因子AtERF1属于ERF/AP2家族的B3亚家族,参与植物的防卫反应.根据密码子简并原理,用基因全合成的方法合成了满足大肠杆菌密码子嗜好的编码拟南芥AtERF1蛋白的碱基序列,并将其克隆到原核表达载体pET-29b.将表达载体AtERFl-pET-29b转入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG成功诱导表达了分子量约
30kD的AtERF1蛋白,该蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在.以该蛋白为抗原免疫家兔,制备出的多克隆抗体经免疫双扩散测定效价达1:16,Westem blot检测表明该抗血清与AtERF1蛋白识别良好.AtERF1抗体的制备为进一步从生化水平上研究AtERF1的功能奠定了良好基础.
【期刊名称】《上海师范大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2013(042)004
【总页数】6页(P378-383)
【关键词】原核表达;拟南芥;AtERF1蛋白;密码子优化;多克隆抗体
【作者】张钰;李亚会;屠唯一;陈晨;高菊芳
【作者单位】上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234;上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234;上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234;上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234;上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234
【正文语种】中文
【中图分类】Q786
0 引言
ERF(ethylene responsive factor)是植物所特有的一类转录因子．ERF家族成员在结构上有共同的特点:每个成员都含有一个大约由60个氨基酸组成的非常保守的DNA结合域，含有ERF结合域的转录因子在植物中广泛存在，并且参与植物的生长发育及生理生化反应的信号转导［1］．植物防卫信号传递途径方面的研究表明:针对不同的病原物的诱导防卫反应相应地受到不同的信号传递途径的调控．水杨酸(salicylic acid，SA)、乙烯(ethylene，ET)和茉莉酸(jasmonic acid，JA)在防卫信号传递途径中起着重要的作用［2］．大量证据表明:依赖于SA、ET或JA的信号传递途径之间存在着一定的交叉作用(cross—talk)．绝大部分情况下，依赖于ET 的信号传递途径与依赖于JA的信号传递途径间存在着协同促进的作用．外源ET 和JA都能够迅速诱导AtERF1表达，两者之间存在协同促进作用［3］．而且，AtERF1的超表达能够恢复ein2和ein l突变体的防卫反应能力．通过AtERF1转基因拟南芥的转录组分析和野生型拟南芥在ET和JA处理下的转录组分析，说明AtERF1在体内能够调控那些应答ET和JA的基因的表达．总的试验结果表
明:AtERF1是ET和JA信号途径中的下游成分，而且在2个防卫反应基因调控信号途径交织点处起着重要的作用．AtERF1基因的超表达，增强了拟南芥对灰霉(Botrytis cinerea)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、Erysiphe orontii的抗性［4］．但是AtERF1蛋白究竟调控哪些目的基因行使功能，目前尚不十分清楚．原核表达系统的优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉．在本研究中，利用密码子优化法人工合成了满足大肠杆菌密码子嗜好的编码AtERF1蛋白的DNA序列［5］，并以此为基础构建了原核表达载体AtERF1-pET29b，将其转入大肠杆菌BL21(DE 3)，经IPTG诱导后在原核细胞中
成功表达了AtERF1蛋白，该蛋白以可溶蛋白的形式存在．利用SDS-PAGE法纯化了AtERF1蛋白，并作为抗原免疫家兔，制备出了效价高，特异性强的多克隆抗体，这些工作为进一步用生化手段研究该转录因子的DNA结合位点和下游基因奠定了基础．
1 材料与方法
1．1 试剂和材料
1．1．1 质粒与菌株
原核表达载体pET-29b(Novagen产品)由陶黎明教授赠送，大肠杆菌感受态菌株DH5α及BL21(DE3)由上海师范大学植物功能基因实验室提供．
1．1．2 生物学试剂
T4 DNA连接酶、限制性内切酶Nde I、Xho I和Dream Tag DNA聚合酶购自Fermenant公司;硝酸纤维素膜、dNTPs、PCR产物回收试剂盒、Tris、SDS、TEMED及IPTG等常用分子生物学试剂购自北京鼎国生物技术有限公司;辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG、ECL化学发光检测试剂盒、PVDF膜购自艾比玛特生物医药(上海)有限公司;引物由Invitrogen公司合成．
1．2 方法
1．2．1 原核表达载体AtERF1-pET-29b的构建
AtERF1蛋白由268个氨基酸残基组成，根据其氨基酸序列，利用密码子优化软件设计出一条满足大肠杆菌密码子嗜好的碱基序列，并引入Nde I和Xho I两个限制性酶切位点．经优化处理的编码AtERF1基因序列由Invitrogen公司全基因合成后克隆至pMD-18T载体上，上述重组质粒AtERF1-pMD-18T用NdeI，Xho I 于37℃ 消化5 h，经琼脂糖凝胶电泳，回收的AtERF1片段与同样用NdeI，Xho I酶切的pET-29b载体进行连接，转化入感受态E．coli DH5α中，涂布于含卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上．挑取单菌落培养后抽提质粒，进行PCR和双
酶切鉴定．酶切正确的质粒转化BL21表达菌感受态，涂布于含卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上．挑取单菌落培养后进行PCR鉴定，含目的基因片段的BL21表达菌-70℃保存备用．鉴定引物为:
1．2．2 目的蛋白的诱导表达及可溶性分析
将含目的基因片段的BL21表达菌复苏培养，至OD600为0．5～1．0，取1 mL 菌液放入离心管中(未经IPTG诱导)．将含剩余菌液的试管转移至20℃ 振荡培养，当培养液温度降至20℃时，加入IPTG，至终浓度为0．5 mmol/L进行蛋白诱导，在1、2、3、4、5 h分别收集1 mL菌液．未诱导和诱导不同时间的菌液4℃高
速离心1 min，收集细菌沉淀．每管细菌沉淀加入100μL超声缓冲液(20 mmol/L Tris，pH 8．0，0．5 mmol/L NaCl)重悬，超声1～2 min破碎细胞．吸取
50μL全细胞匀浆于新的离心管，与50μL 2×SDS上样液混合后置于100℃煮沸
5min，吸取10μL样品用12% 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测目的蛋白的表达情况;剩
余的匀浆15000 r/min离心10 min，上清与沉淀分别与等量SDS上样液混合后
置于100℃煮沸5 min，吸取10μL电泳检测目的蛋白的溶解状况．PAGE胶用考马斯亮兰染色液染20 min后，再用脱色液脱色干净．
1．2．3 多克隆抗体制备及效价鉴定
抗原准备:将IPTG诱导过夜的细菌裂解液上清进行SDS-PAGE电泳，转移至硝酸
纤维素(NC)膜上．每只兔约需200μg抗原，依据标准分子量参照估计AtERF1蛋白条带的含量，转移足够数量的NC膜．将蛋白转移完毕的NC膜浸在丽春红溶液中1～2 min，显示出AtERF1蛋白条带，立即用双蒸水洗去丽春红，至清晰显示
出AtERF1蛋白条带．小心剪下AtERF1蛋白条带处NC膜，尽量避免非目的蛋白的污染．将剪下的NC膜放置在加有灭菌PBS的1．5 mL离心管中，用灭菌PBS 洗去丽春红，至无色．用眼科剪将NC膜剪成非常细小的碎片，加入0．5 mL灭
菌PBS，用组织匀浆器研磨，-70℃冻存备用．
免疫方案:取1 mL碾碎的包含抗原的NC膜对成年健康家兔进行背部多点皮下注射，10 d后用相同的碾碎的样品注射家兔．相同的实验再重复两次，每次间隔10 d．最后一次注射一周后，耳缘静脉取血测定抗体效价．效价满意后在麻醉状态下对被免疫的兔子进行颈动脉取血，血液放37℃ 温育1 h，然后放4℃ 过夜，析出的血清加叠氮钠，分装后-20℃保存．
效价测定:用免疫双扩散法测定抗体效价．用生理盐水配制1%琼脂，倒平皿凝固后打梅花型孔，在中央孔中加入100μL IPTG诱导过夜的细菌裂解液上清作为抗原，周围5孔分别加入100μL 1∶2、1∶4、1∶8、1∶16和1∶32稀释的兔抗血清．置湿盒37℃过夜，观察沉淀线出现的情况．
1．2．4 Western blot检测抗体的特异性
将表达的AtERF1蛋白进行SDS-PAGE电泳后，经电转仪转移到PVDF膜上．将膜用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭1．5 h，清洗后加入按1∶200稀释于TBST中的兔多克隆抗体，在摇床放置1 h，以TBST清洗一抗1 h，每15 min换一次清洗液．再加稀释于TBST中的HRP标记的羊抗兔IgG(1∶10000)，在摇床放置1 h，TBST清洗二抗1 h，每15min换一次清洗液．洗膜后加ECL工作液，在可见光下室温孵育膜数分钟，将印迹膜用保鲜膜包被粘贴固定于X光片曝光暗盒．然后转入暗室将X光胶片压在膜上曝光数秒，显影定影于X光胶片上．
2 结果与分析
2．1 AtERF1蛋白原核表达载体的构建
www．arabidopsis．org 网站上列出的AtERF1的蛋白的氨基酸序列，共含268个氨基酸残基．根据此序列设计出满足大肠杆菌密码子嗜好的碱基序列，并引入Nde I和Xho I两个限制性酶切位点，碱基序列长度共816bp(图1)．
图1 AtERF1蛋白编码序列的优化
经密码子优化的序列由Invitrogen公司全基因合成后克隆至 pMD-18T载体上，
将AtERF1-T载体经限制性内切酶Nde I和Xho I消化后，电泳结果表明AtERF1基因序列已成功克隆入pMD18-T(图2-A)．利用T载体上的M13通用引物进行
测序分析，结果表明该816bp的片段序列与优化的序列吻合．为了获得大量的AtERF1蛋白，采用了原核表达的载体pET-29 b进行蛋白表达实验．用限制性内
切酶Nde I和Xho I将AtERF1-T载体中的 AtERF1片段切下后，将其克隆入
pET-29 b，转化E．coli DH 5α感受态后的重组质粒，用限制性酶切鉴定可以看
到一条大约816 bp的条带(图2-B)，测序结果表明目的基因AtERF1位于正确的
读码框中，获得了原核表达质粒 AtERF1-pET29 b．将构建好的AtERF1-pET29 b 质粒和空载体pET29 b质粒转化入表达菌株E．coli BL21(DE3)感受态中，PCR
鉴定显示AtERF1-pET29 b含有目的基因片段(图2-C1)，而含空载体的菌落中不
含目的基因片段(图2-C2)．
图2 AtERF1蛋白表达载体的构建M:λ-DNA/Eco1301(Styl);A1:AtERF1-T质粒酶切产物;B1:AtERF1-pET29b质粒酶切产物;C:含原核表达载体BL21菌落PCR鉴定;C1:AtERF1基因PCR产物;C2:空质粒pET29b作负对照
2．2 AtERF1蛋白的原核表达
AtERF1蛋白的分子量约30 kD，按照材料与方法中所述步骤进行蛋白诱导表达实验，SDS-PAGE电泳结果显示，诱导4 h及5 h后，其全细胞裂解液中在35 kD～25 kD处可见清晰的AtERF1蛋白的条带(图3，箭头所指 )．
图3 AtERF1蛋白的诱导表达M:Prestained Protein Ladder;1:AtERF1-pET29b，不加 IPTG;2～6:AtERF1-pET29b加IPTG 诱导1h(2)、2h(3)、3h(4)、4h(5)和
5h(6)，表达蛋白大小约30kD
2．3 AtERF1蛋白的可溶性分析
将诱导过夜的全细胞裂解液离心后的上清液进行SDS-PAGE电泳，发现在35
kD～25 kD处可见清晰的AtERF1蛋白的条带(图4条带1)，说明表达的AtERF1
蛋白以可溶的形式存在．
图4 AtERF1蛋白的可溶性分析M:Prestained Protein Ladder;1:AtERF1-
pET29b加IPTG诱导过夜，上清;2:AtERF1-pET29b加IPTG诱导过夜，沉
淀;3:AtERF1-pET29b，不加IPTG，上清;4:AtERF1-pET29b，不加IPTG，沉淀2．4 AtERF1蛋白抗体制备和分析
将IPTG诱导过夜的细菌裂解液上清进行SDS-PAGE电泳，转移至硝酸纤维素(NC)膜上．每只兔约需200μg抗原，依据标准分子量参照估计AtERF1蛋白条带的含量，转移足够数量的NC膜．用眼科剪将NC膜剪成非常细小的碎片，加入0．5 mL灭菌PBS，用组织匀浆器研磨，-70℃冻存备用．每次取1 mL碾碎的包含抗
原的NC膜对成年健康家兔进行背部多点皮下注射，共四次．最后一次注射一周后，耳缘静脉取血用免疫双扩散法测定抗体效价．抗血清经1∶2、1∶4、1∶8、1∶16稀释后均能与AtERF1蛋白形成明显的沉淀线(图5)，表明抗体效价达到要求．对
家兔在麻醉状态下颈动脉放血，血液经37℃温育后，4℃放置过夜析出多克隆抗
血清．为了进一步分析获得的抗体对AtERF1蛋白的识别，用Western blot技术检测抗体，杂交后经HRP标记的羊抗兔抗体显色试剂盒显色，用X光胶片显影，在胶片上可在约30 kD处看到清晰的AtERF1蛋白条带，这表明多克隆抗体与AtERF1蛋白识别良好(图6)．
图5 多克隆抗体效价测定
图6 AtERF1表达蛋白的Western blot检测M:Prestained Protein
Ladder;1:AtERF1-pET29b，不加 IPTG，沉淀;2:AtERF1-pET29b，不加IPTG，
上清;3:AtERF1-pET29b加IPTG诱导过夜，沉淀;4:AtERF1-pET29b加IPTG诱导过夜，上清
3 讨论
遗传密码有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分．那些被最频繁利用的称为最佳密码子，那些不被经常利用的称为稀有或利用率低的密码子．因此重组蛋白的表达可能受密码子利用的影响，尤其是在异源表达系统［6］．本研究利用基因全合成的方法，将拟南芥AtERF1基因序列优化为满足大肠杆菌密码子嗜好的序列，并逐步构建到原核表达载体pET29b．诱导表达结果显示，构建的原核表达载体AtERF1-pET29b经IPTG诱导后，AtERF1蛋白以可溶的形式得
到了高效稳定的表达．对获得的多克隆抗血清经Western blot技术检测，结果显示制备的抗体与目的蛋白识别良好．
ERF转录因子分别与细胞发育、激素、抗病、低温及干旱、高盐等信号传递有关［7］．AtERF1基因的超表达，增强了拟南芥对灰霉(Botrytis cinerea)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、Erysiphe orontii的抗性［4］，然而对于ERF转录因子AtERF1作用位点及下游基因的研究并不清楚．染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation，Ch Ip)的方法可以用来在体内鉴定转录因子直接调控的下游基因，但是这些方法都需要特异性很高的蛋白抗体［8］．本研究制备的抗体与目的蛋白AtERF1特异性较强，可用于AtERF1作用位点及其直接调控的下游基因功能的研究，有助于生化水平上深入研究AtERF1在花药发育中的分子机理．
参考文献:
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