塞来昔布联合西妥昔单抗对人肠癌HCT-116细胞株生物学行为的影响

塞来昔布联合西妥昔单抗对人肠癌HCT-116细胞株生物学行
为的影响
林梦心;陈强;陈奕贵;陈慧菁;范芳;施纯玫
【摘要】Objective To study the synergistic effect of cyclooxygenase-2 inhibitor Celecoxib and Epidermal growth factor receptor (EGFR) monoclonal antibody Cetuximab on human colorectal cancer cell line HCT-116. Methods K-ras gene of HCT-116 cell line was detected by Sanger sequencing. Cells were divided into control group, Celecoxib group, Cetuximab group and combined group. MTT assay was applied to determine the viability of colorectal cancer cell HCT-116, the cell cycle changes were analyzed by flow cytometry ,and wound healing assay was performed to assess the effects of drugs on cell migration. Results K-ras gene was wild type at 12 codon and mutation at 13 codon in HCT-116 cell line. The celecoxib and cetuximab only inhibited proliferation of HCT-116 in a dose-dependent manner, The combination of celecoxib and cetuximab can decrease the proliferation of HCT-116 with a synergistic action; celecoxib and the combination significantly inhibited the ability of cell migration and induced Go/G1 phase arrested(P<0. 05). Conclusion The proliferation of HCT-116 cell could be inhibited by celecoxib and cetuximab only, both drugs have synergistic effects.%目的观察环氧合酶-2抑制剂塞来昔布联合表皮生长因子受体单克隆抗体西妥昔单抗对人肠癌HCT-116细胞株生物学行为的影响.方法 Sanger测序法检测肠癌HCT-116细胞株的K-ras 基因有无突变;塞来昔布、西妥昔单抗单独或联合作用于HCT-116细胞株,四甲基
偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增值抑制率,细胞划痕实验检测细胞的迁移能力,流式细
胞术检测各组细胞的周期分布.结果HCT-116细胞株K-ras基因12位点为野生型、13位点发生突变;塞来昔布及西妥昔单抗对HCT-116细胞的增殖抑制作用均呈剂
量依赖性,两药联用可明显抑制HCT-116细胞的增殖;塞来昔布组和联合用药组均
能明显抑制HCT-116细胞的迁移能力,而西妥昔单抗对细胞的迁移能力无明显抑制作用;塞来昔布组及联合用药组使细胞发生明显的G0/G1期阻滞(P<0.05).结论塞
来昔布与西妥昔单抗单药可抑制肠癌HCT-116细胞的生长,两者联用具有协同作用.【期刊名称】《福建医科大学学报》
【年(卷),期】2012(046)006
【总页数】7页(P385-391)
【关键词】西妥昔单抗;塞来昔布;药物疗法,联合;HCT-116细胞株;表皮生长因子受体;环氧合酶-2
【作者】林梦心;陈强;陈奕贵;陈慧菁;范芳;施纯玫
【作者单位】福建医科大学,协和临床医学院,福州,350001;福建医科大学,附属协和医院,肿瘤内科,福州,350001;福建省肿瘤转化医学重点实验室,福州,350001;福建医科大学,教学医院,福建省肿瘤医院,肿瘤内科,福州,350014;福建医科大学,教学医院,
福建省肿瘤医院,内科研究室,福州,350014;福建医科大学,教学医院,福建省肿瘤医院,药理研究室,福州,350014;福建省肿瘤转化医学重点实验室,福州,350001;福建医科
大学,教学医院,福建省肿瘤医院,肿瘤内科,福州,350014
【正文语种】中文
【中图分类】R453;R735.3;R329.25;R916.4
随着肿瘤分子生物学的发展，结直肠癌的药物治疗进入分子靶向治疗时代。

西妥昔单抗（Cetuximab，Cet）是重组人鼠嵌合的IgG1单克隆抗体，可与表皮生长因
子受体（Epidermal growth factor receptor，EGFR）胞外区特异性结合，阻止
生长因子与其受体结合，使受体失活，阻断下游的信号转导通路，从而影响与肿瘤生长和转移相关的细胞功能，包括细胞增值、存活、DNA复制、肿瘤血管生长、以及细胞的迁移和侵袭等。

但由于肿瘤的发生发展是一个多因素、多环节、多基因靶点的调控过程，Cet单药治疗进展期结直肠癌的有效率仅在10%左右，仍难以
满足临床需要，因此靶向药物的联合治疗研究开始得到人们的重视，特别对于一种靶向药物治疗相对不敏感的肿瘤，联合治疗可能是提高疗效的重要手段［1－2］。

EGFR 和环氧合酶－2（cyclooxygenases，COX－2）信号途径均参与了结直肠
癌的发生与发展，而二者在各自信号通路之间存在着交叉对话，COX－2基因表达的增强与EGFR信号通路的激活相互促进［3－6］。

因此，笔者推测将 COX－2
抑制剂塞来昔布（Celecoxib，Cel）联合EGFR抑制剂Cet作用于人结肠癌HCT
－116细胞株，有可能增强Cet的作用效果。

1 材料和方法
1.1 细胞及主要试剂人肠癌细胞株 HCT－116（中国科学研究院）；McCoy’s
5AMedium 培养基、胎牛血清（美国Gibco公司）；西妥昔单抗（cetuximab，5mg／mL，进口药品注册证号：S2*******，德国默克公司）；塞来昔布（Celecoxib）、MTT和二甲基亚砜（美国Sigma公司）；Labsystems MutisKan Ascent全自动酶标测试仪（MK3型，芬兰Labsystems公司）；流式细胞仪（EPICS XL－4型，美国Beckman Coulter公司）。

1.2 方法
1.2.1 基因检测（Sanger测序）从人肠癌 HCT－116细胞中提取DNA，PCR扩
增，产物纯化，基因测序，明确其K－ras基因12及13位点密码子的突变情况。

1.2.2 细胞培养 HCT－116细胞系培养于含10%胎牛血清、100U／mL链霉素、100U／mL青霉素的McCoy’s 5AMedium培养基中，置37℃、体积分数为
0.05的CO2饱和湿度细胞培养箱，细胞贴壁80%时以0.25%胰酶消化、计数及
传代，1周传2～3次。

实验用细胞为接种24h后的对数生长期细胞。

1.2.3 细胞的生长抑制率采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法。

实验分为对照组、Cet 单药组、Cel单药组、Cet联合Cel组。

1.2.3.1 Cet及Cel的适宜浓度取对数生长期的 HCT－116细胞株按4×104 mL－1接种于96孔板，培养24h后（细胞贴壁后）加药。

药物浓度为：Cet（浓度依
次为10，40，80nmol／L）组、Cel（浓度依次为12.5，25，37.5，50，75，100μmol／L）组、Cet（浓度依次为10，20，30，40，60，80nmol／L）＋
Cel（浓度依次为12.5，25，37.5，50，75，100μmol／L）组。

另设不加药物
的阴性对照组及无种植细胞空白对照组。

每组设4个复孔，终体积为100μL，分
别培养24，48，72h进行MTT检测。

在酶标仪570nm处测吸光度OD值，取4个孔OD值均数计算细胞增殖抑制率：
1.2.3.2 Cet与Cel联合应用有无协同作用根据“1.2.3.1”检测结果，选择Cet与Cel联用的最高（Cet 80nmol／L和 Cel 100μmol／L）、最低（Cet 10 nmol／L＋Cel 12.5μmol／L）及中间（Cet 40nmol／L和Cel 50μmol／L）3个浓度。

用药方案：同时予以Cet联合Cel共同作用48h，联合用药组1（Cet 10 nmol／L＋Cel 12.5μmol／L）、联合用药组2（Cet 40 nmol／L＋Cel 50μmol／L）、
联合用药组3（Cet 80 nmol／L＋Cel 100μmol／L）。

测定各组药物对细胞增值的抑制率，并计算两药相互作用指数（Coefficient of drug interaction，CDI），用于评价两药联合作用强弱，CDI按下列公式计算：
当CDI＜1时，表明两药存在协同作用，CDI值越小则协同作用越大。

选择适宜的联合给药方案进行后续实验。

1.2.4 Cet及Cel对 HCT－116细胞迁移的影响采用细胞划痕实验。

先用marker 笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀地划横线，大约每隔1cm一道，横穿过孔。

每孔至少穿过5条线。

设对照组、Cet组、Cel组、Cet＋Cel组（每组3孔），分别在孔中加入对数生长期的细胞约5×105个细胞，加入血清培养基培养。

当细胞汇合度＞80%时，用10μL枪头垂直于背后的横线划一伤痕。

用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。

放入37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱培养。

按0，24h取样，拍照。

1.2.5 细胞周期阻滞试验将对照组、Cet（40 nmol／L）组、Cel（50μmol／L）组、Cet＋Cel（Cet 40 nmol／L＋Cel 50μmol／L）组的 HCT－116细胞株，PBS漂洗3次，制成1×106 mL－1的单细胞悬液，加入1mL 70%预冷乙醇，吹打均匀，4℃固定12h。

PBS洗涤去乙醇，1 200r／min离心2次，每次5 min。

用 0.5mL PBS 重悬细胞，加入 PI和RNaseA至终浓度为50μg／mL，37℃温浴30min，用FCM测定细胞周期。

1.3 统计学分析数据以±s表示，采用SPSS 17.0软件进行统计学处理。

各组的组间均数比较用单因素的方差分析，两两比较采用t检验，P＜0.05为差别有统计学意义。

2 结果
2.1 基因检测（Sanger测序） HCT－116细胞株K－ras基因的12位点是野生型（G／G）、13位点发生突变（G／A）（图1～2）。

2.2 各单药组及联合用药组对HCT－116细胞的生长抑制作用
2.2.1 Cel对 HCT－116细胞株的生长抑制 Cel可抑制体外培养的HCT－116细胞
的增殖。

除Cel 25，12.5μmol／L作用48h抑制率无明显差异外（P＝0.658），在同一时间点抑制作用随着Cel浓度的升高而明显增强（P＜0.05）；但在同一浓度的Cel作用下，抑制作用并没有随着干预时间的延长而增强（图3）。

图1 K－ras野生型标准检测图谱Fig1 K－ras wild type standard detection map
图2 HCT－116细胞株K－ras基因检测图谱Fig2 HCT－116cell line K－ras gene detection map
图3 不同浓度的Cel作用不同时间对HCT－116细胞株的生长抑制率Fig3 Effect of different concentrations of Cel on inhibition of HCT－116cell growth rateCel：塞来昔布.与 control组比较，☆：P＜0.01，☆☆：P＜0.001.
2.2.2 Cet对 HCT－116细胞株的生长抑制 Cet可抑制体外培养的HCT－116细
胞的增殖。

除Cet 80，40nmol／L作用48h抑制率无明显差异外（P＝0.077），在同一时间点抑制作用随着Cet浓度的升高而明显增强（P＜0.05）；但在同一浓度的Cet作用下，抑制作用并没有随着干预时间的延长而增强（图4）。

2.2.3 Cet与Cel联合作用对 HCT－116细胞株的生长抑制不同浓度的联合用药均抑制肠癌HCT－116细胞的生长。

在同一时间点，抑制作用随着联合用药浓度的
升高而明显增强（P＜0.05）；但在同一浓度的药物作用下，抑制作用并没有随着干预时间的延长而增强（图5）。

2.2.4 Cet与Cel联合对 HCT－116细胞株生长抑制的协同作用将Cet与Cel以3种不同浓度联合，观察其对HCT－116细胞生长的影响（表1）。

联合用药组1（Cet 10nmol／L＋Cel 12.5μmol／L）与单药组比较有协同作用（CDI＝
0.945），但作用很弱；联合用药组2（Cet 40nmol／L＋Cel 50μmol／L）与单
药组比较有协同作用（CDI＝0.967），作用亦很弱；联合用药组3（Cet 80nmol ／L＋Cel 100μmo l／L）与单药组比较无协同作用（CDI＝1.059）。

后续实验选
择具有协同作用的联合用药组2的给药方式进行。

图4 不同浓度的西妥昔单抗作用不同时间对HCT－116细胞株的生长抑制率Fig4 Effect of different concentrations of Cet on inhibition of HCT－116cell growth rate与control组比较，☆：P＜0.05，☆☆：P＜0.01.
图5 不同浓度的Cet与Cel对HCT－116细胞株的生长抑制率Fig5 Effect of different concentrations of Cel and Cet on inhibition of HCT－116cell growth rateCel：塞来昔布；Cet：西妥昔单抗.与control组比较，P＜0.001. 2.3 各单药及联合用药对HCT－116细胞迁移的影响单用Cel组及两药联用组对细胞的迁移抑制明显，但二者并无明显差异，而Cet组对细胞的迁移抑制不明显（图6）。

表1 不同浓度的西妥昔单抗与塞来昔布联合对HCT－116细胞株生长的影响Tab1 Synergistic effect of Cel and Cet on cell line HCT－116Cet：西妥昔单抗；Cel：塞来昔布；联合用药组1：Cet 10nmol／L＋Cel 12.5μmol／L；联合用药组2：Cet 40nmol／L＋Cel 50μmol／L；联合用药组3：Cet 80nmol／L＋Cel 100μmol／L.分组 A值抑制率／3 0.06±0.004 70.73±0.45 1.059
0.21±0.009 －－Cet 10nmol／L 0.20±0.007 5.53±0.49 －Cet 40nmol／L 0.19±0.005 10.29±1.24 －Cet 80nmol／L 0.17±0.002 12.22±0.27 －Cel 12.5μmol／L 0.20±0.005 10.51±1.17 －Cel 50μmol／L 0.16±0.002
28.07±1.76 －Cel 100μmol／L 0.07±0.002 68.39±1.15 －联合用药组1
0.18±0.003 16.93±1.49 0.945联合用药组2 0.14±0.006 36.70±0.92 0.967联合用药组% CDI对照组
2.4 各单药及联合用药对细胞周期的影响流式细胞仪检测细胞周期结果见图7。

结果显示，药物作用24h后，Cet组与对照组比较细胞周期分布差异无统计学意义（P＞0.05），Cel组及联合用药组主要将细胞阻滞于G0／G1期（P＜0.05），
Cel组与联合用药组比较细胞周期分布无统计学差异（P＞0.05），提示Cet不影
响Cel对细胞的阻滞作用（图8）。

3 讨论
结直肠癌的发生发展是多因素、多基因共同作用的结果。

因此，随着与肠癌发生、发展、侵袭、转移有关机制的阐明、信号转导通路关键分子的发现，特异性分子靶向药物相继产生。

肿瘤分子靶向治疗虽然以肿瘤组织或肿瘤细胞的特异性分子做为靶点，但单药治疗往往出现原发或继发耐药问题，大部分单一位点的靶向药物的有效率基本都在10%左右，疗效不尽满意［7－11］，而且其治疗往往需要较大剂量，仍有一定毒性，因此联合靶向治疗是目前研究的热点。

图6 HCT－116细胞划痕实验Fig6 Wound healing assay of HCT－116cell上排：培养0h；下排：培养24h.A：对照组；B：西妥昔单抗40nmol／L；C：塞
来昔布50 μmol／L；D：西妥昔单抗40nmol／L＋塞来昔布50μmol／L.
塞来昔布是一种高选择性COX－2抑制剂，近10年来的研究表明塞来昔布对上皮组织肿瘤（包括头颈部肿瘤、肺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、结直肠癌、前列腺癌、皮肤的鳞状上皮细胞癌等）都有一定的抑制作用，其抗肿瘤的机制主要有：（1）抑制细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡。

塞来昔布可抑制人乳腺癌细胞 MDA－MB－231增殖，使细胞周期阻滞于G0／G1期［12］；亦可通过启动胃癌细胞 Fas／FasL 途径的凋亡信号传导通路，进而诱导其凋亡［13］。

（2）通过多种途径抑
制肿瘤细胞的迁移和黏附及新生血管形成。

塞来昔布可以通过抑制 MMP－2和MMP－9的分泌，减少细胞外基质的降解而抑制癌细胞的侵袭能力［14］；通过抑制COX－2的活性，从而减少PGE2、TXA2等PGs的生成，并阻断VEGF、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）等的释放，进而抑制肿瘤新生血管形成［15］；还能够抑制大鼠肝细胞瘤细胞早期生长反应因
子Egr－1的活性从而抑制肿瘤血管生成和转移［16］。

图7 流式细胞术得到的细胞周期图Fig7 Cell cycle detected by flow cytometryA：对照组；B：西妥昔单抗组（40nmol／L）；C：塞来昔布组
（50μmol／L）；D：联合用药组（西妥昔单抗40nmol／L＋塞来昔布50μmol
／L）.
图8 不同处理组对HCT－116细胞周期分布的影响Fig8 Changes of cell cycle distribution after treatment of drugs西妥昔单抗组：40nmol／L；塞来昔布组：50μmol／L；联合用药组：西妥昔单抗40nmol／L＋塞来昔布50μm ol／L.与对
照组比较，☆：P＞0.05，☆☆：P＜0.05.
有学者发现，结直肠癌肿瘤组织中PGE2浓度明显高于周围的正常黏膜［17］，
而近期研究证实COX－2高表达是结直肠癌细胞PGE2水平升高的主要原因［18］。

2005年，Hawk等发现塞来昔布等选择性COX－2抑制剂可明显减少结直肠癌的发生［19］。

这一观点目前已得到广泛认可。

此后Wang等通过体外构
建小鼠结肠癌模型并以不同剂量的塞来昔布进行干预，结果显示塞来昔布可抑制COX信号途径诱导结肠肿瘤细胞凋亡从而抑制结肠肿瘤生长［20］。

因此，将COX－2作为结直肠癌治疗的一个新靶点显示出良好的前景。

本实验采用MTT法观察不同浓度塞来昔布对HCT－116细胞体外增殖的抑制作用，显示不同剂量塞
来昔布单药作用均抑制肠癌HCT－116细胞的生长，且随着药物浓度的升高，其
抑制作用明显增强；同时塞来昔布还可明显抑制肠癌细胞的迁移能力，并将细胞阻滞于G0／G1期，提示塞来昔布具有显著的体外抗肿瘤活性。

西妥昔单抗是最早应用的抗EGFR的单克隆抗体靶向治疗药物。

有大量文献表明，K－ras基因突变预示着对于西妥昔单抗的治疗无效［21－22］。

然而大约40%的结直肠癌伴有编码K－ras基因的区域第2外显子的12和13密码子突变［23］。

但De Roock等对579例K－ras基因突变的结肠癌患者应用西妥昔单抗治疗的情况进行分析发现，K－ras基因13密码子突变的患者西妥昔单抗治疗后生存期明显
长于其他位点突变的患者，提示KRAS基因13密码子突变者或许仍然可以从抗EGFR治疗中获益［24］。

本实验选取K－ras基因13位点突变的人肠癌HCT－116细胞株为实验对象，应用 MTT法、划痕试验及流式细胞术观察西妥昔单抗对HCT－116细胞生物学行为的影响发现，西妥昔单抗对K－ras基因13位点突变的HCT－116细胞的增殖也具有一定的抑制作用，并随着浓度的升高抑制作用增强，但各浓度组的细胞抑制率并不高，而对细胞迁移能力及细胞周期的分布没有明显影响。

有研究发现，抗EGFR药物与COX－2抑制剂联合使用有协同作用。

Torrance等研究发现，EGFR酪氨酸蛋白激酶抑制剂联合COX－2抑制剂能够有效抑制家族性结肠息肉生长［25］。

此后有多项研究均证实该联合靶向治疗方案对多种肿瘤效果均强于单一靶点的靶向治疗方案［26－29］。

王亚丽等应用EGFR抑制剂吉非替尼联合COX－2抑制剂塞来昔布可显著抑制肺癌A549细胞的生长、促进其凋亡［30］。

Zhang等在裸鼠头颈部肿瘤模型实验实验中发现，吉非替尼联合塞来昔布通过抑制转录因子活化，从而显著抑制肿瘤增长［31］。

笔者认为，COX－2抑制剂塞来昔布与EGFR抑制剂西妥昔单抗联合应用能增强对K－Ras基因第13位点突变的结肠癌细胞株HCT－116恶性生物学行为的抑制作用，可进一步进行体内试验研究。

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