食源性致病菌检验标准操作程序

食源性致病菌检验标准操作程序
福建省疾病预防控制中心
二〇一二年十一月
一、生物样本检验标准操作程序
（一）粪便样本的保存、运送和检测
表1 粪便样本的保存、运送和检测培养条件
培养基目标病原体温度
细菌标本保
存和运送
1. Cary－Blair 所有食源性致病菌室温
增菌液 1. 改良磷酸盐缓冲液小肠结肠炎耶尔森氏菌 4 ℃
2. mEC增菌肉汤EHEC O157:H7/STEC 37 ℃
3. Preston肉汤弯曲菌微需氧42 ℃
4. SBG增菌液沙门氏菌37 ℃
5. 3%氯化钠碱性蛋白胨水弧菌37 ℃
选择性分离平板1. Mac平板EPEC、STEC、ETEC、EIEC、
EAEC、志贺氏菌
37 ℃
2. XLD平板志贺氏菌37 ℃
3. mCCD平板弯曲菌微需氧42 ℃
4. 耶尔森氏菌选择性平板小肠结肠炎耶尔森氏菌25 ℃
5. 科玛嘉O157:H7显色平板EHEC O157:H7 37 ℃
6. 科玛嘉沙门氏菌显色平板沙门氏菌37 ℃
7. 科玛嘉弧菌显色平板
TCBS平板
弧菌37 ℃
病毒标本 1. 采便盒轮状病毒、诺如病毒、札如
病毒、星状病毒、腺病毒
-20 ℃以下
（二）检验方法与流程
3
（三）沙门氏菌和志贺氏菌检测操作程序
1 范围
本程序规定了粪便标本中沙门氏菌（Salmonella）和志贺氏菌（Shigella）的检验方法。

2 检验程序
沙门氏菌和志贺氏菌检验程序见图1。

图1 沙门氏菌和志贺氏菌检验程序
3 操作步骤
3.1 标本收集
标本包括新鲜的或转移至Cary-Blair运送培养基的粪便或肛拭子。

最优标本是转移至Cary-Blair运送培养基的粪便拭子。

肛拭子不是最佳标本，仅在病人无粪便标本时采用。

肛拭子收集后应当目测，需要在拭子上明显见到粪便。

所采集的标本尽快检验，放入Cary-Blair运送培养基中的标本应在冷藏条件下24 h内送检。

新鲜的粪便标本置于清洁、干燥、无肥皂或消毒液残留的容器中，冷藏条件下8 h 内送检。

3.2 分离培养
3.2.1 直接分离培养
新鲜粪便：无菌拭子采集少量粪便，尽量从可见血或黏液的部位收集；新鲜拭子在XLD 和MAC一区划线；以1 µL无菌接种环或接种针划线分离。

在标本中再插入一个清洁的无菌拭子，将拭子放入SBG增菌液。

轻拧管盖。

注意：拭子表面有一层标本即可，不可将过量的标本放入SBG增菌液。

肛拭子：操作程序同新鲜粪便。

转移至Cary-Blair运送培养基的粪便拭子：轻搅混合标本；拭子在XLD和MAC一区划线；以1 µL无菌接种环或接种针划线分离；在标本中再插入一个清洁的无菌拭子，将拭子放入SBG增菌液。

轻拧管盖。

注意：拭子表面有一层标本即可，不可将过量的标本放入SBG增菌液。

平板36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。

3.2.2 增菌培养
增菌液于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h，采用上述方法于科玛嘉沙门氏菌显色平板上划线分离，36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。

3.3 菌落特征
3.3.1 选择性平板上可疑菌落的特征见表1。

表1沙门氏菌属和志贺氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征
选择性琼脂平板
沙门氏菌
（大多数）
伤寒沙门氏菌志贺氏菌属
MAC琼脂菌落光滑、无色，直
径2 mm～3 mm XLD琼脂菌落呈红色，直径2
mm～4 mm
科玛嘉显
色培养基
紫色或酒红色紫色或酒红色
3.4 纯培养
挑取3个或以上可疑菌落，划线接种5%羊血琼脂平板，36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。

3.5 初步鉴定
可疑菌落接种TSI琼脂，赖氨酸脱羧酶培养基、动力-靛基质-鸟氨酸琼脂（MIO）、西
蒙氏柠檬酸盐琼脂和尿素琼脂。

沙门氏菌属和志贺氏菌属生化反应初步鉴别见表2。

表2沙门氏菌属和志贺氏菌属生化反应初步鉴别表
3.6 血清学鉴定
挑取5%羊血琼脂平板上的菌落，进行沙门氏菌和志贺氏菌的血清学鉴定，设盐水对照。

3.7 确定鉴定
刮取5%羊血琼脂平板上的单个菌落，进行系统生化鉴定。

4 结果与报告
报告粪便标本中检出沙门氏菌或志贺氏菌。

5 菌株的保存和上送
培养物穿刺接种半固体培养基，轻拧管盖，36 ℃±1 ℃培养24 h，盖紧管盖。

如果需要长期保存菌株，将0.7 mL 脑心浸液肉汤6 h～12 h培养物和0.3 mL 灭菌甘油加入灭菌菌种管，立即放置－70 °C保存。

按照方案要求定期上送。

（四）致泻大肠埃希氏菌检测操作程序
1 范围
本程序规定了粪便标本中致泻大肠埃希氏菌（Diarrheagenic Escherichia coli）的检验方法。

2 操作步骤
2.1 标本收集
标本包括新鲜的或转移至Cary-Blair运送培养基的粪便或肛拭子。

最优标本是转移至Cary-Blair运送培养基的粪便拭子。

肛拭子不是最佳标本，仅在病人无粪便标本时采用。

肛拭子收集后应当目测，需要在拭子上明显见到粪便。

所采集的标本尽快检验，放入Cary-Blair运送培养基中的标本应在冷藏条件下24 h内送检。

新鲜的粪便标本置于清洁、干燥、无肥皂或消毒液残留的容器中，冷藏条件下8 h 内送检。

2.2 直接分离培养
新鲜粪便：无菌拭子采集少量粪便，尽量从可见血或黏液的部位收集；新鲜拭子在MAC 一区划线；以1 µL无菌接种环或接种针划线分离。

肛拭子：操作程序同新鲜粪便。

转移至Cary-Blair运送培养基的粪便拭子：轻搅混合标本；拭子在MAC一区划线；以1 µL无菌接种环或接种针划线分离。

平板36 ℃ 1 ℃培养18 h～24 h。

2.3 菌落特征
挑取5个可疑大肠埃希氏菌菌落（粉红色、突起、光滑、湿润）直接保存半固体菌种管；采用PCR检测特异毒力基因方法鉴别5种致泻大肠埃希氏菌。

3 多重PCR鉴定
3.1 标准菌株
标准菌株一览表见表3。

表3标准菌株一览表
菌株名称标准号来源
EPEC CMCC 44155 中国食品药品检定研究院
STEC 具有stx1、stx2毒力基因中国疾病预防控制中心传染病所ETEC CMCC 44815 中国食品药品检定研究院
EIEC CMCC 44825 中国食品药品检定研究院
EAEC 042血清型中国疾病预防控制中心传染病所大肠埃希氏菌ATCC 25922 WHO
3.2 引物合成
多重PCR引物序列见表4。

表4五种致泻大肠埃希氏菌目的基因引物序列
目标菌目标基因引物序列片段大小（bp）
EPEC、STEC escV–F 5′-ATT CTG GCT CTC TTC TTC TTT ATG GCT G-3′544 escV–R 5′-CGT CCC CTT TTA CAA ACT TCA TCG C-3′
EPEC bfpB–F 5′-GAC ACC TCA TTG CTG AAG TCG-3′910 bfpB–R 5′-CCA GAA CAC CTC CGT TAT GC-3′
STEC stx1A–F 5′-CGA TGT TAC GGT TTG TTA CTG TGA CAG C-3′244 stx1A–R 5′-AAT GCC ACG CTT CCC AGA ATT G-3′
stx2A–F 5′-GTT TTG ACC ATC TTC GTC TGA TTA TTG AG-3′324
stx2A–R 5′-AGC GTA AGG CTT CTG CTG TGA C-3′
ETEC Elt–F 5′-GAA CAG GAG GTT TCT GCG TTA GGT G-3′655 Elt–R 5′-CTT TCA ATG GCT TTT TTT TGG GAG TC-3′
estIa–F 5′-CCT CTT TTA GYC AGA CAR CTG AAT CAS TTG-3′157
estIa–R 5′-CAG GCA GGA TTA CAA CAA AGT TCA CAG-3′
estIb–F 5′-TGT CTT TTT CAC CTT TCG CTC-3′171
estIb–R 5′-CGG TAC AAG CAG GAT TAC AAC AC-3′
EIEC invE–F 5′-CGA TCA AGA ATC CCT AAC AGA AGA ATC AC-3′766 invE–R 5′-CGA TAG ATG GCG AGA AAT TAT ATC CCG-3′
EAEC astA–F 5′-TGC CAT CAA CAC AGT ATA TCC G-3′102 astA–R 5′-ACG GCT TTG TAG TCC TTC CAT-3′
aggR–F 5′-ACG CAG AGT TGC CTG ATA AAG-3′400
aggR–R 5′-AAT ACA GAA TCG TCA GCA TCA GC-3′
Pic–F 5′-AAA TGT CAG TGA ACC GAC GAT TGG-3′1111
Pic–R 5′-AGC CGT TTC CGC AGA AGC C-3′
通用uidA–F 5′-AAA GTG TGG GTC AAT AAT CAG GAA GTG-3′1487 uidA–R 5′-ATG CCA GTC CAG CGT TTT TGC-3′
3.3 标本处理
刮取营养平板上的过夜新鲜培养物1环～2环，至装有 1 mL0.85%灭菌生理盐水的Eppendorf管内，混匀。

4 ℃～8 ℃，12 000 r/min离心15 min，弃去上清。

沉淀加入100 µL
灭菌去离子水中，混匀。

100 ℃煮沸12 min，12 000 r/min离心5 min，上清即为PCR扩增
模板，可直接用于PCR反应。

3.4 多重PCR
五种致泻大肠埃希氏菌目的基因多重PCR扩增加样体系见表5。

PCR反应条件：预变
性94 ℃ 5 min。

变性94 ℃30 s，复性63 ℃30 s，延伸72 ℃ 1.5 min，30个循环。

最
后72 ℃延伸5 min。

表5五种致泻大肠埃希氏菌目的基因多重PCR扩增加样体系
试剂加样体积（µL）
dH2O 8.3
10×PCR Buffer 2.5
25 mM MgCl2 2.5
2.5 mM dNTPs
3.0
25 µM escV–F 0.4
25 µM escV–R 0.4
25 µM bfpB–F 0.1
25 µM bfpB–R 0.1
25 µM stx1A–F 0.2
25 µM stx1A–R 0.2
25 µM stx2A–F 0.4
25 µM stx2A–R 0.4
25 µM elt–F 0.1
25 µM elt–R 0.1
25 µM estIa–F 0.4
25 µM estIa–R 0.4
25 µM estIb–F 0.2
25 µM estIb–R 0.2
25 µM invE–F 0.2
25 µM invE–R 0.2
25 µM astA–F 0.4
25 µM astA–R 0.4
25 µM aggR–F 0.2
25 µM aggR–R 0.2
25 µM pic–F 0.2
25 µM pic–R 0.2
25 µM uidA–F 0.2
25 µM uidA–R 0.2
3 U/µL Taq酶0.7
DNA模板 2.0
3.5 检测结果的判定
取5 µL PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶上电泳。

根据特异性核酸条带大小和数目判断致泻大肠埃希氏菌的种类。

见图2。

图2 种致泻大肠埃希氏菌目的基因多重PCR扩增片段
注：图中标示EPEC、EHEC（STEC）、ETEC、EIEC、EAEC的泳道为反应体系中仅存在相应的一种模板和12对引物同时扩增后出现的片段，而MIX泳道为将五种致泻大肠埃希氏菌混合后与12对引物同时扩增后出现的片段。

4 血清学鉴定
4.1 挑取PCR扩增阳性菌种，营养平板分离，36 ℃±1 ℃培养过夜。

4.2 根据PCR鉴定结果，用相应致病大肠血清O多价、单价、K、H诊断血清进行血清玻片凝集试验进行诊断。

见表6。

表6常见致泻大肠埃希氏菌的O血清群及血清型
婴幼儿腹泻成人和儿童腹泻
EPEC ETEC EIEC STEC EAEC
O20O26O44O6:K15:H16O8:K40:H9O28ac O157:H7O9:K99
O55O86O111O8:K25:H9O8:H47:H-O112O26:K62:H11O101:K99 O114 O119O125O11:H27O15:H11O124O111
O126 O127 O128O20:H-O25:K7:H42O136O103
O142O158O25:K98:H-O27:H7O143O145
O27:H20O63:H12O144O104
O73:H45O78:H11O152
O78:H12O85:H7O164
O114:H21O115:[H51]1）
O127:H12O128:H7
O128:H21O139:H28
O148:H28O149:H4
O159:H4O159:H20
O159:H34O166:H27
O169:H-
注：1：无动力的变异
4.3 报告血清学实验结果。

5 生化鉴定
5.1 对PCR阳性、血清学可分型及不可分型菌株进行系统生化鉴定。

5.2 报告最终鉴定结果。

6 菌株保存和上送
4 ℃或室温保存的半固体培养基保菌菌种至少2套（穿刺接种后36 ℃培养过夜即可）或30%甘油肉汤冻存管-70 ℃保存菌株至少2套。

按照要求定期上送。

（五）大肠埃希氏菌O157:H7检测操作程序
1 范围
本程序规定了粪便标本中大肠埃希氏菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7）的检验方法。

2 检验程序
大肠埃希氏菌O157:H7检验程序见图3。

图3 大肠埃希氏菌O157:H7检验程序
3 操作步骤
3.1 标本收集
标本包括新鲜的或转移至Cary-Blair运送培养基的粪便或肛拭子。

最优标本是转移至Cary-Blair运送培养基的粪便拭子。

肛拭子不是最佳标本，仅在病人无粪便标本时采用。

肛拭子收集后应当目测，需要在拭子上明显见到粪便。

所采集的标本尽快检验，放入Cary-Blair运送培养基中的标本应在冷藏条件下24 h内送检。

新鲜的粪便标本置于清洁、干燥、无肥皂或消毒液残留的容器中，冷藏条件下8 h
内送检。

3.2 增菌培养
增菌液采用添加20 mg/L新生霉素的改良EC肉汤（ｍEC）。

将采集的一支便拭子1:10接种于6 mL mEC肉汤，36 ℃±1 ℃恒温摇床增菌培养6 h（如无摇床，36 ℃±1 ℃恒温增菌培养9 h～12 h）。

3.3 大肠埃希氏菌O157:H7胶体金试纸快速筛查
3.3.1 将胶体金试纸从袋中取出，平放于洁净、干燥的工作台上，编号；
3.3.2 用加样器吸取样品增菌液150 µL，加入检测卡一端的加样孔；
3.3.3 2 min～20 min内读取结果。

阴性样品在视窗上部出现一条单一的红色对照线，这表明试剂已正确流动且检测过程已发生。

阳性样品将显示两条红色带，这表明检出O157抗原。

如果红色条带出现，实验失败，应考虑重做。

3.4 免疫磁珠集菌
将O157胶体金试纸呈阳性的mEC增菌肉汤，进行免疫磁珠集菌。

3.4.1 取下磁铁板，将编好号的1.5 mL的Eppendorf离心管，置入Dynal MPC-M架上。

3.4.2 轻柔混匀抗O157免疫磁珠（反复颠倒，直到管底沉淀完全消失），吸取抗O157
免疫磁珠，置入每只编号的Eppendorf离心管中20 µL。

3.4.3 取胶体金试纸阳性增菌培养物1 mL，加入上述对应的Eppendorf离心管中。

盖紧盖子。

轻轻颠倒混匀。

3.4.4 置于Dynal MX3旋转培养器上，室温下，旋转30 min（如果没有旋转器，可人工旋转）。

3.4.5 将磁铁板插入Dynal MPC-M管架中，反复颠倒数次，将抗O157免疫磁珠吸附沉淀在Eppendorf离心管壁上。

吸去上清（包括残留在管盖上的液体），并弃掉。

3.4.6 将磁铁板从Dynal MPC-M架抽出。

每只Eppendorf离心管中加入1 mL PBS-Tween20（PH7.4），轻轻颠倒混匀，重新悬浮免疫磁珠。

3.4.7 重复3.4.5～3.4.6步骤
3.4.8 重复3.4.5步骤。

3.4.9 用50 µL PBS-Tween20 重新悬浮免疫磁珠细菌混合物。

3.5 接种选择性平板
将50 µL免疫磁珠细菌混合物用接种环划线或L棒涂布分别接种于O157:H7科玛嘉显色平板或山梨醇麦康凯平板（SMAC）各一块，36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h；
在SMAC平板上O157:H7菌落应为扁平、透明或半透明、表面光滑湿润、不发酵山梨醇乳白色菌落，极少部分迟缓发酵山梨醇，呈红色。

边缘光滑，直径约2 mm。

在O157：H7科玛嘉显色培养基上呈淡紫色或紫红色菌落。

3.6 初步鉴定
对疑似菌落染色为革兰阴性杆菌者，在上述平板挑取疑似菌落10～20个，转种克氏双糖（KIA）培养基，36 ℃±1 ℃培养16 h～20 h。

如其生长性状为葡萄糖（+）、乳糖（+）、
产气（+）、硫化氢（-）者。

3.7 诊断血清凝集试验
可疑菌株可用大肠埃希氏菌O157抗血清和O157单克隆抗体进行玻片凝集，凝集强度达（+++），再用H7抗血清凝集鉴定。

同时设盐水做对照。

上述，冷冻，真空抽干，并于真空状态下封口保存。

若患者不能自然排除O157:H7与肠杆菌科的某些菌种存在抗原交叉现象，例如：弗劳地柠檬酸杆菌、赫尔曼埃希氏菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌等，一般可通过单克隆抗体解决，但弗劳地枸椽酸杆菌与O157:H7的O抗原交叉反应用单克隆抗体也无法辨别，只可通过检测O抗原编码基因鉴别。

3.8 API 20E生化鉴定试剂盒
采用API 20E生化鉴定试剂盒进行鉴定，生化反应编码:大多为5144172，极少数为1144172或5144162。

4 菌株保存和定期上送
4 ℃或室温保存的半固体培养基保菌菌种至少2套（穿刺接种后36 ℃培养过夜即可）或30%甘油肉汤冻存管-70 ℃保存菌株至少2套。

按照方案要求定期上送。

5 多重PCR毒力基因鉴定
PCR扩增O157、H7编码基因，并且检测stx1、stx2、hly、eae毒力基因。

典型的造成人类感染的大肠埃希氏菌O157:H7为O157+、H7+，并且携带志贺毒素、溶血素与粘附抹平因子：stx1+、stx2+、hly+、eae+，我国大部分O157:H7菌株不携带stx1，为stx1-、stx2+、hly+、eae+。

多重PCR各对引物序列见表7。

表7多重PCR毒力基因鉴定的引物
目标基因引物序列片段大小（bp）stx1 F 5'-ATA AAT CGC CAT TCG TTG ACT AC-3'
180
R 5'-AGA ACG CCC ACT GAG ATC ATC-3'
255 stx2 F 5'-GGC ACT GTC TGA AAC TGC TCC-3'
R 5'-TCG CCA GTT ATC TGA CAT TCT-3'
eaeA F 5'-GAC CCG GCA CAA GCA TAA GC-3'
384
R 5'-CCA CCT GCA GCA ACA AGA GG-3'
534 hlyA F 5'-GCA TCA TCA AGC GTA CGT TCC-3’
R 5'-AAT GAG CCA AGC TGG TTA AGC T-3’
259 rfb O157 F 5'-CGG ACA TCC A TG TGA TAT GG-3’
R 5'-TTG CCT A TG TAC AGC TAA TCC-3’
5.1 模板DNA提取：用热裂解法，将纯化的可疑菌株接种5 mL营养肉汤，36 ℃±1 ℃培养6 h或过夜，10 000 r/min离心5 min，弃上清；加入1 mL生理盐水，震荡分散细菌，10 000 r/min离心5 min，弃上清；沉淀加100 µL无菌蒸馏水，重新震荡悬浮后置100 ℃水浴10 min；
10 000 r/min离心5 min，上清用于PCR扩增。

阳性和阴性对照分别为我们保存的产志贺氏毒素1和2的大肠埃希氏菌O157:H7和不具备上述6种基因的大肠埃希氏菌，同法制备。

5.2 多重PCR反应体系：模板DNA提取液5 µL，10×PCR 缓冲液5 µL，分别加终浓度1.5 mMMgCl2，0.2 mM dNTP，每种引物500 nM，Taq DNA聚合酶1.5 µL，最后加无菌蒸馏水至总体积50 µL。

5.3 多重PCR反应条件：除变性温度由95 ℃改为94 ℃和增加最后72 ℃延伸外，均按Paton法。

1～10循环，94 ℃1 min变性；65 ℃2 min退火；72 ℃1.5 min延伸。

11～25循环，94 ℃1 min；60 ℃2 min；72 ℃ 1.5 min。

26～35循环，94 ℃1 min；65 ℃2 min；
72 ℃2.5 min。

最后72 ℃10 min。

5.4 扩增产物用含EB（0.5 μg/mL）的2%琼脂糖电泳，阳阴性对照正常，紫外灯下观察结果，照相记录。

（六）副溶血性弧菌检验操作程序
1 范围
本程序规定了粪便标本中副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的检验方法。

2 检验程序
副溶血性弧菌检验程序见图4。

图4 副溶血性弧菌检验程序
3 操作步骤
3.1 标本收集
标本包括新鲜的或转移至Cary-Blair运送培养基的粪便或肛拭子。

最优标本是转移至Cary-Blair运送培养基的粪便拭子。

肛拭子不是最佳标本，仅在病人无粪便标本时采用。

肛拭子收集后应当目测，需要在拭子上明显见到粪便。

所采集的标本尽快检验，放入Cary-Blair运送培养基中的标本应在室温条件下24 h内送检。

新鲜的粪便标本置于清洁、干燥、无肥皂或消毒液残留的容器中，室温条件下8 h
内送检。

3.2 分离培养
新鲜粪便：无菌拭子采集少量粪便，将拭子放入3%氯化钠碱性蛋白胨水。

轻拧管盖。

注意：拭子表面有一层标本即可，不可将过量的标本放入碱性蛋白胨水。

肛拭子：操作程序同新鲜粪便。

转移至Cary-Blair运送培养基的粪便拭子：轻搅混合标本；将拭子放入3%氯化钠碱性蛋白胨水。

轻拧管盖。

注意：拭子表面有一层标本即可，不可将过量的标本放入碱性蛋白胨水。

碱性蛋白胨水于36 ℃±1 ℃培养12 h～16 h，于TCBS平板或科玛嘉弧菌显色培养基平板上划线分离，36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。

3.3 菌落特征
典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径2 mm～3 mm。

从培养箱取出TCBS平板后，应尽快（不超过1 h）挑取菌落或标记要挑取的菌落。

典型的副溶血性弧菌在科玛嘉弧菌显色培养基上呈圆形、半透明、表面光滑的粉紫色菌落，直径2 mm～3 mm。

3.4 纯培养
挑取3个或以上可疑菌落，划线接种3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。

3.5 初步鉴定
3.5.1 氧化酶试验：挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，副溶血性弧菌为氧化酶阳性。

3.5.2 挑取纯培养的单个可疑菌落，转种3%氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层，36 ℃
±1 ℃培养24 h观察结果。

副溶血性弧菌在3%氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深，有动力。

3.5.3 嗜盐性试验：挑取纯培养的单个可疑菌落，分别接种0%、6%、8%和10%不同氯化钠浓度的胰胨水，36 ℃±1 ℃培养24 h，观察液体混浊情况。

副溶血性弧菌在无氯化钠和10%氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生长，在6%氯化钠和8%氯化钠的胰胨水中生长旺盛。

3.6 确定鉴定
刮取3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上的单个菌落，进行系统生化鉴定试剂盒鉴定。

4 血清学分型
4.1 制备：接种两管3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂试管斜面，36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。

用含3%氯化钠的5%甘油溶液冲洗3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂斜面培养物，获得浓厚的菌悬液。

4.2 K抗原的鉴定：取一管上述制备好的菌悬液，首先用多价K抗血清进行检测，出现凝集反应时再用单个的抗血清进行检测。

用蜡笔在一张玻片上划出适当数量的间隔和一个对照间隔。

在每个间隔内各滴加一滴菌悬液，并对应加入一滴K抗血清。

在对照间隔内加一滴3%氯化钠溶液。

轻微倾斜玻片，使各成分相混合，再前后倾动玻片1 min。

阳性凝集反应应可以立即观察到。

4.3 O抗原的鉴定：将另外一管的菌悬液转移到离心管内，121 ℃高压1 h。

高压后4 000
r/min离心15 min，弃去上层液体，沉淀用生理盐水洗三次，每次4 000 r/min离心15 min，最后一次离心后留少许上层液体，混匀制成菌悬液。

用蜡笔将玻片划分成相等的间隔。

在每个间隔内加入一滴菌悬液，将O群血清分别加一滴到间隔内，最后一个间隔加一滴生理盐水作为自凝对照。

轻微倾斜玻片，使各成分相混合，再前后倾动玻片1 min。

阳性凝集反应应可以立即观察到。

如果未见到与O群血清的凝集反应，将菌悬液121 ℃再次高压1 h 后，重新检测。

如果仍旧为阴性，则培养物的O抗原属于未知。

根据表8报告血清学分型结果。

表8副溶血性弧菌的抗原
5 PCR毒力基因鉴定
PCR法检测tdh（耐热直接溶血素基因）和trh（TDH相关溶血素基因）毒力基因，引物序列见表9。

5.1 模板DNA提取：自TCBS或科玛嘉弧菌显色平板上挑取3个可疑菌落，划线含3%氯化钠的胰蛋白胨大豆琼脂平板。

纯化菌株在含3%氯化钠的脑心浸液肉汤中36 ℃±1 ℃过夜生长，10 000×g离心10 min。

沉淀用无菌生理盐水洗涤2次，重新悬浮于双蒸水中，煮沸10 min。

细菌裂解物立即用于PCR或-20 ℃保存备用。

5.2 PCR反应体系中包括含DNA的细菌裂解物2 µL，20 µmol/L的引物贮存液各1 µL，dNTP 贮存液（各种dNTP的浓度为2.5 mmol/l）1 µL，Taq聚合酶0.3 µL（TaKaRa），10×PCR缓冲液5 µL，总体积50 µL。

5.3 反应体系94 ℃预变性5 min。

PCR的循环条件见表9。

反应体系72 ℃再延伸5 min。

所有反应均设立阳性对照和阴性DNA对照。

PCR产物在2%的琼脂凝胶中120 V电泳，EB 染色，照相。

5.4 PCR产物在2%的琼脂凝胶中120 V电泳，EB染色，照相。

表9鉴定致病性副溶血性弧菌的引物
目标基因引物序列片段大小
（bp）PCR条件循环
次数
tdh基因TDH-1: 5′-AGC TTC CAT CTG TCC CTT TT-3′TDH-2: 5′-ATT ACC ACT ACC ACT CTC A TA-3′434 94 ℃1 min
55 ℃1 min
72 ℃1 min
30
trh基因R2: 5′-GGC TCA AAA TGG TTA AGC G-3′R6: 5′-CAT TTC CGC TCT CAT ATG C-3′250 94 ℃1 min
55 ℃1 min
72 ℃1 min
30
6 结果与报告
当检出的可疑菌落生化性状符合表10要求时，报告粪便标本中检出副溶血性弧菌。

副溶血性弧菌主要性状与其他弧菌的鉴别见表11。

7 菌株的保存和上送
培养物穿刺接种3%氯化钠半固体培养基，轻拧管盖，36 ℃±1 ℃培养24 h，盖紧管盖。

也可以在动力试验培养基24 h培养物上加入一层灭菌矿物油。

室温贮存培养物，不要冷藏。

如果需要长期保存菌株，将0.7 mL 3%氯化钠脑心浸液肉汤6 h～12 h培养物和0.3 mL 灭菌甘油加入灭菌菌种管，立即放置－70 °C保存。

按照方案要求定期上送。

表10副溶血性弧菌的生化性状
表11副溶血性弧菌主要性状与其他弧菌的鉴别
（七）小肠结肠炎耶尔森氏菌检测操作程序
1 范围
本程序规定了粪便标本中小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica）的检验方法。

2 检验程序
小肠结肠炎耶尔森氏菌检验程序见图5。

图5 小肠结肠炎耶尔森氏菌检验程序
3 操作步骤
3.1 标本收集
标本包括新鲜的或转移至Cary-Blair运送培养基的粪便或肛拭子。

最优标本是转移至Cary-Blair运送培养基的粪便拭子。

肛拭子不是最佳标本，仅在病人无粪便标本时采用。

肛拭子收集后应当目测，需要在拭子上明显见到粪便。

所采集的标本尽快检验，放入Cary-Blair运送培养基中的标本应在冷藏条件下24 h内送检。

新鲜的粪便标本置于清洁、干燥、无肥皂或消毒液残留的容器中，冷藏条件下8 h
内送检。

3.2 分离培养
3.2.1 直接分离培养
新鲜粪便：无菌拭子采集少量粪便；新鲜拭子在CIN耶尔森氏菌选择性平板一区划线；以1 µL无菌接种环或接种针划线分离。

在标本中再插入一个清洁的无菌拭子，将拭子放入改良PBS增菌液。

轻拧管盖。

注意：拭子表面有一层标本即可，不可将过量的标本放入改良磷酸盐增菌液。

肛拭子：操作程序同新鲜粪便。

转移至Cary-Blair运送培养基的粪便拭子：轻搅混合标本；拭子在CIN耶尔森氏菌选择性平板一区划线；以1 µL无菌接种环或接种针划线分离；在标本中再插入一个清洁的无菌拭子，将拭子放入改良磷酸盐增菌液。

轻拧管盖。

注意：拭子表面有一层标本即可，不可将过量的标本放入改良PBS增菌液。

平板25 ℃培养24 h～48 h。

3.2.2 增菌培养
取约1 g粪便标本接种于10 mL改良磷酸盐缓冲液，于4 ℃分别增菌培养7 d、14 d和21 d后取增菌培养物转种CIN耶尔森氏菌选择性平板，25 ℃培养24 h～48 h。

3.3 菌落特征
典型的小肠结肠炎耶尔森氏菌在CIN耶尔森氏菌选择性培养基上呈较小的湿润菌落，直径约1 mm～2 mm。

中心呈深玫瑰红色，凸起较尖锐，周围有明显透明环，称“公牛眼”。

3.4 纯培养
挑取3个或以上可疑菌落，划线接种营养琼脂平板，25 ℃培养24 h。

3.5 初步鉴定
3.5.1 糖分解试验：挑取可疑菌落接种改良克氏双糖斜面（用甘露醇取代乳糖），25 ℃培养24 h～48 h。

挑选斜面/底层均变黄（A/A），不产H2S，不产气（可能有微量气体，小泡，但不会将培养基顶裂或顶起）的菌株进一步鉴定。

3.5.2 尿素分解试验：刮取斜面上大量菌苔，浓厚接种于尿素培养基，震荡均匀，25 ℃培养2 h～4 h，变红色者为尿素酶阳性，进一步检测动力。

菌量少及其他未变色的菌株观察至24 h。

3.5.3 动力试验：将尿素酶阳性菌株接种于2管半固体，分别置于25 ℃与36 ℃±1 ℃培养24 h。

选取26 ℃动力（+）且36 ℃±1 ℃动力（－）的菌株，进行系统生化鉴定。

3.6 确定鉴定
刮取胰蛋白胨大豆琼脂平板上的单个菌落，进行系统生化鉴定。

4 血清学分型
使用致病性菌株常见血清型（我国一般为O:3、O:8、O:9型）的特异性单克隆抗体进行玻片凝集，进行血清分型。

5 PCR毒力基因鉴定
PCR法检测小肠结肠炎耶尔森氏菌ail（粘附侵袭位点基因）、ystA（耐热性肠毒素A）、ystB（黏附素基因）、virF（毒力因子基因）毒力基因，引物序列见表12。

O:3血清型菌株rfbC扩增结果为阳性（rfbC+）。

典型的致病性菌株的毒力基因的分布为ail+、ystA+、yadA+、virF+、ystB-。

传统意义上的致病性菌株不携带ystB，非致病性菌株不携带ail、ystA、yadA、virF。

5.1 自营养琼脂平板上挑取适量菌苔（200 µL枪头尖大小），悬浊于100 µL超纯水，-80℃或液氮速冻30 min（-20 ℃冷冻延长时间也可）后迅速沸水浴20 min～30 min，12 000 r/min 离心5 min，取上清液用做模板。

小肠结肠炎耶尔氏森菌能产生一种耐热DNA酶，水煮不能使其失活。

因此，水煮模板应尽快使用（一般不要超过7 d；如果是扩增ystA等小片段，最好使用新鲜制备模板，可信度较高），-20 ℃保存，并且避免反复冻融。

5.2 PCR反应体系中包括含DNA的细菌裂解物2 µL，20 µmol/l的引物贮存液各1 µL，dNTP 贮存液（40 mmol/µL）1.6 µL，5 U/µL的Taq聚合酶0.2 µL，含Mg2+的10×PCR缓冲液2 µL，总体积20 µL。

5.3 反应体系94 ℃预变性5 min。

PCR的循环条件见表12。

反应体系72 ℃再延伸5 min。

5.4 所有反应均设立阳性对照和阴性DNA对照。

PCR产物在2%的琼脂凝胶中120 V电泳，EB染色，照相。

表12鉴定小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因的引物
目的基因引物序列片段大小
（bp）
PCR条件循环次数
ail Ail-F: 5′-TAA TGT GTA CGC TGC GAG-3′Ail-R: 5′-GAC GTC TTA CTT GCA CTG-3′351 94 ℃15 s
57 ℃30 s
72 ℃30 s
25
ystA YstA-F: 5′-ATC GAC ACC AAT AAC CGC TGA G-3′YstA-R: 5′-CCA ATC ACT ACT GA CTT CGG CT-3′79 94 ℃15 s
61 ℃30 s
72 ℃30 s
25
ystB YstB-F: 5′-GTA CAT TAG GCC AAG AGA CG-3′YstB-R: 5′-GCA ACA TAC CTC ACA ACA CC-3′146 94 ℃15 s
61 ℃30 s
72 ℃30 s
25
yadA YadA-F: 5′-CTT CAG ATA CTG GTG TCG CTG T-3′YadA-R: 5′-ATG CCT GAC TAG AGC GAT ATC C-3′849/759* 94 ℃15 s
60 ℃30 s
72 ℃30 s
25
virA VirF-F: 5′-GGC AGA ACA GCA GTC AGA CAT A-3′VirF-R: 5′-GGT GAG CAT AGA GAA TAC GTC G-3′561 94 ℃15 s
63 ℃30 s
72 ℃30 s
25
rfbC RfbC-F: 5′-CGC ATC TGG GAC ACT AAT TCG-3′
RfbC-R: 5′-CCA CGA ATT CCA TCA AAA CCA CC-3′405 94 ℃15 s
55 ℃30 s
72 ℃30 s
25。