干扰素体外释放酶联免疫法在结核潜伏感染诊断中的价值

干扰素体外释放酶联免疫法在结核潜伏感染诊断中的价值翁绳凤;刘佳文;康丽军;刘威;刘宏蕴;李宝玲;朱新颖;何燕
【摘要】目的探讨干扰素体外释放酶联免疫法(TB-IGRA)在诊断诊断结核分枝杆菌潜伏感染的价值.方法分枝杆菌相关γ-干扰素检测试剂盒(WT- IGRA)检测140例健康者IFN-γ分泌水平,并对其进行结核菌素皮试及采用Cellestis Limited 生产的QuantiFERON-TB试剂盒进行IFN-γ平行检测.结果 140例健康者中,WT试剂和QFT试剂阳性率分别是25.7%(36/140)、21.4%(30/140),PPD3+～4+为14.3%(20/140).两试剂阳性符合率为81.3%,阴性符合率为88.9%,总符合率
86.7%.28例密接者中,PPD3+～4+为39.3%(11/28),WT试剂和QFT试剂阳性率分别是46.4%(13/28)和67.8%(19/28).结论 TB-IGRA在诊断结核分枝杆菌潜伏感染的价值优于PPD皮试,可以用于潜伏感染者的筛查.%Objective To investigate the clinical value of the Quantitative Diagnostic Kit for Mycobacterium tuberculosis-IFN-γrelease assay( TB-IGRA ) in diagnosing latent Mycobaterium tuberculosis infection. Methods 140 subjects were analyzed; antigen spe-cific-IFN response were determined by using regents from two suppliers, Quantitative Diagnostic Kit for Mycobacterium tuberculosis-IFN-γ release assay( WT-IGRA ) and QuantiFERON?-TB GOLD in tube
( QFT-GIT, Cellestis Limited, Australia ). Subjects received PPD skin test as well. Results Among 140 subjects,the positive rates of TB-IGRA with WT and QFT-G were 25. 7( 36/1404 ),21. 4%( 30/140 ), PPD3 H+~4 + was 14. 3%( 20/140 ). The positive consistency of two kits was81. 3% , negative consistency was 88. 9% , total consistency was 86.1%. Among 28 close contacts, their PPD3 + ~4+was 39. 3%( 11/28 ),WT and QFT positive rates
were 46. 4%( 13/28 ) and 67. 8%( 19/28 ). Conclusions The diagnostic value of latent Mtb infection of TB-IGRA is higher than that of PPD method, TB-IGRA can be used as a screening method for latent Mtb infection patients.【期刊名称】《临床肺科杂志》
【年(卷),期】2012(017)006
【总页数】3页(P1062-1064)
【关键词】结核分枝杆菌潜伏感染;干扰素释放试验;结核菌素皮试
【作者】翁绳凤;刘佳文;康丽军;刘威;刘宏蕴;李宝玲;朱新颖;何燕
【作者单位】100069,北京,首都医科大学公共卫生与家庭医学院;100095,北京,北
京老年医院检验科;100095,北京,北京老年医院检验科;100095,北京,北京老年医院
检验科;100095,北京,北京老年医院检验科;100095,北京,北京老年医院检验
科;100095,北京,北京老年医院检验科;100095,北京,北京老年医院检验科;100069,
北京,首都医科大学公共卫生与家庭医学院
【正文语种】中文
北京万泰生物药业股份有限公司研制的结核分枝杆菌相关γ-干扰素检测试剂盒与
澳大利亚QFT试剂盒的检测原理一致，均是检测结核特异性抗原介导的细胞免疫
反应。

这些抗原ESAT-6、CFP-10和TB7.7是致病性结核分枝杆菌特有的，而卡
介苗没有的片段。

潜在的结核分枝杆菌感染者(LTBI)体内拥有针对这些抗原的特异性T淋巴细胞，能识别、递呈这些抗原，并刺激T淋巴细胞增殖、释放细胞因子，如IFN-γ。

而QuantiFERON-TB试剂和北京万泰生物药业股份有限公司研制的结
核分枝杆菌相关γ-干扰素检测试剂盒可以定量检测这些释放的特异性IFN-γ，为
各级医疗单位的结核分枝杆菌感染诊断提供一种间接的结核分枝杆菌感染检测方法。

我们用两家试剂对140例普通健康者全血标本进行IFN-γ检测，同时进行PPD结核菌素试验，来评价干扰素体外释放酶联免疫法(TB-IGRA)在结核分枝杆菌潜伏感染诊断中的价值。

对象和方法
一、140例健康人群，男性64例，女性76例，平均年龄31岁。

无结核病史和
任何结核相关临床症状，胸部放射学无异常，无其他疾病。

其中28例为北京老年医院检验科工作人员，为密切接触者。

112例为北京万泰生物药业股份有限公司
员工，为普通健康人群。

结核杆菌隐性感染者20例:符合上述标准，且PPD结果
≥20 mm(3+及以上，含水泡)的人群。

二、仪器和试剂
Mutiskan MK3型酶标仪购自赛默飞世尔(上海)仪器有限公司。

北京万泰生物药业股份有限公司的分枝杆菌相关γ-干扰素检测试剂盒(简称WT试剂)，Cellestis Limited生产QuantiFERON -TB试剂盒，(简称 QFT试剂)，1046A Dandenong Road，Carnegie，Melbourne，Victoria 3163，Australia，FDA批件
号:P010033。

三、方法按说明书方法进行
1.WT试剂试验步骤
BD肝素锂抗凝采血管抽取＞5 ml静脉血，马上轻柔的颠倒混匀3次以上，使抗
凝剂充分溶解。

采集到全血分装到3种不同的培养管中。

“T”为添加了结核特异性抗原ESAT-6、CFP-10的测试培养管;“N”为本底对照培养管;“P”为添加了
非特异刺激原植物血球凝集素(PHA)的阳性对照培养管。

每种培养管分装1 ml，
分装前需要颠倒混匀3次以上。

分装后轻柔颠倒培养管5次，立刻于37℃培养箱
中静置培养22±2 h。

静置培养22±2 h后取出，离心收集上清。

其次，用双抗体夹心法定量检测上清中IFN-γ的含量。

根据刺激培养系统中特异性升高的IFN-γ
的量，来判定是否为结核感染阳性。

理论上每位受试者都能对非特异刺激抗原PHA产生反应。

2.QFT试剂试验步骤
QFT试剂新鲜全血标本采集，利用参考试剂中提供的3种不同的采血管，按照灰
盖(本底对照培养管)、红盖(结核特异性抗原测试培养管)、紫盖(非特异刺激原阳性对照培养管)的顺序分别采集1 ml静脉血，马上轻柔的颠倒混匀3次以上，使抗
凝剂充分溶解。

新鲜全血经刺激培养22±2 h后，3000～5000 rpm离心10分钟，取上清放于新的EP管中，完成ELISA检测。

3.结核菌素皮试
在前臂皮内注射标准PPD 0.1 ml(20个国际结素单位/ml)。

72小时检查反应结果，记录硬结平均直径(mm)。

PPD＜5 mm阴性;5～9 mm1+;10～14 mm2+;15～
19 mm3+;≧20或有明显水泡4+，其中3+和4+为阳性。

四、统计学处理
应用SPSS11.5统计软件进行数据统计处理，计数资料组间比较采用χ2检验，P
＜0.05为差异有统计学意义。

结果
一、IGRA与PPD阳性率情况
在总体健康人群中，WT试剂阳性率(25.7%)高于其他两种方法;在密切接触者中，QF试剂检出率较WT试剂高(67.8%)。

总体结果显示，TB-IGRA阳性率高于PPD 皮试。

见表1。

表1 三种方法检测结果组别例数PPD3+～4+阳性率(%)WT试剂阳性率(%)QF试剂阳性率(%)健康人群(总)140 14.3(20/140)25.7(36/140)21.4(30/140)健康人群
(密接者)28 39.3(11/28)46.4(13/28)67.8(19/28)
二、IGRA结果与PPD结果之间的相关性
PPD与WT，QFT试剂的相关性，由强到弱，呈明显递减趋势;PPD检测结果为3+～4+，WT和QFT试剂阳性检出率分别为60%和50%;PPD检测结果为阴性时，它们的阳性率检出率分别为18.2%和9.2%。

见表2。

表2 两种IGRA试剂结果与PPD相关性比较项目(例)总数 WT试剂阳性 QFT 试剂阳性PPD无结果523 PPD阴性 11 2 1 PPD1+～2+ 104 20 16 PPD3+～4+ 20
12 10
三、WT试剂与QFT试剂结果符合率
两种试剂阳性符合率为81.3%［26/(26+6+0)×100%］，阴性符合率为88.9%［104/(104+13+0)×100%］，总符合率为86.7%
［26+104+0)/(32+117+1)×100%］。

WT试剂与QFT试剂配对分析结果无统计学差异，P＞0.05。

见表3。

讨论
目前国内诊断潜伏感染主要依据结核菌素皮试的结果，一般认为PPD强阳性或在短期内阴性转为阳性者是结核菌潜伏感染者。

然而PPD无法区分BCG接种产生的免疫应答反应与潜伏感染产生的应答反应，这让潜伏感染诊断有了难度［1］。

近年来采用ELISA或ELISPOT法定量检出受检者全血或外周血单个核细胞对结核分枝杆菌特异抗原的IFN-γ释放反应被FDA批准在多个国家应用于结核菌潜伏感染的诊断［2－3］，在我国肖松生等4提出过ELISPOT法能够有效地诊断出结核潜伏感染。

针对结核杆菌特异性蛋白的T细胞γ干扰素释放试验也已被普遍用于结核杆菌感染的诊断［5］。

IGRA的原理是检测机体对结核杆菌特异性蛋白ESAT-6、CFP-10和TB-7.7的免疫反应。

这些蛋白在所有结核分枝杆菌及致病性牛分枝杆菌中特异表达，而在卡介苗和大多数非结核分枝杆菌中不表达［6］。

表3 两种IGRA试剂结果符合率P=0.7103比较项目 QFT试剂阳性(例)QFT试剂阴性(例)QFT试剂不确定(例)WT试剂阳性(例)0.1280 26 13 1 WT试剂阴性(例)6 104 0 WT试剂不确定(例)0 0 0 χ2
首先，在检测健康人群中，WT和QFT试剂IGRA阳性率高于 PPD皮试法。

其阳性率分别为25.7%，21.4%和14.3%。

在密接者中，三种方法的阳性率分别为46.4%，67.8%和39.3%。

我科是结核病实验室，有大量的含结核菌的痰标本，每人或多或少接触结核杆菌，28例工作人员应该都是结核菌的密接者。

Brodie报道［7］IGRA与结核的密接程度相关，且不受机体免疫力及卡介苗接种的影响。

我科工作人员工作时间长短(密接程度)与IGRA值大小无正比例关系，还有1例工作时间最长，但IGRA为阴性。

即使这样，这项研究表明，IGRA和PPD两种测试对结核潜伏感染都有用处。

其次PPD结果与IGRA结果之间有相关性，当PPD检测结果为3+～4+，WT试剂阳性率60%(12/20)。

PPD检测结果为阴性时，WT 阳性率为18.2%(2/11)。

PPD检测可能增加其后IGRA中对干扰素的应答水平，南非一项研究显示，筛查结核潜伏感染可用先 PPD，后 IGRA的两步策略，但IGRA须在PPD检测之后的3天内进行。

这个研究采用两个厂商的试剂是为了更好评价IGRA方法的真正价值。

虽然原理一样，但是两种试剂结果还是有差别。

总体人群中阳性率WT试剂高于QFT试剂，在密接者中QFT试剂高于WT试剂。

但总的来说，WT试剂与QFT试剂符合率良好，达86.7%。

QFT试剂已被国外验证在诊断结核感染及结核病方面的特异性和敏感性都很好，在本实验中选用QFT作为对照，比较其与WT试剂的差异，结果显示无统计学上的差异。

因此本实验建立的WT试剂干扰素体外释放酶联免疫法可以用于潜伏感染者的筛查。

参考文献
［1］Peter A，Aark Doherty，Madhukar P.The prognosis of latent
tuberculosis:can disease be predicted［J］?Trends in Medicine，2007，
13(6):175－182.
［2］Geral H.Mazurek，Margarita E.Villarino.Guidelines for using the Quanti FERON-TB-Gold test for detecting Mycobacterium tuberculosis infection［J］.MMWR，2005，54(6):49 －55.
［3］Alfred A Lardizabal，Lee B Reichman.Interferon-gamma release assay for detection of tuberculosis infection［J］.US Respiratory disease，2006，54:59 －61.
［4］肖松生，杨倩婷，蔡雄茂，等.外周血IFN-γ的检测在结核分枝杆菌潜伏感染诊断中的价值［J］.临床肺科杂志，2008，13(10):1251－1253.
［5］Sester M，Sotgiu G，Lange C，et al.Interferon-γ release assays for the diagnosis of latent Mycobacterium tuberculosis infection:a systematic review and meta-analysis［J］.Eur Respir J，2011，37(1):88－99.
［6］Mahairas GG，Sabo PJ，Hickey MJ，et al.Molecular analysis of genetic differences between mycobacterium bovis BCG and virulent
M.bovis［J］.Bacteriol，1996，178(5):1274 －1282.
［7］Brodie D，Lederer DJ，Gallardo JS，et e of an interferon-gamma release assay to diagnose latent tuberculosis infection in foreignborn patients［J］.Chest，2008，133(4):869 －874.。