代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌生产L-苹果酸的研究

代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌生产L-苹果酸的研究本研究以谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC 13032为研究对象,通过代谢工程策略构建了高产L-苹果酸菌株,并结合启动子工程策略强化了磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸合成草酰乙酸的羧化途径,进一步提高了L-苹果酸产量。

主要研究结果如下:(1)构建L-苹果酸生产菌株。

利用质粒pK19mobsacB建立了同源重组法敲除谷氨酸棒状杆菌基因的方法,通过连续敲除磷酸乙酰基转移酶-乙酸激酶编码基因pta-ack,乳酸脱氢酶编码基因ldh,丙酮酸醌氧化还原酶编码基因pqo和苹果酸酶编码基因male,阻断了丙酮酸合成乙酸和乳酸的代谢路径以及L-苹果酸回补丙酮酸路径,成功构建了L-苹果酸生产菌株A04。

菌株A04经过发酵培养后可生产L-苹果酸7.448 g/L、丙酮酸6.704 g/L。

(2)强化羧化途径提高L-苹果酸产量。

通过替换自身强启动子Psod来过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc和丙酮酸羧化酶编码基因pyc,强化L-苹果酸合成路径中的羧化途径,提高流向L-苹果酸的碳通量,进一步提高菌株生产L-苹果酸的能力。

最终,在初步优化的发酵实验条件下,L-苹果酸最大产量为14.932 g/L,产率为0.761 mol/mol葡萄糖。

(3)ppc代谢路径和pyc代谢路径的比较。

通过对菌株改造前后ppc、pyc酶活和有机酸产量、产率的分析,可以发现:在厌氧发酵时,ppc代谢路径和pyc代谢路径能通过合成草酰乙酸,进而合成L-苹果酸,其中ppc代谢路径的碳流量远大于pyc代谢路径的碳流量。

且pyc代谢路径碳流量太小是菌株积累丙酮酸和阻碍菌株高效利用葡萄糖合成L-苹果酸的关键因素之一。