丙卡特罗在三种刷型手性固定相上的直接拆分

丙卡特罗在三种刷型手性固定相上的直接拆分
唐琴;陈先勇;宋航
【摘要】以正己烷-异丙醇二元混合溶剂体系为流动相,在Whelk-O1、 DNB-PG 和DNB-Leucine 3种刷型手性固定相上将药物丙卡特罗直接拆分为(R,R/S)和(S,R/S)对映体,分离系数α值达1.4 ～1.8.考察了流动相组成及固定相分子结构对对映体分离效果的影响,同时对丙卡特罗与3种固定相的手性识别机理进行了探讨.结果表明,当流动相中异丙醇的体积分数(φB)为2% ～30%时,lnk′与lnφB之间呈现较好的线性关系.因此,在一定范围内可以根据所需色谱分离系数或保留时间估计流动相的组成.以后出峰对映体所表征的3种手性柱的色谱分离效能分别
为:n(Whelk-O1)=10 816/m,n(DNB-PG)=4 532/m,n(DNB-Leucine)=12
844/m.DNB-PG柱柱效相对较低,谱峰展宽较大,且有轻微拖尾,需改善柱子装填和预处理技术以提高色谱分离柱效.
【期刊名称】《分析测试学报》
【年(卷),期】2010(029)004
【总页数】4页(P407-410)
【关键词】丙卡特罗;对映体拆分;刷型手性固定相;手性识别机理
【作者】唐琴;陈先勇;宋航
【作者单位】湖北民族学院,化学与环境工程学院,湖北,恩施,445000;湖北民族学院,化学与环境工程学院,湖北,恩施,445000;四川大学,化工学院,制药与生物工程系,四川,成都,610065
【正文语种】中文
【中图分类】O657.72
药物手性对映体在药理、毒理和临床疗效等方面存在较大差异,对其进行拆分具有重要意义。

刷型手性固定相 (Brush type CSP)在稳定性、耐用性方面较其他类型手性固定相有着独特的优势,已有许多用刷型手性固定相直接拆分和制备手性对映体药物的报道[1-3]。

Whelk-O1手性固定相是一种在分析及制备领域应用广泛的刷型固定相,对非甾体解热镇痛类药物 (NASID)和许多其他类型的手性化合物均有很好的拆分效果,且适用于多种类型的流动相体系。

(R)-N-3,5二硝基苯甲酰苯基甘氨酸手性固定相 (DNB-PGCSP)也是一种应用十分广泛的手性固定相,能拆分 30多类手性化合物。

(R)-N-3,5二硝基苯甲酰亮氨酸手性固定相(DNB-Leucine CSP)是一种早期开发应用的刷型手性固定相,其拆分范围不如 DNB-PG广泛[4-7]。

目前,刷型手性固定相的制备主要遵循“相互 -相互作用”原理,即优先选择手性作用位点结构相近的系列化合物对某一含手性因素的目标化合物进行系统拆分研究,通过构效关系优化目标化合物作为手性固定相拆分前述所选系列化合物的结构条件,从而指导新型手性固定相的有效合成[8-9]。

丙卡特罗主要用于治疗哮喘、支气管炎、呼吸道感染等,是一种临床应用十分广泛的β阻滞剂类药物[10-11]。

目前,对丙卡特罗的研究多限于其外消旋体含量的直接测定,而对其拆分的报道较少。

本课题组曾用自制的二硝基苯甲酰 -苯基甘氨酸型手性固定相直接拆分丙卡特罗药物对映体[12-14]。

本文在已有的研究基础上,考察了丙卡特罗在Whelk-O1、DNB-PG和 DNB-Leucine 3种手性固定相 (其结构式见图 1)上的拆分。

根据文献[15]的统计热力学研究,对于正相二元流动相体系,保留因子k′与流动相中极性调节剂含量有如下关系:ln k′=a+cφB+b lnφB,式中φB为B
组分在二元混合溶剂中的体积分数,a、b、c是与溶质及洗脱剂性质、柱温、作用
距离等有关的参数。

本文对该公式进行了检验,发现在手性分离中遵循该公式,且发
现ln k′与lnφB之间具有较好的线性关系,与上述经典液固吸附色谱保留方程相比,方程中的系数 c可以近似等于零,故温度对拆分效果的影响不大。

文中拟合了 3种CSP在正己烷 -异丙醇体系下保留因子和流动相组成的关系式。

实验结果为研究该药物在人体内的药理作用提供了依据。

图1 3种 CSP及药物丙卡特罗的分子结构式Fig.1 Molecular structures of
three CSPs and p rocaterol
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
Waters515型高效液相色谱泵、Waters2487双波长紫外检测器 (美国Waters公司);250 mm×4.6 mm Whelk-O1(R,R)色谱柱 (美国 Regis Technologies公司);250 mm ×4.6 mm DNB-PG、DNB-Leucine色谱柱 (实验室自制)。

CBL Model 100型柱温箱 (美国 Photoelectron Technology公司);Chrom Station色谱工作站 (美国 Sage公司)。

Hamilton 25μL注射器 (美国 Hamilton公司)。

Waters 25μL进样环。

正己烷、异丙醇由分析纯试剂重蒸得到。

盐酸丙卡特罗样
品从中国大冢制药有限公司生产的片剂中提取。

盐酸丙卡特罗标准品由中国药品生物制品检定所提供。

1.2 色谱条件
流动相:正己烷和异丙醇混合溶剂体系,实验采用等度洗脱;流速:2.0 mL/min;检测器波长:254 nm;温度:25℃。

流动相在使用前用0.45μm滤膜过滤并经超声脱气处理。

2 结果与讨论
2.1 流动相组成的影响
调节异丙醇的体积分数,研究了不同体积分数的极性调节剂对分离效果的影响,结果
见表1。

由表1可知,随着异丙醇体积分数的减少,丙卡特罗对映体的保留时间(k1、k2)逐渐增长,分离系数(α)逐渐增大,说明在 3种手性固定相对丙卡特罗的拆分过程中,氢键作用起主要作用。

丙卡特罗在 3种固定相上拆分的保留因子与流动相组成
的关系曲线拟合如图 2所示。

表1 丙卡特罗在 3种手性固定相上的拆分数据Table1 Resolution of procaterol enantiomerson three CSPs?
图2 ln k′与lnφB的关系拟合曲线Fig.2 Curvesof ln k′vs.lnφB fo r three CSPs
从图 2可以看出,ln k′与lnφB(φB为流动相中异丙醇的体积分数)之间具有较好的
线性关系。

与经典色谱保留值k′与极性调节剂体积分数φB的关系公式 ln
k′=a+cφB+b lnφB相比,方程中的系数 c可近似为零。

而微观上影响参数 c的主
要因素有溶质、洗脱剂的极化率、偶极矩、柱温等[16-17],从而说明拆分过程中偶极矩的作用不明显,且温度对拆分效果的影响不大,故选择在常温条件下进行实验。

分离系数的对数lnα与lnφB之间的关系可根据 2个保留因子的方程相减求
得:l nα=Δa+Δb lnφB(Δa、Δb分别为两对映体保留值方程中 a、b的差值)。

因此,在一定范围内可根据分离系数或保留时间估算流动相的组成。

图3 DNB-PG与丙卡特罗的作用力示意图Fig.3 Interaction between DNB-PG CSP and procaterol enantiomers
2.2 固定相结构的影响
研究表明 (见表 1),不同流动相条件下,丙卡特罗在3种手性固定相上均能达到较好
的拆分效果,且保留时间都很短。

丙卡特罗与 DNB-PG CSP的作用力示意图如图 3所示。

丙卡特罗与手性固定相的作用过程中,分子间形成有效的π-π相互作用 (作
用力 1)以及羟基 -羰基氢键作用(作用力 2),从而使对映体分子得以分离。

研究表明,手性固定相中与手性碳相连但不参与手性识别的羰基会导致保留时间的
增加[4]。

Whelk-O1 CSP分子中仅有 1个羰基,故保留时间较另外两种 CSP显著
缩短,这也可能与Whelk-O1 CSP的空间位阻较大有关。

而在相同的流动相条件下,DNB-Leucine CSP的分离系数最大,这可能是因为DNB-Leucine CSP中仅有 1个苯环,形成的吸附位点较少所致。

以体积比为80∶20的正己烷 -异丙醇为流动相,丙卡特罗在 3种手性固定相上拆分的色谱图如图 4所示。

由图 4可知,丙卡特罗对映体在 3种手性色谱柱上均获得了较为理想的分离。

Whelk-O1和 DNBLeucine两根色谱柱的柱效用公式 n=16(t R/W)2计算分别为n(Whelk-O1)=10 816/m、n(DNB-Leucine)=12 844/m;而由于峰形轻微拖尾,计算DNB-PG色谱柱的柱效时采用公式 n=5.54(t R/W1/2)2,可得 n(DNB-PG)=4 532/m(其中 t R为保留时间,W为峰底宽,W1/2为半峰宽)。

分离度 R S用公式 R S=k2 n1/2(α-1)/[4α(1+k2)]计算分别为:R S(Whelk-O1 CSP)=1.0,R S(DNB-PGCSP)=1.6,R S(DNB-Leucine CSP)=2.4。

结果表明,Whelk-O1柱具有较高的色谱柱效但分离度 (R S)相对较小,尚需进一步优化流动相体系组成(如改变极性调节剂种类等)以提高色谱分离选择性;而 DNB-PG柱虽然具有较大的分离度但柱效最低,色谱峰有轻微拖尾现象,这可能与柱子装填效果以及流动相流速等色谱动力学条件有关。

图4 丙卡特罗在 3种 CSP上的拆分色谱图Fig.4 Chromatograms of procaterol enantiomers on three CSPs A.Whelk-O1,B.DNB-PG,C.DNB-Leucine
3 结论
在不同体积比的正己烷 -异丙醇二元体系流动相条件下,药物丙卡特罗的部分对映体在Whelk-O1、DNB-PG和DNB-Leucine 3种刷型手性固定相上均得到了很好的分离,最佳流动相条件下分离选择性因子α值均达 1.4以上,且洗脱时间短。

以后出峰对映体所表征的 3种手性柱的色谱分离效能分别为:n(Whelk-O1)=10
816/m,n(DNB-PG)=4 532/m,n(DNB-Leucine)=12 844/m。

DNB-PG柱柱效相对较低,谱峰展宽较大,且有轻微拖尾,通过改善柱子装填和预处理条件,有可能进一步
提高色谱分离柱效。

流动相组成对分离的影响测试结果表明,在丙卡特罗与 3种固定相分子间的手性识别过程中,氢键作用是主要作用之一。

参考文献:
[1] 傅若农.高效液相色谱进展 (五)——HPLC手性固定相和色谱柱近年的发展 [J].国外分析仪器技术与应用,2002,(2):1-14.
[2] 常银霞,周玲玲,向兰,等.D-苯甘氨酸手性固定相的制备及对多种手性化合物的拆分 [J].分析测试学报,2007,26(1):107-109.
[3] 唐琴,宋航,付超,等.高效液相色谱手性固定相法拆分克伦特罗对映体[J].分析化学,2004,32(4):239-241.
[4] WAINERIW.Proposal for the classification of high-performance liquid chromatographic chiral stationary phase:how to choose the right column[J].Trends Anal Chem,1987,327(6):125-158.
[5] WILL IAM H,MICHAEL E K.Structural optimization of a chiral selector for use in preparative enantioselective chromatography[J].J Chromatogr:A,1999,840(5):151-158.
[6] CHRISTOPHER JW.Evolution of chiral stationary phase design in the Pirkle laboratories[J].J Chromatogr:A,1994,666(7):3-26.
[7] DANIEL W.Chiral stationary phasesfor high performance liquid chromatographic separation of enantiomers:A mini-review[J].JLiq Chromatogr,1984,302(7):353-376.
[8] W ILL IAM H,MYUNG H H,BEMADINEB.A rational approach to the design of highly-effective chiral stationary phases[J].J
Chromatogr,1984,316(3):585-604.
[9] W ILL IAM H,RECHARD D.Reciprocity in chiral recognition-comparison
of several chiral stationary phases[J].JChromatogr:A,1987,404(9):107-115.
[10] 龚晓燕.丙卡特罗治疗咳嗽变异性哮喘的临床研究[J].儿科药学杂
志,2004,2(10):52-53.
[11] BERTIL W.β-Adrenoceptor agonists and asthma——100 years of development[J].Eur J Pharmacol,2002,445(1):1-12.
[12] 郑文丽,宋航,梁彦明,等.利用二硝基苯甲酰-苯基甘氨酸型手性固定相直接拆分丙卡特罗药物对映体[J].色谱,2003,21:239-24l.
[13] HUANG Songlin,WANGWei,OUYANGDongsheng,et al.Determination of procaterol in human plasma by gas chromatography/electron impact ionization mass spectrometry[J].Acta Pharmacol Sin,2000,21(6):564-566.
[14] 饶志明,邹苹,陈梅,等.流动注射化学发光测定盐酸丙卡特罗[J].光谱学与光谱分析,2008,28(2):269-272.
[15] 王福安,蒋元力.分子热力学与色谱保留[M].1版.北京:气象出版社,2001:104.
[16] LANDEK G,V INKOV ICD,KONTREK V,et al.Influence of mobile phase and temperature on separation of 1,1′-binaphthyl-2,2′-diol enantiomerswith brush type chiral stationary phases derived from L-leucine[J].Chromatographia,2006,64,469-473.
[17] 陈农,张玉奎,卢佩章.液固吸附色谱保留值方程的考察[J].色谱,1991,9(1):1-5.。