药物毒理学：重复给药毒性研究 - 1

重复给药毒性研究
Repeat dose toxicity study
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提纲
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节
概述 基本原则与要求 基本内容 分类实例讨论 结果的综合分析
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第一节 概述
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Single dose
Drug
in vivo：ADME
Repeat dose
Drug
Drug
Drug
Drug
重复给药毒性试验重复给药毒性试验repeatrepeatdosedosetoxicitytoxicitystudystudy是是观察观察反复给药情况下反复给药情况下实验动物出实验动物出毒性反应毒性反应剂量剂量反应关系反应关系主要靶器官主要靶器官毒性反应的性质和毒性反应的性质和损害程度损害程度可逆性等可逆性等毒性产生时间毒性产生时间持续时间持续时间可能反复产生毒性反可能反复产生毒性反应的时间应的时间有否迟发性毒性反应有否迟发性毒性反应有否蓄积毒性有否蓄积毒性耐受性耐受性descriptivetoxicologdescriptivetoxicologyy无观察到有害作用剂量无观察到有害作用剂量obviousadverseeffectlevelobviousadverseeffectlevelnoaelnoaelappliedappliedtoxicologytoxicology二应用意义
❖ 其他：瘤内注射 、舌下给药
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4、给药频率 ： ❖理想的给药频率及给药间隔尽量与人拟用
方式一致 ❖原则上应每天给药，给药期限长（3个月
或以上）的药物每周至少应给药6天。 ❖根据具体药物的特点设计给药频率（t1/2)
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5、给药期限 ： ❖与拟用的临床疗程、临床适应症和
用药人群有关
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四、检测指标：？ ❖涉及全身各系统：血液、免疫、肝脏、
❖ 意义：贫血、溶血、红细胞 生成减少、化疗、肾上腺皮 质激素 、肝脏受损、骨髓抑 制
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4 血液生化学指标
❖ 内容及意义： ➢ 肝胆功能： 丙氨酸氨基转换酶 (ALT) 天门冬氨酸氨基转换酶 (AST) γ-谷氨酰转移酶 (GGT) 碱性磷酸酶 (ALP) 胆碱脂酶（CHE） ➢ 肾功能 尿素氮（BUN） 肌酐（CRE）
1、实验动物种属或品系的选择 ：
理想的动物应具有以下特点： ❖ 对受试物的生物转化及反应与人体相近 ❖ 对受试物敏感 ❖ 已有大量历史对照数据 实际应用： ❖ 化学药和中药常选用两种动物，大鼠和Beagle狗 ❖ 皮肤用药常用小型猪或家兔 ❖ 生物技术药物常用非人灵长类--猴
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2、实验动物的质量控制 ： ❖正常、健康和未孕，动物体重差异应在平均体
理功能与机体代谢，如体重、免疫功能、应激状 态、代谢能力等，从而影响了其对受试药物的毒 性反应。 ❖国家标准GB GB14925-2010《中华人民共和国 标准 实验动物 环境及设施》对动物实验室的 要求
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中山大学实验动物中心
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动物实验设施(SPF)
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动物实验设施(狗实验室)
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动物实验设施(猴实验室)
重的20％之内。 ❖符合国家有关规定的等级要求，来源、品系、
遗传背景清楚，质量合格。 ❖选用处于体重增长曲线对数期的动物，试验开
始时大鼠为6周龄左右，Beagle犬为6个月龄 左右，猴为2-3岁左右
少年期
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3、实验动物的性别和数量 ： ❖大鼠：雌、雄各15 - 30只 ❖Beagle犬或猴：雌、雄各5 - 6只 4、动物试验设施的要求： ❖ 动物饲养环境能够影响实验动物的生长发育、生
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三、给药方案：
1、给药剂量(Dose levels)：剂量组设置？
❖ 高剂量：使动物产生明显的毒性反应，甚至出现个别动 物死亡。（找出毒性反应和靶器官）
❖ 低剂量：高于动物药效学试验的等效剂量，并不使动物 出现毒性反应。（找出NOAEL）
❖ 中剂量：在高剂量和低剂量之间设立，考察毒性反应剂 量-反应关系
机体 组织 细胞
临床表现 血尿生化 物理检查 组织病理
伴随毒代动力学检测
❖毒代动力学数据可以来自重复给药毒性试验的全 部动物，也可以来自部分动物。
❖毒代动力学试验应选择合适的时间点采样测定， 从而获得药时曲线下面积（AUC）、峰浓度（ Cmax）、达峰时间（Tmax）等参数。
❖生物技术药物在体内的分布：分布至重要器官( 生殖腺)、表达，是否与宿主的遗传物质发生整 合、融合。
？ in vivo：ADME
Target organ
Safety pharmacology
Toxic reaction
Target organ
？
Toxic reaction
？
Evident for supporting safety evaluation
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一、定义与目的：
重复给药毒性试验（Repeat dose toxicity
❖ 全面细致反映组织结构状态 ❖ 提供重要的形态学依据 ❖ 判断毒性损伤部位程度性质 ❖ 寻找毒性靶器官 ❖ 探讨毒性作用机理。
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8、毒物代谢动力学
❖ 揭示受试物体内暴露状况和毒理学试验结果的关系，推断与 临床安全性之间的相关性.
高剂量 中剂量 低剂量
给药部 位暴露
体内高暴露 体内中暴露 体内低暴露
3. 整体性：充分考虑药效学、药代动力学和其它毒理学研
究的试验设计和研究结果。
4. 具体问题具体分析：试验设计应根据受试物的结构特点
和理化性质、同类受试物在国内、外的临床使用情况、
临床适应症和用药人群、临床用药方案、相关的药效学、
药代动力学和毒理学研究信息等综合考虑。
5. 随机、对照、重复。
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二、具体要求
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2 心血管功能检查 ❖动物：大动物 ❖检测时间：试验开始前、试验期间、试
验结束 ❖指标：描记心电图，测量血压、心率 ❖特别注意：Q-T间期
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心血管、神经功能检查
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3 血液学指标
❖ 内容：红细胞计数(RBC) 、 血红蛋白(HB) 、白细胞计数 (WBC) 及分类、血小板计数 (PLT) 、凝血酶原时间(PT) 、 网织红细胞计数(Ret) 。
(Margin of Safety)； ❖ 提 示 临 床 试 验 中 需 重 点 监 测 的 指 标 (Parameters for
monitoring)； ❖ 为临床试验中的解毒或解救措施提供参考； ❖ 为更长期的毒性试验(包括致癌试验)的剂量设计和观察
指标的选定提供参考。
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三、特点： ❖ 研究周期最长 ❖ 困难最大 ❖ 耗资最多 ❖ 难以重复 ❖ 无法替代
重复给药毒性试验是判断 ➢ 一个候选药物是否有进一步开发的价值 ➢ 能否过渡到临床 的重要依据之一。
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第二节 基本原则与具体要求
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一、基本原则
Good Laboratory Practice
1. 试验管理：GLP
2. 参照有关的技术指导原则：CFDA 、 ICH 、OECD 、
FDA、 EMEA
❖ 还有？ ❖ 赋形剂对照组，空白对照组或阳性对照组
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2、对照组 (control)： ❖ 赋形剂(vehicle)对照组(包括溶媒、胶囊、生理盐水、佐
剂或空载体) ：排除赋形剂对试验结果解释的干扰。
❖ 空白(blank)对照组：对试验组动物取得的各种数据与正 常动物进行比较，也可比较试验前后各种数据的本底值。
❖ 阳性(positive)对照组(包括已知典型毒性反应的阳性对 照物和已知毒性资料的标准物)：考察所选用的实验系统 及方法是否能反映一些特殊的毒性（如神经系统毒性）， 提供对受试物所产生的毒性反应程度进行比较。
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3、给药途径 (Exposure route)：原则上应与临床用药途径 一致，特殊情况需作说明
以下几类药物的重复给药毒性方案要点： ❖ 抗癌药紫杉醇制剂 ❖ 中药复方小儿回春散 ❖ 治疗型乙肝疫苗 ❖ 重组人胰岛素 ❖ 生物类似药
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毒代动力学的仪器
9、免疫原性
❖ 免疫器官检查、血液学检查 ❖ 体液免疫：抗体(滴度、出现抗体的动物数、中和或非中
和抗体等)。 ❖ 细胞介导免疫：CTL (ELISPORT)，CD4、CD8 ❖ 非特异免疫：补体、NK细胞活性 ❖ 自身免疫：抗核抗体 ❖ 细胞因子：IFN、IL ❖ 免疫复合 物
10、恢复期观察
主要范围。
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第三节 基本内容
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一、受试物：
质量可控
采用制备工艺稳定、符合临床试验用质量标准规 定的样品，能代表所要评价物质的总体，理化性 质应清晰，包括：
❖ 制作方法(合成、提取、发酵、重组表达等) ❖ 所用的前体及溶剂(工程菌、细胞) ❖ 纯化的方法 ❖ 残留物 ❖ 杂质
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二、实验动物：
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5、骨髓检查 ❖ 意义：观察骨髓细胞数量是否波动，
细胞构成比例的变化，特异细胞是 否异常增殖或减少和消失，出理异 常形态的细胞。 6、尿液分析指标 ❖ 内容：尿液外观、比重（SG） 、 pH值（pH） 、尿糖（GLU） 、 尿 蛋 白 （ PRO ） 、 尿 胆 红 素 （BIL） 、尿胆原（UBG） 、酮 体（KET）、亚硝酸盐（NIT）、 潜血（BLD） 、白细胞（LEU）
❖ 给药结束后对部分动物（1/3-1/2）进行恢 复期观察，以了解毒性反应的可逆程度和 可能出现的延迟性毒性反应。在此期间除 不给予受试物外，其它的观察指标，各项 检测指标及病理学检查与给药期相同。
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思考题
❖ 重复给药毒性试验的目的、意义 ❖ 重复给药毒性试验的基本原则和具体要求
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下一节讨论内容
肾脏、呼吸、神经行为、心血管、消化、 内分泌、生殖、眼、耳、皮肤、粘膜等。
❖对应的检测指标：一般观察指标、血液 学、血液生化学、病理解剖学及病理组 织等方面。
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1、一般状况的观察：
最基本、最重要的内容
❖ 体重、摄食量：是非特异性指标，可用作全身 毒性反应的初步反映。
❖ 一般症状观察：笼旁观察，每天两次，观察动 物是否出现死亡。按症状观察表进行详细的检 查和记录。
NOAEL）
(Applied toxicology)
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二、应用意义： ❖ 预 测 受 试 物 可 能 引 起 的 临 床 不 良 反 应 (Adverse
reaction)； ❖ 判断受试物反复给药的主要毒性靶器官(Target organs)； ❖ 推测临床试验的起始剂量和重复用药的安全剂量范围
study）是观察反复给药情况下,实验动物出
现的：
Descriptive toxicoloபைடு நூலகம்y
❖ 毒性反应 ❖ 剂量-反应关系 ❖ 主要靶器官 ❖ 毒性反应的性质和
损害程度 ❖ 可逆性等
毒性产生时间 持续时间 可能反复产生毒性反 应的时间 有否迟发性毒性反应 有否蓄积毒性 耐受性
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找出
无观察到有害作用剂量 (No Obvious Adverse Effect Level,
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7、组织病理学检查 ❖给药结束后，应对动物（除恢复期观察
动物）进行全面的大体解剖，主要脏器应 称重并计算脏器系数。 ❖脏器系数 (%) = (脏器重量÷体重)100
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病理仪器
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❖组织病理学检查是长期毒性试验的核心内容之 一，对判断动物的毒性靶器官或靶组织具有重 要的意义，是发现毒性和描述毒性的“证据”。 旨在：
❖ 应在药效、药代、安全性药理、急性毒性试验之后进行； 试验设计应由药学、药理、毒理、临床研究人员共同制 定；
❖ 研究设计必须科学、周到和合理； ❖ 严格掌握试验条件、尽量排除干扰； ❖ 观察指标力求全面并能针对新药的作用特点，突出重点； ❖ 数据经合理的统计学处理； ❖ 认真、科学地分析实验结果，实事求是辨别真伪； ❖ 结论能明确回答新药毒副反应的主要特点及安全剂量的
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➢ 蛋白:总蛋白（TP） 、白蛋白（ALB） ➢ 糖(GLU) ➢ 脂类:甘油三酯（TG) 、总胆固醇（TCHO） 、高
密度脂蛋白胆固醇（HDL）、低高密度脂蛋白胆 固醇（LDL) ➢ 总胆红素(T-BIL)、直接胆红素(D-BIL) ➢ 肌损伤：乳酸脱氢酶（LDH） 、肌酸激酶（CK） ➢ 离子：Ca2+、IP、K+、Na+、Cl➢ 其他特征性指标
❖ 经口给药(by orally)：灌胃(i.g)、灌服胶囊、掺入饲料、 掺入饮水；
❖ 注射给药(by injection)：肌肉注射(im)、静脉注射(iv) 输注（ infusion）、腹腔注射(ip)、皮下注射(sc) 等；
❖ 皮肤给予(topical application)：包括开放、半封闭、封 闭给药；