不同培养基及激素配比对小麦成熟胚离体培养的影响

不同培养基及激素配比对小麦成熟胚离体培养的影响
王新国,任江萍
　(河南农业大学国家小麦工程技术研究中心,河南郑州450002)
摘要　[目的]建立适于优良小麦品种遗传转化的高效组织培养再生体系。

[方法]以小麦品种豫麦18和豫麦70成熟胚为外植体,探讨了2种培养基和4种激素配比对小麦成熟胚离体培养的影响。

[结果]L 3培养基的平均愈伤组织诱导率和分化率都明显高于MS 培养基,供试2个品种平均出愈率达91.0%以上,平均分化率达46.4%。

不同激素及其配比均可诱导小麦成熟胚愈伤组织分化,但不同处理分化率差别很大(10.5%～50.0%);以L 3为分化培养基,同时添加2,42D 0.1m g/L ,62BA 1.5m g/L 的激素配比更有利于愈伤组织的分化,平均分化率达到50.0%。

[结论]MS 、L 3两种基本培养基对小麦成熟胚愈伤组织诱导率均比较高,且差别不大。

不同激素配比对小麦成熟胚愈伤组织分化率影响很大。

关键词　小麦;成熟胚;培养基;植株再生中图分类号　S512.1 文献标识码　A 文章编号　0517-6611(2008)06-02240-03E ffect of Different M edia and H ormone P roportioning on the I n V itro Culture of M ature Wheat Embryo W ANG X in 2guo et al (H enan Agricultural University/Chinese National Engineering Research C enter for W heat ,Z hengzh ou ,H enan 450002)
Abstract [Objective]T he study aim ed to establish high 2efficiency tissue culture regeneration system suitable for the genetic trans form ation of g ood wheat varieties.[M eth od]W ith m ature embry os of wheat varieties Y um ai 18and Y um ai 70as ex plants ,the in fluences of 2m edia and 4h orm one proportioning on the in vitro culture of m ature wheat embry o were discussed.[Result ]T he average induction and differentiation rates of callus on L 3m edium were obvi 2ously higher than that on MS m edium ,the average callus rate of 2tested varieties was over 91.0%and their average differentiation rate was up to 46.4%.Different h orm ones and their proportioning could induce the differentiation of callus from m ature wheat embry o ,but am ong different treatm ents ,there was great difference of differentiation rate (10.5%～50.0%).L 3as differentiating m edium w ith h orm one proportioning of 2,42D 0.1m g/L and 62BA 1.5m g/L was m ore fav orable for the differentiation of callus and the average differentiation rate reached 50%.[C onclusion]T he tw o basic m edia of MS and L 3had higher induction rate of callus from m ature wheat embry o w ith little difference.T he in fluences of different h orm one proportioning on the differentiation rate of callus from m atural wheat embry o were great.K ey w ords W heat ;M ature embry o ;M edium;Plant regeneration
基金项目　河南省自然科学基金(0411032200)。

作者简介　王新国(1965-),男,山西晋城人,硕士,农艺师,从事转基
因作物研究。

收稿日期　2007207219
近年来,以小麦幼胚[1]、幼穗[2]、叶片[3]、根[4]等为外植体进行组织培养,都成功获得了再生植株。

其中幼胚是最常用的外植体,但取材受季节限制,必须在开花后10d 左右,而小麦成熟胚取材方便,不受季节限制,因而逐渐被用作外植体培养。

以成熟胚为外植体进行遗传转化,在其他作物上已有报道
[5-7]
,但在小麦上尚极少见到。

为提高小麦成熟胚的
出愈率和植株再生率,人们做了不少研究[8-11],在成熟胚形成愈伤组织的能力和分化能力受基因型影响,愈伤组织继代时间长不利于分化等方面,研究者们的观点是一致的。

但在使用激素浓度和种类方面,研究结果却有很大差异。

为此,笔者在前人研究基础上,采用两个平行试验,以小麦品种豫麦18、豫麦70的成熟胚为外植体进行离体培养,旨在研究不同培养基及激素配比对小麦成熟胚离体培养的影响,建立高频小麦植株再生体系,为进一步转基因研究奠定基础。

1　材料与方法
1.1　材料　选用生产上大面积推广的小麦品种豫麦18、豫
麦70为试材,由国家小麦工程技术研究中心提供。

1.2　种胚的剥取　取一定量的小麦种子置于烧杯中,先用
清水洗净,再于75%的酒精中消毒5min ,无菌水冲洗一次,换用0.1%的HgC l 2消毒25min ,无菌水冲洗5～6次后于无菌水中浸泡16～20h 。

接种前再用0.1%的HgC l 2消毒5min ,无菌水冲洗4～5次。

在超净工作台中用解剖镊剥取成熟胚盾片,向上接种于愈伤组织诱导培养基上。

每盘接种20～30枚成熟胚,重复3次。

1.3　培养基
1.3.1　不同培养基对小麦成熟胚离体培养的影响。

基本培
养基:分别为MS [12]和L 3[13]培养基。

诱导和继代培养基:基本培养基+4mg/L 2,42D 。

分化培养基:基本培养基+0.1
mg/L 2,42D +0.5mg/L 62BA +500mg/L 水解酪蛋白。

1.3.2　不同激素配比对小麦成熟胚离体培养的影响。

基本
培养基:L 3培养基。

诱导和继代培养基:L 3培养基+4mg/L
2,42D 。

分化培养基:因所加入激素配比的不同,形成4种分
化培养基:①L 3+2mg/L K T +0.1mg/L IAA ;②L 3+1mg/L K T
+0.1mg/L IAA ;③L 3+1mg/L 62BA +0.1mg/L 2,42D ;④L 3+1.5mg/L 62BA +0.1mg/L 2,42D 。

以上所有培养基均添加30g/L 蔗糖和7g/L 琼脂粉,用
NaOH 调pH 值至5.5～5.8,在121℃下经1.1kg/cm 2高压湿
热灭菌20min 。

1.4　培养条件　剥取的成熟胚盾片朝上接种于愈伤组织诱
导培养基上,(25±1)℃暗培养14d ,然后转入继代培养基中再培养14d 。

同时统计不同品种及不同培养基的出愈率和每个愈伤组织的平均鲜重。

14d 后挑选生长良好的胚性愈伤组织转入分化培养基进行光照培养,光强1500～2000lx ,每天光照16h ,培养温度(25±2)℃,每隔14d 继代1次,35～
40d 后统计愈伤组织分化率,待分化出的绿芽长至2～3cm
时,转至生根培养基中生根。

1.5　数据分析　采用DPS 统计分析软件进行方差分析。

2　结果与分析
2.1　不同培养基对小麦成熟胚愈伤组织诱导和分化的影响
　愈伤组织在接种第3天开始形成,从7d 后两种培养基上愈伤组织大小(图1)来看,MS 培养基上的愈伤组织比L 3培养基上的稍大一些。

14d 后统计愈伤组织诱导率(表1),结果表明,小麦成熟胚在两种培养基上都可诱导愈伤组织的产
安徽农业科学,Journal of Anhui Agri.Sci.2008,36(6):2240-2242 责任编辑　李菲菲　责任校对　李菲菲
生,且平均诱导率都较高。

MS 培养基为91.9%,L 3培养基为
95.3%,均超过90%,但随培养时间的延长,愈伤组织的质量
发生了明显变化。

MS 培养基上产生的愈伤组织较松散,呈水泡状,多为非胚性愈伤组织,而L 3培养基上形成的愈伤组织结构较致密,呈结节状,为胚性愈伤组织。

这一结果从培养过程中愈伤组织的增重速率也可看出(表2),不论是豫麦
18还是豫麦70,L 3培养基上愈伤组织的增重速率显著大于MS 培养基,而两者大小基本相同,说明L 3培养基上形成的愈
伤组织致密。

方差分析表明,
两者差异达显著水平。

图1　两种培养基上愈伤组织大小比较
Fig.1Comp arison o f calli grow th on MS and L 3medium
表1　不同培养基愈伤组织诱导率比较
T ab le 1Comp arison o f induction rate from m ature embryos at di fferent media
培养基M edium 品种
Cultivar 接种胚数
N o.of embry os 出愈数
N o.of callus
诱导率∥%
Induction
rate
平均诱导
率∥%
M ean induction
rate
MS
豫麦18
108 98
90.7 91.9
Y umai 18
豫麦70
11510793.0Y umai 70L 3
豫麦18
10610094.395.33
Y umai 18
豫麦70
108
104
96.3
Y umai 70
诱导培养28d 后挑选生长良好的胚性愈伤组织转到分化培养基中培养,愈伤组织10d 左右就开始分化,先形成绿点,继而长成苗。

35～40d 后统计愈伤组织在两种分化培养基上的分化率(表3)。

从表3可看出,两种培养基都可诱导愈伤组织的分化,但两者平均分化率有显著差异,在L 3培养
基中培养的愈伤组织其分化率(46.43%)明显高于MS 培养基(28.30%),说明在促进愈伤组织分化方面,L 3培养基明显优于MS 培养基。

表2　培养过程中成熟胚愈伤组织平均鲜重
T ab le 2Mean fresh w eight o f calli from m ature embryos
培养基
M edium 品种
Cultivar
第一次转移
(14d )∥mg
F irst trans ferring 第二次转移(28d )∥mg
S econd trans ferring 平均鲜重∥mg
M ean fresh
weight
MS
豫麦18
41.765.0 65.5
Y umai 18
豫麦70
42.166.0Y umai 70
L 3
豫麦18
71.398.798.93
Y umai 18
豫麦70
71.0
99.0
Y umai 70
表3　不同分化培养基愈伤组织分化率比较
T ab le 3Comp arison o f callus di fferatiation rate from m ature embryos on
di fferent media
培养基
M edium 品种
Cultivar 愈伤组织数N o.of calli
绿芽数
N o.of green spots
分化率∥%Differati ation rate 平均分化率∥%
M ean differa 2tiation rate MS
豫麦18
4011
22.5 28.3
Y umai 18
豫麦70
441534.1Y umai70
L 3
豫麦18
421842.946.43Y umai 18
豫麦70
42
21
50.0
Y umai70
2.2　不同激素配比对小麦成熟胚离体培养的影响　将成熟
胚愈伤组织转到不同激素组合的分化培养基上进行分化培养,其结果见表4。

从表4可见,不同激素及其配比都可诱导小麦成熟胚愈伤组织分化,但不同处理分化率差别很大
(10.5%～50.0%),表现为随细胞分裂素浓度增加,即浓度由1.0mg/L 增加到1.5～2.0mg/L 时有利于植株的分化,两供
试品种表现出相同的趋势。

方差分析表明,0.1mg/L 2,42D 和1.5mg/L 62BA 的激素配比,愈伤组织分化率最高且差异达到显著水平。

表4　不同激素配比对小麦成熟胚愈伤组织分化率的影响
T ab le 4E ffect o f di fferent hormone ratios on di fferatiation rate from m ature embryos o f w heat
激素配比∥mg/L
H orm one ratios 豫麦18Y umai 18
愈伤组织数
N o.of calli
分化数
N o.of buds
分化率∥%
Differatiation rate
豫麦70Y umai 70
愈伤组织数
N o.of calli
分化数
N o.of buds
分化率∥%
Differatiation rate
IAA/K T 0.1/2.027 9
33.3ab
28 11
39.3ab
IAA/K T 0.1/1.019210.5b 25832.0b 2,42D/62BA 0.1/1.025624.0ab 481122.9ab 2,42D/62BA 0.1/1.5
28
14
50.0a
23
10
43.5a
3　结论与讨论
试验结果表明:MS 、L 3两种基本培养基对小麦成熟胚愈伤组织诱导率都较高,且差别不大,这与前人研究结果相
符[14],但就愈伤组织分化率来看,L 3培养基(46.4%)明显高于MS 培养基(28.3%),且无论是出愈率,还是愈伤组织分化率,L 3培养基都显著高于MS 培养基。

分析两种培养基成分,
1
42236卷6期 王新国等　不同培养基及激素配比对小麦成熟胚离体培养的影响
大部分元素相同,而有机成分的差别较大,特别是VB1含量, L3中VB1含量是MS中的100倍,且有研究认为,VB1在组织培养中有助于诱导胚性愈伤组织的形成[15],这可能是导致两者形成愈伤组织差异的直接原因。

不同激素配比对小麦成熟胚愈伤组织分化率影响很大,就试验采用的4种配比来看,L3培养基添加0.1mg/L2,42D 和1.5mg/L62BA可作为理想的小麦成熟胚愈伤组织分化培养基。

在IAA与K T配比试验中,从前人研究[14]中得知IAA 浓度在0.1mg/L时愈伤组织分化率较高,超过0.1mg/L时,随IAA浓度增加分化率降低,故试验中IAA都采用0.1mg/L 的浓度。

在2,42D与62BA的配比试验中,已知在一定浓度范围内(1～8mg/L),2,42D浓度增加有利于愈伤组织的诱导,但不利于愈伤组织的分化,故其浓度不宜过高,一般认为4 mg/L2.42D对成熟胚愈伤组织的诱导较有利[8],分化时2,42D浓度应适当降低,一般采用0.1mg/L。

高浓度2,42D 对愈伤组织的分化不利,而细胞分裂素能拮抗高浓度2,42D 对愈伤组织分化的抑制作用,2,42D在较低的浓度条件下,细胞分裂素却不表现拮抗作用[16]。

因此可以推测,2,42D可开启有关细胞分裂的基因,使细胞分裂增殖,但同时抑制了有关分化基因的表达。

而细胞分裂素使细胞分裂的同时,主要是促进有关分化基因的表达,使细胞朝着分化为器官的方向发展,只有高浓度2,42D才表现出对分化的抑制。

其原因可能是2,42D浓度高,消耗慢,长时间作用于愈伤组织,导致分化率降低,所以细胞分裂素也只能在这种情况下才表现出对2,42D的拮抗作用。

前人研究认为[14],62BA浓度在2mg/L 时愈伤组织分化率较高,低于或高于2mg/L,分化率都会下降,但该试验采用了1mg/L与1.5mg/L两个梯度,从结果看, 62BA浓度为1.5mg/L时愈伤组织分化率较高。

因此,在小麦成熟胚离体培养研究中,建议采用低浓度2,42D诱导愈伤组织,分化培养基中降低生长素浓度,提高细胞分裂素浓度。

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(上接第2239页)
2.4　移栽　将组培苗移出培养室,在室温下放置7d,取出幼苗,洗净根部残留培养基,移栽入培基质[珍珠沙∶花泥为1∶1(V∶V)混合],温度控制在20～28℃,每天喷雾,使培养室内湿度保持在75%～90%。

移栽成活后,每隔3～5d施复合肥1次。

光照时间保持在每天10h以上。

经过30d的培养,幼苗成活率达到91%,形成的幼苗如图1f所示。

3　结论
该研究利用叶片、花穗、叶柄、气生根为外植体诱导产生愈伤组织,叶片、叶柄以及组培苗气生根均能成功地诱导产生愈伤组织,叶片诱导率最高达92%;越靠近叶柄部分和带有叶脉的叶片,就越容易诱发产生愈伤组织;用该研究获得的组培苗气生根为外植体,愈伤组织诱导率可达82%。

而花穗消毒不易彻底,污染率较高。

组培苗气生根数目多,气生根的摘取对植株影响最小。

因此,利用气生根作为外植体进行规模化再生植株可以极大地节约成本。

从外植体诱导产生愈伤组织,分化出芽,生根形成试管苗,最快需55～60d,缩短了繁殖周期。

该研究为工厂化生产安祖花幼苗提供了依据,也为进一步开展安祖花转基因技术的研究打下了坚实的实验基础。

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