淫羊藿苷对环磷酰胺诱导生精障碍大鼠下丘脑-垂体-睾丸轴的影响

CHINESE JOURNAL OF ANATOMY Vol. 41 No. 2 2018解剖学杂志2018年第41卷第2期
淫羊藿苷对环磷酰胺诱导生精障碍大鼠下丘脑垂体睾丸轴的影响
(1
福建医科大学基础医学院解剖学与组织学胚胎学系，福州350004; 2福州儿童医院检验科，福州350005)
摘要目的：探讨淫羊蕾苷在环磷酰胺诱导的大鼠睾丸生精障碍动物模型中的作用，研究淫羊蕾苷对下丘脑-垂体-睾丸轴
的影响。

方法:大鼠分为空白对照组、阴性对照组、模型组、淫羊蕾苷治疗组；H -E 染色观察睾丸组织结构变化,T U N E L 检 测睾丸生殖细胞凋亡，放射免疫法检测血清睾酮、卵泡刺激素(F S H )、黄体生成素(L H ), SA B C 免疫组织化学研究下丘脑正 中隆起促性腺激素释放激素(G n R H )神经纤维。

结果:睾丸H -E 染色切片观察显示模型组睾丸生精小管直径缩小，间距增 宽,生精上皮变薄，生殖细胞数量减少，生精小管多未见精子形成，与空白对照组比较其生精小管结构变化显著;治疗组与 模型组比较生精小管壁增厚，含有精子的生精小管明显增多。

模型组与空白对照组比较，睾丸生精小管中生殖细胞凋亡显 著增多;治疗组与模型组比较生精小管中生殖细胞凋亡数量明显减少。

血清睾酮检测结果显示模型组与空白对照组比较 血清睾酮明显降低;治疗组与模型组比较其血清睾酮明显增加;血清F S H 、L H 水平各组间无差异。

与空白对照组比较，模 型组正中隆起G n R H 阳性纤维增多,染色深，光密度显著增高;治疗组与模型组比较其G n R H 阳性纤维明显减少，染色浅。

结论:淫羊蕾苷具有改善睾丸生精小管结构、减少生殖细胞凋亡、促进精子发生和间质细胞分泌睾酮的功能，降低G n R H 在 正中隆起的蓄集。

关键词睾丸；下丘脑'淫羊蕾苷'环磷酰胺'生精障碍'睾酮'大鼠
G aoXueyong1，LinShan2, Han Misha1
(!. D epartm en t o f A n atom y , H isto lo g y a n d E m b r y o lo g y , F u jia n M e d ic a l U n iv ersity , F u zh ou
350004 '
<.D epartm en t o f C lin ical b a b r r a tr r y , F u zh ou C h ild ren H o s p it a l , F u zh ou
350005 , C hina)
Abstract
O bjective ： To explore the role of icariin in the animal models of the cyclophosphamide-induced rat testis
spermatogenic failure, and study the effects o f icariin on the hypothalamus-pituitary-testicular axis. M eth od s ： Rats were divided into blank control
group,
negative control
group,
model
group
and icariin
treatment
group.
observe the morphological structural changes in testicular tissue. T U N EL method was used to detect the apoptosis of testicular germ cells. Serum testosterone, follicls-stimulating hormone (F S H ) and luteinizing hormone (L H ) levels were detected by radioimmunoassay. GnRH nerve fibers in median eminence of the rat h ypothalamus were detected by SABC immunohistochemistry. R esults ： H -E staining observation of testicular tissue in model group rats showed the testis seminiferous tubule diameter
narrowed,
the
spacing between seminiferous
tubules widened, and the
became thinner. The number of germ cells decreased, and sperm was rarely found in seminiferous tubules. Compared with blank control group , there was significant change in seminiferous tubules. Compared with model group , treatment group showed signs of thickening seminiferous tubule epithelium and significant increase of seminiferous tubules with sperms. Model group showed obvious
increase of
germ
cell apoptosis in
testicular seminiferous
tubules compared
Treatment group showed obvious decrease of germ
cell
apoptosis in seminiferous
tubules compared
testosterone of the model g roup was significantly decreased compared with the blank control group ； serum testosterone of treatment group was
significantly increased
compared with model group. There was
no significant
difference
L H level between these groups. GnRH-positive fibers in the median eminence of model group showed signs of increased GnRH-positive fibers , deeper s taining and significant change in optical density compared with blank control group. Compared with model group , treatment group showed signs of reduced GnRH-positive fibers and lighter staining. There were no significant differences in all the parameters between the negative control group and the blank control group. Conclusion ：Icariin improves the testicular s eminiferous tubule structure , and promotes spermatogenesis and testosterone secretion of
高学勇1林珊2韩咪莎1
Effects of icariin on hypothalamus-pituitary-testicular axis of rat with
impaired spermatogenesis induced by cyclophosphamide*
doi: 10, 3969/j, issn, 1001-1633, 2018, 02, 005 "福建省自然科学基金（2015J01676)
第 1 作者 E-mail: gxy5403@163. com 收稿日期：2017-08-10;修回日期：2017-12-10
Leydig cells. Icariin reduces the apoptosis of the testicular germ
cells and the content of GnRH in the median eminence.Key words
testis ； hypothalamus; icariin; cyclophosphamide;
impaired spermatogenesis ； testosterone ； rat
147
全世界约15%的育龄夫妇被不育不孕所困扰，其 中约50%为男性不育()。

最近50年间，人类的精子质 量不断降低，生殖能力也明显下降;男性不育多为生精障 碍，表现无精症和少精症，其病因复杂，目前治疗方法很 多，但效果均不太理想。

环磷酰胺（cyclophosphamide)是一种烷化剂类药物，是常用的抗肿瘤药物和免疫抑 制剂；对男性生殖系统的损伤和对后代的潜在致畸危 险已经引起医患双方的高度关注[2]。

淫羊藿（herba epimedium)药用历史悠久，属于小蘖科淫羊藿属植物。

淫羊藿苷(icariin)是淫羊藿的主要有效成分，也是探讨 含淫羊藿苷中成药的首选成分，淫羊藿苷对免疫系统、生殖、内分泌系统等作用的研究，证实了其强大的药理 活性，这为淫羊藿用于男性不育症的治疗提供了实验 依据。

本研究采用环磷酰胺致性成熟大鼠睾丸生精障 碍模型，研究环磷酰胺损伤后，睾丸组织学变化、促性 腺激素及睾酮水平，生精上皮细胞凋亡、正中隆起促性 腺激素释放激素（gonadotropin-releasinghormone，GnRH)阳性纤维表达，探讨淫羊藿苷能否改善环磷酰 胺导致的生精障碍睾丸功能及其机制。

1材料和方法
1.1实验动物和主要试剂
清洁级雄性S D大鼠40只，15周龄，体质量300( 350 g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供;淫羊藿苷 单体(南京替斯艾么中药研究所，含量HPL098%)
环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司）细胞凋亡检 测试剂盒、SA B C试剂盒、G n R H试剂盒（武汉博士德 生物工程有限公司）D A B试剂盒(福州迈新生物技术 开发有限公司）睾酮含量放射免疫试剂盒购于北京北物 所。

1.2动物分组及给药
随机将40只SD大鼠分成4组，每组10只。

⑴空 白对照组：未经任何处理'2)阴性对照组：腹腔注射 生理盐水1 m l连续5 d后，每天皮下注射含30%二甲基亚砜的丙二醇0.5 ml 1次，共50 d。

⑴）模型组：腹 腔注射环磷酰胺#0mg i k g-1i d—1)3]连续5d后，每 天皮下注射含30%二甲基亚砜的丙二醇0. 5 ml 1次，共50 d。

（4)淫羊藿苷治疗组：腹腔注射环磷酰胺(20mg i kg-1i d-1)连续5d后，每天皮下注射淫羊藿 苷注射液(50m g.kg-1i d-i)4]】次，共 50d。

1.3取材及标本制作
各组于实验第56天，即IC A注射结束后第1天，以3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉，剖胸从右心房抽取 2m l血液，离心取血清，低温冰箱保存，待测睾酮、
F S H、L H;打开腹腔，取左侧睾丸注射4%多聚甲醛
0. 5 m l,预固定30 m in后，再固定24 h;下丘脑取材：迅 速断头，按大鼠脑立体定位图谱[5]，切取含正中隆起、第三脑室和弓状核的下丘脑脑块，用4%多聚甲醛固定 *148 *24 h。

睾丸、下丘脑脑块常规石蜡包埋，制备5 #m厚的 连续切片，用于H-E染色、生殖细胞凋亡和免疫组织化 学的观察。

1.4睾丸组织H-E染色和生殖细胞凋亡检测
取各组每只大鼠睾丸组织切片各2张，其中1张做 H-E染色，观察睾丸组织学变化：生精小管面积、直径、生殖细胞数量层次及生精小管是否含精子，同时应用 显微摄影系统PM-OBAD，进行图像分析自动测量生精 小管直径、面积;另一张应用T U N E L观察生殖细胞凋 亡，具体操作按凋亡检测试剂盒说明书进行，凋亡细胞 核呈棕黄色，光镜下随机选取10个高倍视野，计数各 视野阳性细胞数'月性对照不加末端转化酶，以试剂盒 提供的阳性对照切片作为阳性对照。

结果判定：细胞 核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞。

按 凋亡检测试剂盒说明书（T U N E L方法)检测生殖细胞 凋亡。

1.5 检测血清華酮、F SH、LH
取聚苯乙烯试管若干，编号后按试剂盒使用说明 书中加样顺序表进行加样，加样前所有试剂摇勻、并平 衡至室温。

采用电脑放射免疫法程序的四参数回归自 动处理得出结果。

1. 6免疫组织化学观察正中隆起G n R H阳性纤维
石蜡切片经脱蜡水化后，采用SA B C法检测正中 隆起G n R H阳性纤维表达情况，具体操作按SA B C法 检测试剂盒说明书进行，用P B S做阴性对照，有棕黄色 反应的为阳性。

1.7 统计学处理
应用统计软件SPSS 10. 0进行统计学分析，数据 以表示，计量资料用方差分析，计数资料用*检验。

2 结果
241 !H-E观察
空白对照组和阴性对照组睾丸生精小管直径宽，排列密集，生精上皮厚，生殖细胞层次和数量多，生精 小管均见精子形成，两者生精小管形态结构变化无统 计学意义CP>0. 05)(图1A、B)，模型组睾丸生精小管 直径缩小，间距增宽，生精上皮变薄，生殖细胞数量减 少，生精小管腔多未见精子形成，与空白对照组比较其 生精小管结构变化显著（P<0.01)图1C)淫羊藿苷 治疗组与模型组比较生精小管壁增厚，含有精子的生 精小管明显增多(P<0.01)图1D)，各组睾丸生精小 管直径、面积、生殖细胞数见表1。

2.2 睾丸生殖细胞凋亡的观察
空白对照组和阴性对照组睾丸生殖细胞凋亡较少 (图2A、B)，两组生殖细胞凋亡数量差异无统计学意义 (P>0.05)'莫型组与空白对照组比较其生殖细胞凋亡 增多(图2C)，差异有统计学意义(P<0. 01)治疗组与
表1各组睾丸生精小管直径、面积、生殖细胞数#=10,r±s)
Tab 1 Diameter，area，numberof germ cells of testis seminiferous tubule in each group #=10，x R s) Group Diameter (#m)Area (#m2)Number of germ cells (layer) Blank control group271. 26 士 6. 8352 380. 62士2 761. 847. 45 士0. 63
Negative control group279. 87士6. 9853 461.13士2 803. 527. 61 士0. 59 Model group210. 25士9. 38%%38 514. 23士3 751. 18%% 3. 96士 1. 51%% Icariin treatment group241. 16 士 10. 01##47 025.12士3 933. 07## 5. 84士 1.87##
N〈0, 01 blank control group; AAN〈0, 01 汐5model group
模型组比较生殖细胞凋亡数量明显减少（N〈0.01)(图
2D,表 2)。

2.3 正中隆起G n R H阳性纤维观察
空白对照组和阴性对照组G n R H阳性纤维较少，
染色浅(图3A、B)，两组阳性纤维光密度差异无统计学
意义(N>0. 05);模型组与空白对照组比较其阳性纤维
增多，染色深(图3C)，光密度变化有统计学意义（N〈
0.01)治疗组与模型组比较其G n R H阳性纤维明显减
少，染色浅(N〈0.01)图3D，表2)。

表2各组生殖细胞凋亡数、GnRH阳性纤维光密度#=10,；Q±s)
Tab 2 The number of germ cell apoptosis and optical density
of GnRH-positive fibers in each group (=10，x R s)
Group
Number of
apoptotic cells
Optical density
Blank control group0. 48 士 0. 210.011 士 0.002 Negative control group0. 46 士0. 230.012士 0.004 Model group 3. 22士0. 67%%0.017 士 0.005%% Icariin treatment group 2. 18士0. 69##0.010士 0.001##
P〈0. 01 w blank control group；##P〈0.01 model group 2.4 血清睾酮、卵泡刺激素（FSH)及黄体生成素(L H)检测
空白对照组和阴性对照组血清血睾酮水平差异无 统计学意义(P>0. 05);模型组与空白对照组比较血清 睾酮明显降低，差异有统计学意义（P〈0. 01)治疗组 与模型组比较其血清睾酮明显增加（P〈0. 01)，血清 F SH、L H水平各组间差异无统计学意义(表3)。

3讨论
睾丸是产生精子和分泌睾酮的重要器官，既受神 经内分泌免疫网络调控，也受到睾丸自身分泌的各种 细胞因子的调控；本研究选用15周龄性完全成熟大鼠，用药超过50 d后，处理动物，因大鼠精子发生所需 时间为50(60 d，以便观察环磷酰胺和淫羊藿苷对睾 丸生殖细胞的影响，探讨一个精子发生周期的变化。

环磷酰胺是常用的抗肿瘤药物和免疫抑制剂，容 易导致精子DN A损伤、少精症、后代畸形;环磷酰胺能 诱导睾丸生精障碍，本实验建模成功，说明环磷酰胺可
表3各组大鼠血清睾酮、FSH、L H水平0Q±s)
Tab 3 SerrnnTestosterone，FSH and LH levels in each group (x R s)
Group Testosterone (ng/ml)FSH (mIU/ml)L H(m IU/m l$
Blank control group 3. 541 士0. 6320. 215 士 0. 0210. 160士0. 049 Negative control group 3. 442 士 0. 5170. 210士0. 0360. 175士0. 051 Model group0. 928士0. 701%%0. 197士0. 0980. 179士0. 062 Icariin treatment group8. 516 士 3. 012##0. 208士0. 0390. 163士0. 057
P〈0, 01 t5 blank control group; AAP〈0, 01 t5 model group
作为建立生精障碍动物模型的药物，结合本人前期的 研究和已发表的论文[6]，其机制为诱导生精细胞凋亡，干扰A型精原细胞自我更新增殖及分化功能，损伤精 子发生微环境，环磷酰胺损伤生殖细胞遗传物质，同时 具有生殖毒性，引起睾酮水平降低、生殖细胞数目减少(]。

从本实验结果观察，淫羊藿苷对环磷酰胺诱导生 精障碍大鼠睾丸生精小管结构有明显改善作用，减少 生精细胞凋亡，促进精子发生，模型组血清睾酮水平显 著降低，淫羊藿苷治疗组血清睾酮水平明显提高，说明 淫羊藿苷有明显的性激素样作用可直接刺激性腺(]，肾阳虚小鼠血清睾酮含量，性腺雄激素受体m R N A和 蛋白质的表达与正常组相比均有所下降，淫羊藿苷能够抑制其下降，缓解肾阳虚症状，因缓解肾阳虚小鼠睾 酮及性腺雄激素受体基因的表达下调(]。

通过观察淫羊 藿苷对衰老大鼠睾丸组织基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶=(MMP-9 )表达的影响，显示淫羊藿 苷对D-半乳糖所致的衰老大鼠睾丸损伤有明显的保护 作用，其机制可能与上调MMP-2、MMP-9水平有关(0]。

黄酮类药物具有抗氧化、抗肿瘤和抗炎等作用，淫羊藿苷是黄酮类药物的一种，具有保护血管内皮细 胞的作用，减少内皮细胞凋亡[11]。

淫羊藿苷能减少生 精细胞凋亡，促进精子发生，淫羊藿苷可通过调控蛋白 激酶B(protein kinase B，A K T)通路，进一步增加p-A K T蛋白的表达，从而抑制P53蛋白表达，抑制活性 氧（reactive oxygen species，ROS)和保护线粒体膜电
149
^1. /
100^m
l O O u m
l〇〇w m
100n m
•.‘人、，V
图1睾丸组织观察，H-E染色，标尺= 100#m，X100。

A:空白对照组;B:阴性对照组;！模型组;D:淫羊藿苷治疗组.
7睾丸胞凋亡的观察，T U N E L，标尺= 100#m，X100。

（：凋亡细胞。

A:空白对照组;B:阴性对照组;C:模型组;D:淫羊藿苷治疗组.
图3正中隆起(））G n R H阳性纤维观察，SA B C法，标尺= 100#m，X100。

（：G n R H阳性纤。

A:空白对照组;B:阴性对照组；
C:模型组;D:淫羊藿苷治疗组.
Fig 1 Observation of testicular tissue, H-E staining, b ar=100 #m，X100. A：Blank control group；B：Negati Model group；D: Icariin treatment group.
Fig 2 Observation of germ cell apoptosis in testicular seminiferous tubules，TU N EL method, b ar=100 #m，X100.个：Apoptotic cells. A: B lank control group ；B：Negative control group ；C: Model group ；D: Icariin treatment group.
Fig 3 Observation of GnRH-positive fibers in median eminence ()$，SABC method，b a r= 100 #m，X 100.个：GnRH-positive fibers. A：B lank control group ；B：Negative control group ；C：Model group ；D：Icariin treatment group.
位，抑制细胞色素C释放和caspase-3活化，从而抑制 胞凋亡，淫羊藿苷还 S-亚硝基
胞凋亡的作用[12]-不同哺乳动物的G n R H神经 分布明显不同，人类 分布于弓 和视 ，而物在弓 中几乎不能检测到G n R H神经元，与本实验结果相符合％ 物最明显的G n R H神经的组成神经元形 连续的 视
通路[13]，通过免疫细胞化学观察，显示模 型组大鼠正中隆起处G n R H阳性纤维的光
加，正中隆起是G nR H分泌的 通路，参与垂 性腺激素合成和释放的 ，在正中隆起 或 I G nR H神经末梢，能够影响G n R H向垂体门脉系统的 释放，低水平睾酮能促进G nR H神经元合成，增加轴浆 ，同时，环磷酰胺可能抑制G nR H神经纤维末梢释 放GnRH，使G nR H并没 部进人垂
G n R H的蓄集；而淫羊藿苷治疗组L G n R H在正中隆起的蓄，高水平睾酮能抑制G nR H神经元合成，减少轴 （14]。

本 结果显示各组血清F S H、L H水平无显 ，与 保等(N]结果相似，但并不能说明环磷酰胺和淫羊藿苷对 腺垂 性腺细胞没有直接作用，因垂体-性腺轴在负反馈调节 ，睾酮水平降低能促进腺垂 •
150
叶促性腺细胞分泌F SH、L H，睾酮水平提高负反馈调 节促性腺细胞分泌F S H、L H减少，而F SH、L H的分 泌也受G n R H的调控，故各组F S H和L H维持相对平 衡。

总之，本研究结果表明，环磷酰胺能诱导睾丸生精 障碍，促进生殖细胞凋亡，淫羊藿苷可改善睾丸生精小 管结构，促进精子发生，减少生殖细胞凋亡，为男性不 育症中药治疗提供理论依据，具有重要的临床意义。

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