第6章基因操作中大分子的分离和分析

①溶菌酶:溶菌酶是糖苷水解酶，水解菌体 细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β -1， 4糖苷键，因而具有溶菌作用。
葡萄糖:葡萄糖增加溶液粘度，维持渗透 压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。
EDTA:EDTA螯合Mg2+和Ca2+等金属离子， 抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用, 同时有利于溶菌酶的作用。
与常规的直流单向电场凝胶电泳不同，这项技术采用定时改变
电场方向的交变电源，每次电流方向改变后持续1秒到5分钟
左右，然后再改变电流方向，反复循环，所以称之为脉冲式
交变电场。
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五、DNA片段的纯化
根据实验要求不同，有时需要高纯度的 DNA，对提取的DNA样品须进一步纯化并 除去溴化乙锭(EB)。常用的DNA纯化方法有： 低熔点琼脂糖凝胶电泳法、透析袋电洗脱法、 氯化铯-溴化乙锭连续梯度离心法、离子交换 层析法、 “基因纯”试剂纯化等。
DNA分子在凝胶介质中泳动时有电荷效应和 分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶 液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于 糖一磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数 量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此 它们能以同样的速度向正极方向移动。在一 定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决 于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构 型。
天然DNA来源:
①染色体DNA。 ②病毒和噬菌体DNA。 ③质粒DNA。 ④线粒体和叶绿体DNA。
一、大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化
分离质粒DNA的方法众多， 其依据 是利用分子大小不同、碱基组成的差异 以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结 构的特点来进行分离。目前常用的有碱 裂解法、煮沸法、去污剂 (如Triton或 SDS)裂解法、羧基磷灰石柱层析法、质 粒DNA释放法、酸酚法等。
3）构型
在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影 响，使超螺旋(SC)的共价闭合环状(CCC)结 构的质粒DNA的一条链断裂，变成开环状 (OC)分子，如果两条链发生断裂，就转变为 线状(L)分子。这3种构型的分子有不同的迁 移率。在一般情况下，超螺旋型分子迁移速
度最快，其次为线状分子，最慢的为开环状 分子。当提取到的质粒DNA样品中还有染色 体DNA或RNA时，在凝胶电泳上也可以分别 观察到电泳区带，由此可分析样品的纯度。
EB荧光分析法
EB荧光染料能插入DNA或RNA的碱基对平面 之间并结合在上面，在紫外光的激发下产 生桔黄色荧光。由于结合于DNA分子之上 的EB的量与DNA分子长度和数量成正比， 则荧光强度可以表示DNA量的多少。
将标准DNA溶液按浓度由低到高分别与同 样体积的EB溶液混匀在一块黑色的点样板 上形成一个浓度梯度，然后将待测DNA也 与同样体积的溴化乙锭混匀，最后将待测 样品与标准品在紫外灯下发出的荧光强度 进行比较，就能测出该样品总DNA浓度。
1 碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA原理
◆碱裂解法由Birnboim和Doly设计并于1979年 发表，基于染色体DNA与质粒DNA变性与复 性的差异而达到分离目的。
◆在pH高达12.5的碱性条件下，染色体DNA的 氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒 DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭 合环状的两条互补链不会完全分离。
第六章 基因操作中大分子的分离和分析
第一节 DNA的分离、检测和纯化 第二节 RNA的分离、检测和纯化 第三节 分子杂交 第四节 RNA作图和端点分析 第五节 重组DNA分子导入大肠杆菌
本课件是在网络资源基础上改进而成，在此对有关人士特致感谢！
第一节 DNA的分离、检测和纯化
一、大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化 二、DNA的琼脂糖凝胶电泳 三、聚丙烯酰胺凝胶电泳 四、脉冲场凝胶电泳 五、DNA片段的纯化
EB是嫌疑性的致突变物质。
第二节 RNA的分离、检测和纯化
细胞中的核酸：DNA和RNA。 RNA：rRNA、 tRNA、 mRNA 。 一个典型哺乳动物细胞约含10-5μg RNA。
－80%～85% rRNA(28S、18S、5S rRNA)。 －15%～20%低分子量RNA(如tRNA、核内小分子 RNA等）。
透析袋电洗脱法
适用于小剂量DNA纯化和酶切DNA片段回收。 DNA样品在琼脂糖凝胶电泳分带。 切取含待纯化DNA带的琼脂糖凝胶块，装入透析袋，
进行电泳1-2h后，再反向电泳1-2min。 吸取透析袋中的洗脱液于离心管中离心。 转移上清液到另一离心管中，加入2倍体积无水乙
醇混匀，于-20℃放置过夜沉淀后，离心后上清液， 最后把沉淀物溶于TE缓冲液中，-20℃保存备用。
2）相对分子质量
具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速 度不一样，可进行分离。
DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数 值成反比关系。
DNA样品与已知相对分子质量大小的标准 DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离， 就可获知该样品的相对分子质量大小。
凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的 DNA，也可以鉴别相对分子质量相同但构型 不同的DNA分子。
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DNA的浓缩
当提取的DNA溶液的浓度达不到 实验要求时，必须进行DNA溶液的浓缩。 实验室常用的方法有： 乙醇沉淀法、 正丁醇抽提法和聚乙二醇浓缩法等。
（四）DNA的定量和纯度测定
DNA样品的浓度的测定，一般采用紫外光谱 分析、EB荧光分析、水平式琼脂糖凝胶电泳 法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法和脉冲电泳法等。
3）琼脂糖凝胶电泳的操作过程
E、加样和电泳： 将胶板放入电泳槽，注入缓冲液，使液
面高于胶面1-2mm，排出加样孔内的气泡， 用微量移液枪加入DNA样品。接通电源，调 好电压和电泳时间。可根据溴酚兰的位置结 束电泳，关闭电源。 F、取出凝胶，置于紫外投射仪上，调好相机 焦距拍照
3）琼脂糖凝胶电泳的操作过程
pET28c(+)电泳结果
碱抽提法所用试剂的生化作用
提取过程中所用的材料有LB培养基、葡萄糖 /Tris/EDTA溶液(5Ommol/L葡萄糖；25mmol/L Tris•HCl；pH8.0，lOmmol/L EDTA)、TE缓冲 液、3mol/L乙酸钾溶液、NaOH-SDS溶液、溶 菌酶液、异丙醇、100%乙醇和70%乙醇等。
③KAc: pH4.8的KAc溶液是为了把pHl2.6的 抽提液调节至中性，使变性的质粒DNA能 够复性，并能稳定存在。
高盐3mol/L KAc有利于变性的大分子染 色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物的凝 聚而沉淀。染色体DNA因为中和了核酸上 的电荷，减少相斥力而互相聚合，钾盐 与RNA、SDS-蛋白复合物作用后，形成钾 盐形式复合物，使沉淀更完全。
②NaOH-SDS液:NaOH浓度为0.2 mol/L，加 抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因 而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。
SDS是离子型表面活性剂，它可以溶解细 胞膜上的脂质与蛋白，因溶解膜蛋白而 破坏细胞膜、解聚细胞中的核蛋白，还 能与蛋白质结合成为R-O-S03-…R+一蛋白 质的复合物,使蛋白质变性沉淀下来。
紫外光谱分析法
紫外光谱分析法的原理基于DNA(或RNA) 分子在260nmm处有特异的紫外吸收峰 且吸收强度与系统中DNA或RNA的浓度 成正比。分子形状、双链与单链之间的转 换也会导致吸收水平的改变，但是这种偏 差可以用特定的公式来校正。该法的特点 是准确、简便，但所需仪器较昂贵。
衡量所提取DNA的纯度可用OD260与OD280的比 值,OD260/OD280对DNA而言其值大约为1.8。
紫外线光源灵敏度: 302nm>254nm>366nm
三、聚丙烯酰胺凝胶电泳 特点：
分辨率高 适于寡聚核苷酸及DNA序列分析，DNA<500bp 载样量大 回收DNA纯度高
四 、 脉 冲 场 凝 胶 电 泳 (pulsed-field gel electrophoresis PFGE)
④无水乙醇:沉淀DNA，它的优点是可以任 意比例和水相混溶，且乙醇与核酸不会 起任何化学反应，对DNA很安全。DNA溶 液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙 醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使 DNA失水而易于聚合。
⑤酚-氯仿:酚与氯仿是非极性分子，水是 极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混 合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚 或氯仿挤去，使蛋白质失去水合状态而 变性。经过离心，变性蛋白质的密度比 水的密度大，因而与水相分离，沉淀在 水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分 开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保 留在最下层。
⑥异戊醇:异戊醇能降低分子表面张力，能 减少抽提过程中泡沫的产生。同时异戊 醇有助于分相，使离心后的上层水相、 中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维 持稳定。
2 通过试剂盒分离纯化大肠杆菌质粒DNA
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二、DNA的琼脂糖凝胶电泳
1、凝胶电泳的基本原理
当OD260/OD280大于1.8则可能有RNA污染。
当OD260/ OD280小于1.8时则有蛋白质污染。
双链DNA的OD260为 1时相当于浓度为 50μg/mL。
单链DNA的OD260为 1时相当于浓度为 40μg/mL。
寡核酸的OD260为 1时相当于浓度为2040μg/mL。
一种分子被放置到电场中，它就会以一定的 速度移向适当的电极。它与电场强度和电泳 分子本身所携带的净电荷数成正比。就是说， 电场强度越大，电泳分子所携带的净电荷数 量越多，其迁移的速度越快，反之则较慢。
电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电 泳迁移率。
2、影响电泳迁移速率的因素：
1 ） 分子筛效应
2）影响电泳迁移的主要因素：
◆DNA的大小 ◆DNA的构象 ◆琼脂糖浓度 ◆缓冲液：乙酸盐缓冲液(TAE)、硼
酸盐缓冲液(TBE)、磷酸盐缓冲液 (TPE)。
不同构像质粒
分离不同大小DNA片段的合适琼脂糖凝胶浓度
琼脂糖含（%）
0.3 0.5 0.6 0.7 1.0 1.2 1.5 2.0
DNA片段的有效分离范围(kb)
5-60 1-30 1-20 0.8-12 0.5-10 0.4-6 0.2-4 0.1-3
3）琼脂糖凝胶电泳的操作过程
A、缓冲液制备 B、EB母液配制：10mg/ml，在4℃下保存 C、将点样梳洗净干燥放入胶板中 D、琼脂糖胶板的制备：
称量加入三角瓶一定的琼脂糖粉末，按所需凝 胶浓度加入适量体积的缓冲液，将三角瓶塞口，微 波炉中融化。融化好后冷却到60℃左右，加入EB 溶液，至最终浓度为0.5ug/ml。摇匀倒入放置好的 点样梳的胶板中，排走气泡。室温放置30-45min。
通过凝胶电泳回收的DNA样品和氯化 铯 - 溴 化 乙 锭 连 续 梯 度 离 心 制 备 的 DNA 样品，因检测需要而含有溴化乙锭(EB)， 会影响限制性核酸内切酶的切割，因此 有必要去掉插入到DNA中的EB，常采用 的方法有：正丁醇(或异戊醇)抽提或 Dowex树脂层析法等。
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3、DNA的琼脂糖凝胶电泳
1）DNA的显示原理：
制备琼脂糖凝胶时加入溴化乙锭指示剂，溴化 乙锭(EB)在紫外光照射下能发射桔红色的荧光。当 DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的 EB就插入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发 射的荧光增强几十倍。荧光的强度正比于DNA的含 量，如将已知浓度的标准样品作琼脂糖凝胶电泳对 照，就可比较出待测样品的浓度。若用薄层分析扫 描仪检测，只需要5～lOng DNA，就可以从照片上 比较鉴别。如用肉眼观察，可检测到0.01～0.1μg的 DNA。
◆当以pH4.6的KAc高盐缓冲液调节其pH至 中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构 型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复 性而形成缠连的网状结构。
◆通过离心，染色体DNA与不来 而被除去。
DNA
大 肠 杆 菌 质 粒 的 提 取 步 骤