教你怎么做miRNA靶基因验证（实验篇）

教你怎么做miRNA靶基因验证（实验篇）核⼼提⽰：教你怎么做miRNA靶基因验证（实验篇）
在上期我们介绍了热销科研对象miRNA的靶基因预测，现在我们来介绍⼀下怎么⽤实验⽅法来验证我们的预测结果。

⼜⽅便⼜有⾼认可度的miRNA靶基因验证实验就是双荧光素酶报告基因实验啦。

双荧光素酶报告基因实验是通过将预测能够与miRNA结合的靶基因3’UTR序列插⼊载体中萤⽕⾍荧光蛋⽩（firefly luciferase）的3’UTR。

当我们感兴趣的miRNA和质粒中的插⼊序列结合后，mi RNA会通过和所插⼊的序列结合从⽽抑制萤⽕⾍荧光蛋⽩的翻译最终造成荧光值的下降。

海肾
素荧光蛋⽩（renilla luciferase）是作为内参来去除组间的转染效率差异的。

其实你也可以理解为：⽤荧光值来判断miRNA是否和靶基因结合。

在了解原理后我们来看⼀下要做⼀次荧光素酶报告实验需要哪些东西：
1. 细胞
许多同学固执的⼀定要选⽤⽬的细胞来做实验，其实我们本来就是要验证分⼦间的相互作⽤，细胞只
是⼀个媒介或载体，选⽤⼯具细胞如293T、HEK293等即可。

选择⼯具细胞的条件总结如下：
1）好转染、且转染效率较⾼
2）⽬的microRNA的表达⽔平极低或不表达
2. 质粒
⾸先我们需要萤⽕⾍荧光素酶3’UTR插⼊⽬的序列的载体，通常我们管它叫野⽣型质粒。

这⾥要注意哦，不⼀定要插⼊靶基因的3’UTR全长。

可以只插⼊包括miRNA结合位点前后200bp左右的序列。

有的基因3’UTR有⼏千到上万bp，要是你⼀定要插⼊全长的话，还能不能愉快的玩耍了？
其次我们需要萤⽕⾍荧光素酶3’UTR插⼊miRNA结合位点突变的序列载体，这个短语好长啊，请各位
同学看清⾥⾯的定语。

通常管它叫突变型质粒。

这个质粒是整个实验中⾄关重要的⼀部分。

你能不能
发现分⼦间的直接相互作⽤就靠它了，对它好⼀点哦。

当然，我们需要miRNA的过表达载体。

这个不⽤多说了吧，没有miRNA怎么做实验呢。

最后也不能少了各种对照载体啊，包括萤⽕⾍荧光素酶空载体，miRNA空载体还有海肾素荧光载体。

下⾯我们还需要……没了。

就是这么任性！
随后你会发现很熟悉有⽊有，好像都是实验室现成的，或者能够构建的，不⽤再去买抗体，探针，磁
珠啥的了，这样也能发现分⼦间直接相互作⽤？碉堡了！
当我们把家伙事⼉都备齐了，问题⼜来了——怎么设计实验分组啊？
关于miRNA靶基因验证的双荧光素酶报告基因实验分组，在经过这么多年这么多科学家前赴后继的SC I⼤潮中，已经形成了⼀套标准。

当然是领域顶尖的⼤佬们定的规矩，我们来看⼀下⼈家⼤佬的Cell⽂章是怎么做的。

Cell 138, 592–603, August 7, 2009
这篇⽂章采⽤了经典的6组法，具体的实验分组为：
是不是很复杂，结果看不懂？不⽤害怕，很多组都只是对照⽽已，真正要看的关键数据是第四组和
第六组的数据，记住这句话：第四组数据死命低，其他各组数据差不多你就赢了！就是这么简单，记住这句话：第四组数据死命低，其他各组数据差不多你就赢了！就是这么简单，
第六组的数据，
这么任性！
我们再来⽤学术语句描述⼀下：miRNA通过和靶基因结合后抑制靶基因的翻译，从⽽导致萤⽕⾍荧光素发
光值下降，当结合位点被突变后荧光值回复上升，证明miRNA确实通过结合位点调控靶基因。

对于有个性有追求的同学或者处⼥座的同学，还有更⽜的9组法，其实就是在6组法的基础上⼜加上了3种
对照载体的分别单独感染组，这样你的实验分组就完美了。