16S rDNA序列分析法对香蕉根部内生细菌种群多样性初析

16S rDNA序列分析法对香蕉根部内生细菌种群多样性初析潘羡心;刘先宝;时涛;林春花;蔡吉苗;黄贵修
【摘要】采用16S rDNA序列分析法对香蕉根部内生细菌种群多样性进行初步研究,随机选择12个阳性克隆测序.结果表明,该序列与未培养及可培养的芽孢杆菌、雷尔氏菌、伯克氏菌、戴尔福特菌、肠杆菌等细菌的序列同源性在97%～100%之间,说明香蕉根部存在大量未培养及可培养的内生细菌.
【期刊名称】《热带作物学报》
【年(卷),期】2010(031)005
【总页数】5页(P772-776)
【关键词】香蕉;16S rDNA序列分析法;内生细菌
【作者】潘羡心;刘先宝;时涛;林春花;蔡吉苗;黄贵修
【作者单位】中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,农业部热带农林有害生物入侵监测与控制重点开放实验室,海南,儋州,571737;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,农业部热带农林有害生物入侵监测与控制重点开放实验室,海南,儋州,571737;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,农业部热带农林有害生物入侵监测与控制重点开放实验室,海南,儋州,571737;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,农业部热带农林有害生物入侵监测与控制重点开放实验室,海南,儋州,571737;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,农业部热带农林有害生物入侵监测与控制重点开放实验室,海南,儋州,571737;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,农业部热带农林有害生物入侵监测与控制重点开放实验室,海南,儋州,571737
【正文语种】中文
【中图分类】S668.1
香蕉是中国南方的五大名果之一，年总产值近100亿元[1]，是中国华南地区农业
经济的重要组成部分。

在香蕉生产中，枯萎病、根结线虫病、炭疽病等多种病害严重影响香蕉的产量和品质，是相关产业发展的重要制约因素。

内生菌是指一生或至少一生中的某个阶段能进入活体植物组织内，并不引起明显症状变化的真菌或细菌[2-3]，与宿主植物是一种共生关系。

自然环境下的香蕉组织内，有大量的内生菌。

付业勤等[4]从香蕉的假茎、叶片等组织中分离到386份内生细菌分离物。

田间生
长的香蕉实际上是和其组织内的内生菌一起形成一个“共生体”来抵御外界病原
的侵染和环境胁迫，因此，对病原菌有拮抗作用的内生菌因其受外界环境影响小、抗病作用稳定而成为当前植病学家研究的一个重点。

内生菌的研究，基本上依赖常规的微生物研究法，但由于许多细菌的生长需求条件不为人所知，或者一些细菌处于存活但不可培养的状态[5]，因此，目前得到纯培
养并鉴定的微生物种类只占环境中微生物的0.1%～10%，90%以上的微生物迄今仍处于存活但不可人工培养的状态，称未培养（uncultured）微生物[6]。

对未培
养微生物的研究主要停留在它们在海洋、土壤等环境中存在（多样性）的检测，同样，得到分离和鉴定的内生菌也只有很少的一部分。

香蕉是中国重要的水果作物之一，对其组织内未培养微生物更是缺乏研究。

2007～2008年，对中国广东、海南、云南等香蕉主栽区的调查采样过程中，发现在枯萎病严重发生的香蕉种植基地内仍有少量不受病害影响的健康植株，因此，笔者利用16S rDNA序列分析法对香蕉
根部内生细菌的多样性进行了初步研究，以确定此香蕉植株中是否存在大量未被培养的内生菌和其多样性。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 香蕉根部样品从海南省乐东县黄流镇香蕉枯萎病区选取周围均发病的一株
健康香蕉植株，随机选取根样，采集后置于冰盒中，带回实验室，待用。

1.1.2 主要试剂 DNA片段回收试剂盒和pMD19－T载体购自宝生物工程（大连）有限公司；Taq酶和dNTP购自天根生化科技（北京）有限公司；细菌16S rDNA序列通用引物799f：5′-AACAGGATTAGATACCCTG-3′和 1492r：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，载体 pMD19－T 通用引物 M13R（-48）： 5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'和 M13F（-47）： 5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'，由上海英骏生物技术有限公司合成；大肠杆菌JM109感受态细胞由本实验室制备；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法
1.2.1 香蕉根组织总DNA的提取用清水将香蕉根表面冲洗干净，然后依次用70%酒精消毒3 min，3.25%次氯酸钠消毒15 min，70%酒精消毒1 min，最后用无
菌水清洗5次，无菌滤纸吸干表面水分。

采用CTAB法[7]进行香蕉根组织基因组DNA的提取。

同时取最后一次清洗的水100 μL涂布NA平板，28℃培养72 h，以检查表面灭菌效果。

1.2.2 香蕉根组织内生细菌16S rDNA扩增 PCR扩增采用25 μL反应体系，其中含10倍PCR缓冲液2.5 μL， dNTP（10 mmol/L）0.5 μL，引物（799f和1492r）溶液（10 μmol/L）各0.5 μL，模板 DNA 20～100 ng，Taq酶0.5 μL （2.5 U/μL），加去离子水至25 μL。

扩增程序为：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃1 min，35个循环；72℃ 10 min。

PCR扩增产物经1%（w/v）琼脂糖凝胶电泳分离。

按照试剂盒说明书进行切胶、纯化，并将纯化产物连接到克隆载体pMD19-T上，转化大肠杆菌JM109，利用
蓝白斑反应筛选阳性克隆。

1.2.3 序列分析将白斑转化子接种到5 mL LB（含Amp50 μg/mL）液体培养基中，37℃ 180 r/min振荡培养过夜，取菌液进行PCR鉴定。

反应体系和程序参照1.2.2中的方法，引物采用M13R（-48）和M13F（-47），模板DNA用0.5 μL 转化子菌液代替。

PCR扩增产物经1%（w/v）琼脂糖凝胶电泳检测，筛选到的阳性转化子送上海英俊生物有限公司进行测序。

序列测序结果登录GeneBank数据
库并在/BLAST/Blast.cgi上进行同源性比对分析。

2 结果与分析
2.1 香蕉根组织总DNA的提取
香蕉根组织表面灭菌最后一次清洗的水涂布NA平板，28℃培养72 h后未见菌落生长，说明组织表面灭菌较彻底。

以表面灭菌后的香蕉组织为材料，采用CTAB法提取总DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测，样品条带大于23 kb且拖尾现象较弱，表明所提取的DNA纯度和完整性较好（图1）。

图1 香蕉根组织总DNA电泳图谱
图2 香蕉根组织内生细菌16S rDNA序列PCR扩增
2.2 香蕉根组织内生细菌16S rDNA扩增
以香蕉根组织DNA为模板，采用引物799f和1492r进行PCR扩增，获得一条
大小约700 bp的产物条带，另外还有大小约1000 bp的非特异性扩增条带（图2）。

扩增产物回收、连接转化后经蓝白斑筛选获得了大量白斑。

2.3 阳性克隆鉴定与序列分析
随机挑取12个白斑转化子，命名为BUEB1～12，分别振荡培养后取菌液做模板，选用引物 M13R（-48）和M13F（-47）进行 PCR 扩增，各白斑转化子均获得大小约900 bp的产物条带（比799f-1492r引物的扩增产物大140 bp），与预测
的一致，而蓝斑转化子则无此产物条带（图3）。

这12个阳性克隆测序结果表明，其序列全长在725～737 bp之间，其对应的登录号为EU873169～EU873180，其中EU873169和EU873177、EU873170和EU873174、EU873171和EU873176序列完全一致。

这些序列与未培养及可培养的芽孢杆菌、雷尔氏菌、伯克氏菌、戴尔福特菌、肠杆菌等细菌的16S rDNA
序列同源性均在97%～100%。

12个样品编号、序列登录号及序列全长、同源性比较见表1。

图3 12个阳性克隆的PCR鉴定
表1 12个样品编号及其对应序列比对结果样品编号登录号序列全长/bp 比对结果(同源性最高的16S rDNA序列)BUEBH01 EU873169 731 与可培养芽孢杆菌(Bacillus sp.)(FJ984449、FJ984438.)、不可培养的芽孢杆菌(FJ984465、FJ984450)同源性100%BUEBH02 EU873170 726 与可培养的雷尔氏菌(Ralstonia sp.)(FJ984446)及不可培养的雷尔氏菌(AB512205)同源性为
99%BUEBH03 EU873171 730 与一株未培养细菌(EU723431)同源性
100%BUEBH04 EU873172 725 与伯克氏菌(Burkholderia sp.)(AJ551104、AF311970)同源性为97%BUEBH05 EU873173 731 与一株未培养细菌(DQ675077)同源性99%BUEBH06 EU873174 737 同EU873170 BUEBH07 EU873175 725 与伯克氏菌(Burkholderia sp.)(AJ551104、AF097532)同源性100%BUEBH08 EU873176 730 同EU873171 BUEBH09 EU873177 731 同EU873169 BUEBH10 EU873178 728 与未培养戴尔福特菌(Delftia sp.)(GU563748、FJ193019)及可培养戴尔福特菌(EU880508)同源性
99%BUEBH11 EU873179 730 与肠杆菌(Enterobacter sp.)(AB308444、
EF175731)及未培养细菌(GU562548、FJ911467)同源性为100%BUEBH12
EU873180 730 与大肠杆菌(Escherichia sp.)(GU374077、CP001846)和未培
养细菌(GQ898865、FJ826219)同源性100%
3 讨论
目前自然界存在着大量的未培养微生物，人们从两种途径对此开展了研究。

首先是非常规的、新型生化反应支持的培养方法的应用。

Schink等[8-9]于厌氧条件下，从海底沉积物中分离出能够氧化亚磷酸，同时还原硫酸盐的无机化能自养细菌，该菌能在硫酸和亚磷酸存在下，以CO2为唯一碳源生长；Sanford等[10]采用2-氯苯酚富集方法从土样和沉积物中分离到5株能于厌氧条件下利用这类物质的菌种。

其次，利用分子生物学技术研究未培养微生物。

自Olsen等[11]在1986年撰文指出其在探索自然环境中微生物多样性的应用前景后，16S rDNA序列分析、DNA-DNA杂交、核酸指纹图谱以及宏基因组等技术得到了广泛的应用并取得了较大成果；Ferrer等[12]利用λ噬菌体为载体建立了牛瘤胃微生物群的宏基因组文库，筛选到8种新型的水解酶基因。

16S rDNA序列分析法是利用通用引物对样品进行PCR扩增，通过对扩增产物的
测序分析而对样品中细菌多样性进行研究的一项技术。

就植物组织而言，叶绿体和线粒体与细菌在系统发育上具有高度的同源性[13]，在以香蕉组织总DNA为模板扩增内生细菌16S rDNA时，应避免叶绿体和线粒体DNA的干扰。

Sessitsch[14]采用通用引物8f-518r构建了马铃薯内生细菌16S rDNA克隆文库，得到的400
个克隆中绝大部分是马铃薯线粒体的DNA，少部分为马铃薯叶绿体DNA，只有
13个克隆为内生细菌的16S rDNA，表明所选的这对引物不适合于非培养方法研
究马铃薯内生细菌。

孙磊[15]在查阅了大量文献以及同NCBI上登录的序列进行比对研究后发现，通用引物799f既可同细菌16S rDNA相应位置配对，同时也可以同大多数植物线粒体18S rDNA配对，但是1492r和植物叶绿体及线粒体同源性
较差，因此，采用该对引物能够较好地排除植物叶绿体16S rDNA及线粒体18S rDNA的干扰。

利用这对引物，孙磊成功构建了水稻内生细菌16S rDNA克隆文
库，该文库包括七类细菌和古菌。

Chelius等 [16]应用799f-1492r这对引物研究了玉米（Zea mays）根组织的内生细菌种群，结果成功地避免了玉米叶绿体
DNA和线粒体DNA的干扰，所构建的玉米根组织内生细菌16S rDNA克隆文库
中包括六类细菌而没有线粒体和叶绿体及其它真核生物的序列。

在此基础上，笔者利用该引物对香蕉根组织内生细菌进行了研究，挑选的12个阳性克隆全是内生细菌16S rDNA，同样没有检测到香蕉叶绿体和线粒体DNA，说明这对引物适用于
非培养方法对香蕉根内生细菌群落的研究。

随机选取的12个克隆序列与多种未培养及可培养的细菌具有高度的同源性，表明香蕉根部存在着大量的内生细菌。

由于非培养方法分析通常不能给出群落中成员的功能信息，只能对群落多样性有一个较全面的认识，要获得具有可利用价值的菌株仍需要通过可培养的方法，因此，通过可培养和非培养方法相结合可对香蕉根组织内的微生态系统有更客观全面的认识。

2个克隆的序列（EU873172和EU873175）与伯克氏菌（Burkholderia sp.）同源性较高，为99%～100%。

在该类细菌中，洋葱伯克霍尔德菌能产生多种具有抗菌活性的代谢产物如铁载体（Pyochenlin，Pyoverdine）、吩嗪、硝吡咯菌素、苯基吡咯、单萜生物碱、Cepaciamide A （B）、Cepacidine A（B）、Cepacin A（B）。

该菌被认为是一种能够抗真菌病害的新型生物农药，它能够减少除草剂和杀虫剂的应用，从而减轻对环境的危害，现已广泛用于生物农药和生物肥料的制作中。

本研究所采用的根组织取自从香蕉枯萎病发病严重的田间健康植株上，该植株不受枯萎病菌侵染，是否是由于其组织内存在类似的拮抗菌株，仍需进一步深入研究。

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