采用重叠PCR进行定点突变

重叠延伸PCR技术的基本原理及其简单运用

3
特点：
可简单迅速将两个DNA片段连在一起，用于嵌合体基因的构建。此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理,可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物. 可以进行定点突变。可以在两基因片段间加入其他序列——酶切位点或者标签。丰富的PCR的扩增范围，尤其在获得长DNA片段方面，省去常规克隆的繁琐。
间不宜过长。高温会使 DNA 受到损伤，造成 DNA 酶终止合成。考虑
到DNA 聚合酶的扩增效率、错配率，每一轮反应的循环数控制在 20-
25 个为宜。循环次数过多，碱基错配的几率增大；循环次数太少，则
得不到足够的拷贝数进行下一轮反应。四条引物的TM值尽量保持相同
或一致，利于引物的灵活使用。
10
片段中间引入突变
B基因：上游（F2）与A基因终止密码子附近的序列及B基因5 ’ 端起始密码子附近的序列相对应，同样去除A基因终止密码子TAA；下游（R2）与B基因的开放阅读框终止密码子序列互补，并在5’末端添加酶切位点和2个保护碱基。
先分别用F1、R1，F2、R2扩增出A和B基因，然后再用F1 和R2将两基因连接起来，得到融合基因。
4
过程
设计引物
PCR扩增基因两端
回收两端片段
两端片段退火延伸
扩增全长基因
5
基本原理
6
两基因的引物设计
A基因：上游（F1）与开放阅读框起始密码子附近的序列相对应，并在5 ’末端添加酶切位点和3个保护碱基；下游（R1）与A基因终止密码子附近的序列及B基因5’末端起始密码子附近的序列互补，并去除A基因的终止密码子TAA
姓名：黄保洋学号：20192118030 专业班级：生物化学与分子

SOE-PCR在定点突变中的应用_百替生物

SOE-PCR在定点突变中的应用福建师范大学闽南科技学院生物工程专业122582005037魏慧娘指导教师：张彦定【摘要】重叠延伸剪接技术（Gene splicing by overlap extension，SOE）是一种通过DNA链的交错延伸而实现基因的拼接的分子生物学实验方法，可简单的将两个不同来源的DNA片段连在一起，广泛应用于产生突变基因、杂合基因、构建突变体库、融合基因，基因敲除等。

本文综述了SOE-PCR在基因的基因定点突变中的应用情况、该方法的利弊并展望了其应用前景。

【关键词】SOE-PCR；定点突变SOE-PCR技术是1989年由Horton等[1]提出的，即利用掺有预期改变的人工合成引物，通过多次扩增反应来完成，得到重组基因或嵌合基因；如果片段来源相同就可以得到基因长片段DNA，片段来源不同就可以形成融合基因[2]。

该技术的关键是使用了具有末端互补的引物对，特殊设计的PCR5’端寡聚核苷酸引物含有使重构基因所需的遗传物质改变的碱基渗入，如置换、插入、或缺失，就可通过重叠链延伸技术迅速地将突变基因引入内部造成基因突变，可获得依靠内切酶消化的方法难以得到的产物[3]。

与常用的定点突变的方法如寡聚核苷酸引文介导的定点突变、PCR介导的定点突变及盒式突变相比，重叠延伸技术作为PCR介导的定点突变技术之一可以再DNA区段的任何位点进行突变[4]。

本文主要对SOE-PCR在定点突变中的应用进行综述。

1、SOE-PCR的原理SOE-PCR的主要原理是采用特殊设计的寡聚核苷酸引物，在特定位置引入突变。

首先，设计一对含有突变位点的引物，如图1中的c、b这两条引物含有互补末端，两个重叠片段可以再随后的延伸反应中融合在一起，在设计如图1中的a、d两条外侧引物通过PCR将人融合产物扩增。

原则上，引物可沿着靶基因移动到任何地方引入突变。

因此含有引入突变基因片段可通过单体反应得到加长。

这种通过重叠延伸两个DNA片段融合为一得能力可进一步用于两个或是来两个以上异源基因DNA片段的剪接。

热点微专题08 基因编辑技术及定点突变-2023年高考生物二轮复习(人教版2019)

得到含有突变位点的双链载体；
④最后将双链载体引入宿主细胞复制，
并进行筛选和鉴定。
知识拓展：基因定点突变技术
2．PCR定点突变技术（1）重叠延伸PCR
①此技术共需四个引物引物2和引物3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基（包括突变位点）是可以互补的。 ②分别利用引物1和引物2，引物3和引物4进行PCR，得到两个DNA片段 ③得到的DNA片段可以通过引物2和引物 3互补的碱基杂交在一起，它们再在DNA 聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。 ④最后，用引物1和引物4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。
①首先人工合成一段含有特定突变位
点的单链寡核苷酸片段（除突变位点外，
该片段的其他部分可以与目的基因互补
配对）
②然后将该寡核苷酸片段与带有目的
基因的单链载体（通常由M13噬菌体衍生
而来）进行杂交；
M13噬菌体是一种丝状噬菌体，内有一个环状单链DNA分子
③继而在DNA聚合酶和DNA连接酶的作
用下分别进行DNA链的合成和连接反应，
(3)在构建改良基因表达载体时，有的质粒含有改良基构因建，改有良的基质因粒组为质空粒白时质破粒坏，了将含上述组件的溶液加入到大肠杆菌菌液中，适宜温度下培L养ac一Z基段因时(间因后)，，含再该将质菌粒液的涂大布肠在含氨苄青霉素和__β__-_半__乳__糖__苷___的平板上。一段时间后杆，菌在不培能养分基解上β出-现半白乳色糖和苷蓝产色生两蓝种菌落，其中白色菌落含有重组质粒，判断的依据是__色__物__质__（_。变），菌落为白色（果）
二轮微专题— 基因组编辑技术及定点突变技术
一、基因组编辑技术
• 【情境原理】 • 1.基因组编辑的含义:对基因进行定点修改,以改变目的基因的序列和功能,进行基因治

重叠PCR (Overlap

Cycling conditions
Pre-denaturation: Denaturation: Annealing: Extension: Extension: Finally:
98℃, 2 min.
98℃, 30 sec. 60℃, 30 sec. 72℃,1 min. 72℃,5 min. 4 ℃, ∞.
重叠PCR (Overlap PCR)的基本原理及其简单运用
刘梦鸽6.06.08
简介
重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称 SOE PCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的一项技术。
5 cycle
加入100 μM浓度的F和R引物各0.5 μl
Maker
目的基因条带 2154bp
胶回收得浓度： 40μg/mL
Cycling conditions
Pre-denaturation: Denaturation: Annealing: Extension: Extension: Finally:
98℃, 2 min.
98℃, 30 sec. 65℃, 30 sec. 72℃,2 min. 72℃,5 min. 4 ℃, ∞.
12 cycle
12
F2引物 R2引物
R2引物
突变碱基：可以在引物上换成任何其他碱基。
碱基同源区域：保证20bp左右，这样有利于Overlap PCR 得到目标序列。
8
上述反应体系中，反应液的加入有两种不同的方式
一种是先加入酶，模板（基因A和B）buffer，dNTP，水。经过5个循环得到完整的目的基因。然后入引物，大量扩增目的基因。虽然这样操作繁琐，但是可以得到特异性扩增产物。另外一种是直接一步加入所有需要的反应液。虽然此操作简单省时，但是会出现非特异扩增条带，影响胶回收，产量也会减少。

重叠延伸PCR对DNA片段进行定点双突变

578bp 10 μL
uOR F1M u 10 μL
1101bp 10 μL
dNTP M ixture (各 2. 5 mmol·L - 1 )
4 μL
上游引物 ( 10μmol·L - 1 )
Pa 1μL
下游引物 ( 10μmol·L -来自1 )uOR F1M uR e1μL
DNA 模板
PB - W1534 100 ng
up to 50μL
uORF1 + 2 Mu 10 μL
4 μL Pa 1μL Pb 1μL 纯化的 1101bp及 459bp片段各 200ng 0. 5μL
up to 50 μL
·80·
985bp 578bp uOR F1M u 1101 bp 459bp uORF1 + 2Mu
预变性 95℃ 3 m in 95℃ 3 m in 95℃ 3 m in 95℃ 3 m in 95℃ 3 m in 95℃ 3 m in
循环次数 25 25 25 25 25 25
末次延伸 68℃ 7 m in 68℃ 7 m in 68℃ 7 m in 68℃ 7 m in 68℃ 7 m in 68℃ 7 m in
1. 4 双位点突变 DNA 片段的克隆及测序将上述重叠延伸 PCR 获得的双位点突变 DNA
片段经琼脂糖电泳、纯化回收及双酶切 ( Sac I和 H indⅢ)后与同样经 Sac I和 H ind Ⅲ双酶切的载体 PGL3 - B asic连接 ,连接产物转化大肠杆菌 JM109, 采用含 50 mg·L - 1氨苄青霉素的 LB 平板筛选阳性转化子 ,进一步用 PCR 及双酶切鉴定阳性克隆 ,并取阳性克隆菌液委托上海英骏生物技术有限公司用 AB I3730 DNA 测序仪进行序列测定 ,测序引物为与载体 PGL3 - B asic退火的 GLp rim er2: 5′- CTTTAT2 GTTTTTGGCGTCTTCCA - 3′,为反向测序 ,即从插入片段的 3′端开始测序。

定点突变

1.1.1基因定点突变简介（INTRODUCTION）定点突变（site-directed mutagenesis）是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变（单点/多点）等。

定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。

原理上分两种：1. 搭桥法（重叠PCR）2. 一步法（全质粒PCR）►搭桥法（重叠PCR）定点突变搭桥法共需要两对引物（两端引物，中间引物）,三次PCR，其中前两次PCR可同时完成，原理如图一所示：两次PCR的产物回收，作为模板加上两端引物primer F和primer R 进行PCR3。

搭桥法定点突变PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增实验步骤（PROCEDURE）1.两对引物的Tm值都应相当。

两端PCR引物参照普通引物设计并无特殊要求。

所需引入突变包含在中间引物互补区域内（需要在两条引物上均引入点突变），请勿将突变位点置于引物3’ 末端且突变位点距离3’ 端最少要有15个碱基，因为有非匹配碱基的存在，太短会导致引物与模板无法结合。

2.对于一对中间引物的设计，如左图所示（高亮处是突变碱基），两引物间可以是完全互补，也可是部分互补。

但两引物间互补部分的Tm值不能太低（太低导致PCR3无法配对延伸）。

5’-NNNNNNNNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3’-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’完全互补5’-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3’-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNN-5’部分互补5’-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3’-NNNNNNNNNNNNNNNT-5’部分互补一对中间位置的点突变引物设计3.PCR：PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增；PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增。

【精选】基于重叠延伸PCR法的定点突变技术 doc资料

基于重叠延伸PCR法的定点突变技术E-mail:daican@live △通讯作者:卢光琇, :mutant location Primers Sequences for primers (listed 5'to 3'-189~-193bp (relative to ATGF ggggtaccCTCGCTGTCGCACTCAGGCTRm CAGTCAACCGCCACAAAATT Fm AATTTTGTGGCGGTTGACTG RcggctagcAACTGGGTAGGGACGAGGAG基于重叠延伸PCR 法的定点突变技术*戴灿苗聪秀卢光琇△(中南大学生殖与干细胞工程研究所,人类干细胞工程研究中心湖南长沙410078摘要:目的:建立一种高效而经济的定点突变方法。

方法:采用重叠延伸PCR 定点突变技术,引物设计时引入目的突变,以前两次PCR 产物为模板,进行第三次PCR ,即可获得突变后的目的DNA 片段。

将此片段连入pMD TM 18-T 载体后测序验证突变结果。

结果:DNA 测序表明,待突变位点已由ATTGG 突变为ATTTT 。

结论:成功实现了目的位点的定点突变,重叠延伸PCR 法是一种高效且经济的定点突变方法。

关键词:重叠延伸PCR ;定点突变中图分类号:Q75,Q78,R392文献标识码:A 文章编号:1673-6273(202103-411-02Site-directed Mutagenesis Based on Overlap Extension PCR *DAI Can,MIAO Cong-xiu,LU Guang-xiu △(Institute of Reproductive and Stem Cell Engineering,Central SouthUniversity,National Engineering and Research Center of HumanStem Cell,Changsha,410078,ChinaABSTRACT Objective:To establish a fast,saving method for site-directed mutagenesis.Methods:Overlap extension PCR was used.Briefly,target mutation was introduced into primers,and the two previous PCR products were used as template for the third PCR.The final PCR segment with target mutant was then cloned into pMD?18-T vector for sequencing.Results:DNA sequencing showed that the target site ATTGG had been changed into ATTTT.Conclusion:Site-directed mutagenesis was successfully implemented based on the overlap extension PCR which is a fast and saving method.Key words:Overlap extension PCR;Site-directed mutagenesis Chinese Library Classification:Q75,78,R392Document code:Article ID:1673-6273(202103-411-02前言定点突变(Site-directed mutagenesis,SDM 是指通过聚合酶链式反应(PCR 等方法在目的DNA 片段的特定位点中引入碱基改变,如插入、缺失、点突变等。

OverlapPCR(重叠PCR)的基本原理

Overlap PCR（重叠PCR）的基本原理Overlap PCR（重叠PCR）重叠PCR的应用是非常广泛的，他的原理其实很简单：比如说有两个基因或者说一个启动子和一个基因，你要将他们连接到一起，我们首先想到的方法当然是借助于酶切的方法，但有时我们并不一定能构找到合适的酶切位点，或者说我们找到了酶切位点，但这种酶非常特殊或者又很贵，我们可能只用一次，这样购买酶就变成了一种浪费，难道没有别的办法了吗？当然有，那就是重组PCR技术。

举个例子可能更容易说明。

比如两个基因，一个命名为A，一个命名为B。

A的序列为5- atgcatgctagctagaacgctacgctgactaccccctgatc-3，B的序列为5- atgctagtagctagccccccccaggggataattttttaaaacg-3。

首先我们要设计引物，假设引物的序列为：A1:5-ATGCATGCTAGCTAGAACGCT-3A2:5-ggggggctagctactagcatgatcagggggtagtcagcgt-3B1:5-acgctgactaccccctgatcatgctagtagctagcccccc-3B2:5-cgttttaaaaaattatcccct-3我们的目的是将基因A,B通过PCR的方法连接起来，我们可以仔细的观察上面的引物A2和B1，我们会发现这两条引物要比另外两条引物长很多，为什么会这样呢？这就是我们在设计引物的时候在A2的5端加入了20个B基因5端的序列，在B1的5端加入了20个A基因3端的序列。

我们来看重叠PCR的步骤：（1）以A1,A2扩增A基因，B1，B2扩增B基因（2）回收A，B基因（3）以A，B为共同的模板，A1和B2为引物，扩增A+B，这样我们就利用重组PCR的方法将A+B拼接起来了。

为什么会扩出A＋B呢？因为我们在设计引物的时候使A，B有了20个互补的碱基，他们可以经过退火结合在一起，因此可以扩增出A+B.第三步目前很多人的做法都不同，有的人是先加入模板A，B，dNTP，Buffer，水，然后进行3－5个循环的扩增，然后在加入引物A1和B2以及 TAQ酶，这样做的好处是可以得到特异的扩增，缺点是麻烦。

2023届高考二轮总复习试题专题8 生物技术与工程命题篇强化练10(专项命题一)

命题篇强化练10(专项命题一)1.[PCR技术及其应用](2022湖北黄冈一模)重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板,通过多次PCR扩增,从而获得目的基因的方法。

某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变,使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG),从而提高水蛭素的抗凝血活性,原理如图所示。

下列说法错误的是()注:引物突起处代表与模板链不能互补的突变位点。

A.过程①需要模板、含Mg2+的缓冲液、引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶等B.若引物2的突变位点设计为A,则引物3的突变位点应设计为GC.经过过程④获得的杂交DNA有2种,只有其中一种可以经过过程⑤获得目的基因D.以过程⑤获得的目的基因为模板,可以使用引物1和引物4进行PCR2.[PCR技术及其应用](2022天津一模)通过设计引物,运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。

如图为基因工程中获取突变基因的过程,其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对,但不影响引物与模板链的整体配对,反应体系中引物1和引物2的5'端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。

有关叙述不正确的是()A.引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入载体B.在PCR反应体系中还需要加入4种游离的脱氧核苷酸、Taq DNA聚合酶等C.第3轮PCR,引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因D.第3轮PCR结束后,含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/23.[PCR技术及其应用](2022北京一模)小鼠肿瘤转移抑制基因(kissl基因)仅在特定组织中表达。

在雌激素的诱导下,细胞内信号转导分子可以与kissl基因启动子的特定区域结合,激活kissl基因的转录。

研究者扩增了kissl基因启动子不同长度的片段P1、P2、P3和P4,分别构建这些片段与绿色荧光蛋白基因(G)融合的载体,转入体外培养的特定细胞中,在培养液中添加雌激素,以确定不同片段的转录活性。

重叠pcr原理

重叠pcr原理
重叠PCR是一种用于扩增DNA序列的特殊PCR方法。

它基于两个相互重叠的引物同时在反向和正向方向上进行PCR扩增，以产生重叠的片段。

重叠PCR通常用于在实验室中构建DNA片段、基因工程和分子生物学研究中。

重叠PCR的原理是基于引物的设计。

通常情况下，引物的设计应尽量避免相互补的序列，以减少非特异性扩增的产生。

然而，在重叠PCR中，引物的设计是特殊的。

引物的设计应使其相互重叠，并在PCR反应中同时作用。

这样，PCR扩增的产物将具有重叠的序列。

在重叠PCR反应中，两个引物的3'末端分别与目标序列的相应部分互补。

在PCR的早期循环中，两个引物将结合目标序列的两个相邻区域，并启动扩增反应。

在后续循环中，PCR 反应将在两个引物分别结合目标序列的两个相邻区域，并产生重叠的扩增产物。

重叠PCR还可以通过引入点突变、缺失或插入等修饰来构建新的DNA序列。

通过设计引物使其与目标序列的两个相邻区域有所重叠，并引入适当的修饰，可以在PCR扩增中产生带有特定修饰的重叠片段。

这些重叠片段可以用于构建新的DNA序列，进行基因工程操作或进行其他分子生物学研究。

总之，重叠PCR是一种特殊的PCR方法，通过引物的设计使其在PCR反应中同时作用，产生重叠的扩增片段，用于构建新的DNA序列或进行分子生物学研究。

Overlap PCR(重叠PCR)的基本原理

Overlap PCR（重叠PCR）的基本原理Overlap PCR（重叠PCR）重叠PCR的应用是非常广泛的，他的原理其实很简单：比如说有两个基因或者说一个启动子和一个基因，你要将他们连接到一起，我们首先想到的方法当然是借助于酶切的方法，但有时我们并不一定能构找到合适的酶切位点，或者说我们找到了酶切位点，但这种酶非常特殊或者又很贵，我们可能只用一次，这样购买酶就变成了一种浪费，难道没有别的办法了吗？当然有，那就是重组PCR技术。

举个例子可能更容易说明。

比如两个基因，一个命名为A，一个命名为B。

A的序列为5- atgcatgctagctagaacgctacgctgactaccccctgatc-3，B的序列为5- atgctagtagctagccccccccaggggataattttttaaaacg-3。

首先我们要设计引物，假设引物的序列为：A1:5-ATGCATGCTAGCTAGAACGCT-3A2:5-ggggggctagctactagcatgatcagggggtagtcagcgt-3B1:5-acgctgactaccccctgatcatgctagtagctagcccccc-3B2:5-cgttttaaaaaattatcccct-3我们的目的是将基因A,B通过PCR的方法连接起来，我们可以仔细的观察上面的引物A2和B1，我们会发现这两条引物要比另外两条引物长很多，为什么会这样呢？这就是我们在设计引物的时候在A2的5端加入了20个B基因5端的序列，在B1的5端加入了20个A基因3端的序列。

我们来看重叠PCR的步骤：（1）以A1,A2扩增A基因，B1，B2扩增B基因（2）回收A，B基因（3）以A，B为共同的模板，A1和B2为引物，扩增A+B，这样我们就利用重组PCR的方法将A+B拼接起来了。

为什么会扩出A＋B呢？因为我们在设计引物的时候使A，B有了20个互补的碱基，他们可以经过退火结合在一起，因此可以扩增出A+B.第三步目前很多人的做法都不同，有的人是先加入模板A，B，dNTP，Buffer，水，然后进行3－5个循环的扩增，然后在加入引物A1和B2以及TAQ酶，这样做的好处是可以得到特异的扩增，缺点是麻烦。

一种简便高效利用重叠延伸PCR进行基因定点突变的方法

tg3j前两次pcr反应产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后无需纯化直接将胶条切下置于ep管中一80冷冻10min然后将胶条离心后分别取上清液作为模板进行第三次pcr以获得全长的突变目的基因最后将此突变基因插入报告载体pg一b髂ic进行基因测序
维普资讯
２００７年第２３卷第６期
ＯｅｌｐｘｎｉＣａｓｄｔｍｔｇｎｔｈｍａＧｖｒ —ｅｔｓｎＰＲｗｓｕｅｕａｅａｕｎＴＦ—ｔｅｅｐｏｏｅａｅｏｏｅ３ｇｎｒｍｔ２ｒ（一７ｂ２０ｐ～＋２０ｐ８ｂ）一１４ｐｒｇｎｆｍｂｅｉｒ１ｏｏ
Ｂ因启动子区（７ｂ２基一２０ｐ～＋２０ｐ８ｂ）一１４ｐ的５ＧＧ序列定点突变为５ＩＧ前两次ＰＲ反应产物经琼脂糖１ｂＣＴ３＂Ｔｒ３Ｃ
凝胶电泳鉴定后无需纯化，直接将胶条切下置于ＥＰ管中，８＇冻１ｍｉ，一０Ｃ冷０ｎ然后将胶条离心后分别取上清液作为模板
进行第三次ＰＲ，Ｃ以获得全长的突变目的基因，最后将此突变基因插入报告载体ｐＬＧ３一Ｂｓ进行基因测序。结果：ａｉｃ人ＴＦ—ｔＧ３２基因启动子区突变序列的测序结果与预期完全一致。结论：方法简便经济、此突变准确，是一种非常实用的基
ＳＹａ，ＳＵｎＨＡＯｏ，ＧＡＯｏｇａＹＵＭｉｇｕ２ＸＩｕｕｎＧｕＳｎｄｎ，ｎｈａＵＲｉａｊ
，
（．疗ｉｈｍｓｙｎｏｃｌｉｏｙＢｏｕｅｉｌｏｇ，ａｔ１００Ｃｉ；１Ｄ，ｏＢｏｅｉｒａｄＭｌｕｒｏｇ，ａｔｄａＣｌｅＢｏｕ４１，ｈａ聊ｍｆｃｔｅａＢｌｏＭｃｌｅｏ０ｎ２ＩｔｕＭｃｉｌｔｎＰｋｇ．ｎｉｔｏｉｏｒｄｉ．ｅｉｓｔｅｆｒｃａｏｃｎＭｄａＣｌｅＣｉｓＡａｅｙＭｄａＳｉｃ）ｅｉｌｏｅ＆ｈｅｅｃｍｅｉｌｃｎｅｃｌｇｎｄｏｆｃｅｓ

重叠pcr定点突变

重叠pcr定点突变
重叠PCR定点突变是一种常用的分子生物学技术，用于在已知序列上引入特定的突变。

它是基于PCR技术和DNA片段重组的原理进行的。

重叠PCR定点突变的步骤如下：
1. 设计引物：设计两对互补引物，每个引物包含突变位点。

2. PCR扩增：在反应体系中加入DNA模板、引物和PCR反应试剂，进行PCR扩增。

在反应开始时，两对引物的扩增产物可以通过互补序列相互结合形成重叠。

3. 产物重组：通过加热使重叠的DNA片段解开，使两个扩增产物相互重组。

此步骤是为了在两个扩增产物之间形成杂交DNA分子。

4. 扩增：将重组的DNA片段作为模板进行第二轮PCR扩增。

这一步骤是为了扩增含有突变位点的DNA片段。

5. 检测：通过DNA测序等方法检测扩增产物中是否含有突变位点。

如需重复多次突变，可以重复以上步骤。

重叠PCR定点突变可以用于研究基因功能、构建重组蛋白、引入特定变异等方面的研究。

它的优势是操作简便、效率高和适用于较大的DNA片段。

重叠PCROverlap

5’ 3’
3’ 5’
3’
5’ 3’
F1 引物
5’ 3’
3’ 5’
加入F1引物、R2引物
3’ 5’
R2 引物
大量扩增目的基因
5’ 5’
无目标产物
ห้องสมุดไป่ตู้3’
6
在定点突变方面的应用
F1引物
F1引物 R1引物
碱基同源区域
F2引物
G C …… A A A G G C A T C G A C G …… T T T C C G T A G C T
得到突变后的目的基因
F2引物 R2引物
R2引物
突变碱基：可以在引物上换成任何其他碱基。
碱基同源区域：保证20bp左右，这样有利于Overlap PCR 得到目标序列。
7
上述反应体系中，反应液的加入有两种不同的方式
一种是先加入酶，模板（基因A和B）buffer，dNTP，水。经过5个循环得到完整的目的基因。然后入引物，大量扩增目的基因。虽然这样操作繁琐，但是可以得到特异性扩增产物。另外一种是直接一步加入所有需要的反应液。虽然此操作简单省时，但是会出现非特异扩增条带，影响胶回收，产量也会减少。
简介
重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称 SOE PCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的一项技术。
特点：
可简单迅速将两个DNA片段连在一起，用于嵌合体基因的构建。
常用的方法
重叠PCR技术
通过酶切法得到相应的粘性末端，再利用连接酶得到
迅速、经济、简单易行

螺旋讲堂--采用重叠PCR进行定点突变

07年第一期螺旋讲堂--"采用重叠PCR进行定点突变"！体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。

而采用重叠引物PCR介导的定点突变实验是一种快速有效的在基因中特定位点引入特定突变的有效技术。

该技术采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链, 从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。

此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组，而且不需要内切酶消化和连接酶处理，可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。

该技术主要包括以下几步：设计引物，PCR扩增基因两端，回收两端片段，两端片段退火延伸，扩增全长基因。

1. 引物设计重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计。

可以有三种方法来设计引物，具体如下图所示。

引物F及R为基因两端特异引物，其中Fm及Rm为中间引物。

其中引物Fm及Rm中间共享一段序列（至少10bp完全匹配，否则后续实验很难成功），突变点可以设计在Fm或Rm，也可以两条引物上都有突变点。

突变点最好是位于引物的5’端，尽量避免出现在3’端。

2. 分别用引物F和Rm及Fm和R进行配对进行PCR。

注意该步一定要用pfu酶，不要用Taq酶，因为Taq酶容易在PCR产物末端加A，从而可能会使产物移码突变。

3. 分别回收第2步所得两条PCR产物（一定要用胶回收，准确回收两条目的条带）。

4. 将第3步所得两份PCR产物进行混合使其互为模板及引物，加入dNTP及Pfu或Taq酶进行PCR。

进行PCR约5-10轮即可。

5. 取第4步PCR产物做为模板，加入引物F及R进行PCR扩增出具有突变的全基因。

以上为采用重叠PCR介导的定点突变实验，不对之处请指出。

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重叠延伸PCR技术定点突变TFEB原核表达载体的构建及体外诱导表达和纯化

重叠延伸PCR技术定点突变TFEB原核表达载体的构建及体外诱导表达和纯化焦凤娟;刘俊杰;卢思维;姜东君【期刊名称】《吉林大学学报:医学版》【年(卷),期】2022(48)5【摘要】目的:基于重叠延伸PCR(SOE PCR)技术构建转录因子EB(TFEB)丝氨酸114位点突变体原核表达质粒,并进行体外诱导表达和纯化。

方法:根据SOE PCR技术原理设计突变引物,以pGEX-6p-1-TFEB质粒为模板,分别采用外侧引物F和R 及突变引物F_(n)和R_(n)进行第1步PCR扩增,获得含突变位点的产物1和产物2。

经第2步PCR退火延伸对产物1和产物2进行重叠拼接,以拼接后DNA片段为模板,采用外侧引物F和R进行第3步PCR扩增获得含突变位点的目的DNA;将其克隆至pGEX-6p-1载体,采用BamHⅠ和SalⅠ进行酶切鉴定,DNA测序验证突变结果。

于大肠杆菌(E.coli)中分别采用不同浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在不同条件下诱导TFEB及其突变体重组蛋白表达。

Glutathione-Sepharose 4B琼脂糖凝珠分离纯化蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化产物蛋白浓度和相对分子质量。

结果:第1步PCR扩增获得均含有突变位点的2条DNA片段,经第2步PCR退火延伸和第3步PCR扩增后获得大量含有突变位点的完整DNA片段。

双酶切鉴定,连接的DNA片段与目的片段大小一致。

DNA测序显示TFEB的114位丝氨酸(TCT)成功突变为丙氨酸(GCT)。

在0.5 mmol·L^(-1)IPTG、16℃诱导过夜条件下获得TFEB及其突变体的可溶性蛋白表达。

SDS-PAGE凝胶电泳,纯化后蛋白浓度较高,分子大小正确。

结论:利用SOE PCR技术成功实现了TFEB丝氨酸114位点的定点突变,并且TFEB及其突变体基因在E.coli中成功表达。

【总页数】7页(P1109-1115)【作者】焦凤娟;刘俊杰;卢思维;姜东君【作者单位】济宁医学院精神卫生学院山东省行为医学重点实验室【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.重叠延伸PCR法构建UGRP1基因启动子的点突变表达载体2.重叠延伸PCR法构建VPS4B基因定点突变真核表达载体3.人β-防御素-3基因定点突变,原核表达载体构建和融合蛋白表达4.用PCR体外定点突变技术诱导霍乱毒素A亚基突变体的构建5.重叠延伸PCR法构建小鼠Sumf1基因的定点突变真核表达载体因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。