分光光度计

基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法，称为吸光光度法。

根据物质对不同波长范围的光的吸收，吸光光度法包括比色分析，可见与紫外分光光度法以及红外吸收光谱分析等。

包括比色分析和分光光度法的吸光光度法（简称光度法），历史悠久，应用十分广泛。

它是现代分析化学中的“ 常规武器” 。

其主要特点为：
1 、灵敏度高：与滴定分析和重量法相比，光度法具有很高的灵敏度，测定物质的浓度下限（最低浓度）一般可达10-5～10-6 mol?L-1，相当于含量低于0.01 ～0.001 ％的微量组分。

2 、准确度较高：分光光度法的相对误差一般为2 ～5 ％，但对微量组分的测定是允许的。

例如测定试样中含量为
0.02 ％的杂质，即使相对误差为±5 ％，则测定的结果为0.019 ～0.021 ％，这样的结果应该认为是很准确的。

3 、操作简便、快速、应用广泛：比色分析和分光光度法无需复杂，昂贵的仪器设备，操作也比较简便，分析速度快。

例如钢铁中Mn 、P 、Si 三元素的快速比色分析，一般在 3 －4min 内可报出结果。

几乎所有无机离子和许多有机化合物都可直接或间接地用光度法测定。

本章主要讨论比色分析和可见光区的吸光光度法。

1 物质对光的选择性吸收
1.1 光的基本性质
比色分析和分光光度法的依据是物质对光的选择性吸收。

为此，必须对光的基本性质有所了解。

我们知道，光是一种电磁辐射，具有波动性和微粒性。

光在传播时表现了它的波动性，例如光的折射、衍射、偏振和干涉等现象。

描述波动性的主要物理量是波长（λ ）、频率（ν ）和速度（с ），它们的关系是：
λν ＝с
式中с 为光速，在真空中约等于3×108 m ·s-1；ν 为光的频率，以Hz 表示；λ 为光的波长，在紫外和可见光区，以纳米（1nm=10-9 m ）为单位。

波长在400 ～760 nm 范围内的电磁辐射，人眼可以看见，称为可见光；波长在10 ～400 nm 是紫外光区。

理论上将具有同一波长的光称为单色光，由不同波长的光组合成复合光。

我们日常所见到的白光（如日光和白炽灯光）就是波长范围在400 ～760 nm 之间的复合光。

白光通过棱镜后可以分解为红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等七种颜色的光，各种颜色的光具有一定的波长范围。

反过来，这些不同的光也可以按比例混合得到白光，而且不仅七种色光可以混合成白光，如果把适当颜色的两种色光按一定强度比例混合，也可
以组成白光，这两种色光叫做互补色光，图7.1 中处于直线位置的两种色光互为补色。

如绿光与紫光、黄光与蓝光均互补色光。

因此，日光、白炽灯光等即为一对对互补色光按适当强度比例混合而成。

图7.1 互补色光示意图
（λ/nm ）
1.2 物质对光的选择性吸收
物质之所以会有颜色，是由于物质对不同波长的可见光有选择性吸收的结果。

例如铜氨配合物溶液显蓝色，是因为铜氨络离子选择性地吸收了部分黄色光而使使得透射光中的兰色光未
能完全互补，从而溶液显蓝色。

又如当一束白光通过KMnO4溶液，MnO4-离子吸收绿色（500 ～560nm ）的光，从光的互补示意图可知，其互补色光为紫红色光，因而KMnO4溶液呈现紫红色。

即溶液的有色质点选择性地吸收白光中的某种色光，而呈现透射光（吸收光的互补色光）的颜色。

若溶液对可见
光区各种波长的光都有吸收，则该溶液呈暗灰色，甚至黑色；如果该溶液对可见光区各种波长的光都不吸收，入射光全部透过，则引起我们视觉感受的仍是白光，因此溶液无色透明。

表7.1 列出了溶液颜色和吸收光颜色和波长范围的关系。

不同的物质之所以吸收不同波长的光线，是由物质的本质决定的，即取决于物质的组成和结构，所以物质对光的吸收是具有专属性的选择性吸收。

利用物质对光的选择性吸收，可以作为鉴定物质的依据。

表7.1 物质颜色与相对应的吸收光颜色
物质颜色吸收光
颜色波长λ /nm 黄绿紫400~450
黄蓝450~480
橙绿蓝480~490
红蓝绿490~500
紫红绿500~560
紫黄绿560~580
蓝黄580~600
绿蓝橙600~650
蓝绿红650~760
以上只是定性地用溶液对色光的选择性吸收来说明溶液呈现的颜色。

如果将不同波长的单色光依次通过某一固定浓度的有色溶液，测定此溶液对每一波长光的吸收程度（即吸光度 A ），然后以波长（λ ）为横坐标，吸光度 A 为纵坐标作图，可得一条曲线。

这种曲线定量地描述了物质对各种波长光的吸收情况，称为吸收光谱曲线（简称吸收曲线）。

图7.2 是不同浓度的KMnO4溶液的吸收曲线。

由图可见，KMnO4溶液对不同波长的光的吸收程度不同，对绿青色光（525nm 附近）吸收最多，对400 nm 附近的紫色光几乎不吸收，所以KMnO4溶液呈紫红色。

这充分说明了物质对光的选择性吸收。

吸收曲线中525nm 处吸光度最大值，该波长称为该物质的最大吸收波长（λ max ），若在λ max 处测定吸光度，灵敏度最高。

因此，吸收曲线是分光光度分析的重要依据。

浓度不同时，吸收曲线的形状和λ max 不变，但吸光度随浓度增加而增大。

有色溶液的浓度愈高，对光吸收愈多，则溶液颜色愈深，即有色溶液的浓度与光吸收之间存在着定量关系。

这是吸光光度法定量分析的依据。

图7.2 KMnO4溶液的吸收曲线
2 光吸收基本定律
2.1 透光度（T ）与吸光度（A ）
当一束平行的单色光通过均匀透明的有色溶液时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液，一部分被容器表面反射，如图7.3 所示。

设入射光强度为Io , 吸收光强度为Ia ，透射光强度为It ，则：
Io ＝Ia ＋Ir ＋It
图7.3 光通过溶液的情况
在光度测量中，入射光垂直地投射到表面十分光滑的吸收池（比色皿）上，反射光Ir 可以忽略不计。

即当入射光强度一定的单色光通过溶液时，如不考虑反射光的影响，则It 仅与Ia 有关：
Io ＝Ia ＋It
透射光强度It 与入射光强度Io 的比值称为透光度，以T 表示：
溶液的透光度越大，表示它对光的吸收越小；反之亦然。

若It ＝Io ，则T ＝1 ，表示溶液对这束单色光完全不吸收；当It ＝0 时，则T ＝0 ，表示溶液对这束单色光全部吸收。

透光度的负对数称为吸光度，符号为 A ，表示物质对光的吸收程度。

即
吸光度和透光度一样，表示溶液对某一波长光线的吸收，而且比透光度更直观地描述溶液的吸收程度。

A ＝0 ，完全不吸收，A 越大吸收越多，A ＝∞ 时，溶液对光束全部吸收。

2.2 朗白－比尔定律
早在1729 年，波格（Bouguer ）首先发现物质对光的吸收与吸光物质的厚度有关。

此后他的学生Lambert 进一步研究，并于1760 年指出，如果溶液浓度一定，则光的吸收程度与有色溶液液层厚度成正比，这个关系被称为朗白定律。

1952 年Beer 指出，当单色光透过液层厚度一定的有色溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度成正比，这个关系就是比尔定律。

将二者结合即得到描述光的吸收与溶液浓度和液层厚度的基本定律——朗白－比尔定律：
A =Kbc (7.1)
式7.1 是朗白－比尔定律的数学表达式。

它表明：当一束平行单色光通过含有吸光物质的溶液后，溶液的吸光度与吸光物质浓度和液层厚度的乘积成正比。

式中比例常数K 与吸光物质的性质，入射光波长等因素有关，与液层厚度和浓度无关。

式7.1 中的k 值随 c 、b 所取单位不同而不同。

当 C 以g·L-1，液层厚度b 以cm 为单位表示时，常数K 称为吸光系数，以 a 表示（单位为L·g-1 ·cm-1），此时:
A ＝abc (7.2a)
若式7.1 中的浓度 C 以mol·L-1，b 用cm 为单位表示，则K 用符号ε 来表示。

ε 称为摩尔吸光系数，其单位以
L·mol-1 ·cm-1，它表示物质的浓度为1 mol·L-1，液层厚度为1cm 时溶液的吸光度。

此时：
A ＝εbc (7.2b)
显然，我们不能直接取 1 mol·L-1这样高浓度的有色溶液去测量其摩尔吸光系数，而只能通过计算求得。

ε 与 a 的关系为：
ε ＝Ma (7.3)
式中M 为物质的摩尔质量。

例7.1 铁（Ⅱ）的浓度为 5.0×10-4 g ·L-1的溶液，与1,10-邻二氮菲生成橙红色配合物，在λ ＝508 nm ，吸收池厚度为2cm 时，测得 A ＝0.190 ，计算铁（Ⅱ）－1,10-邻二氮菲的 a 及ε 。

解：已知铁的摩尔质量为55.85 g·mol-1，根据比尔定律
①
②ε ＝Ma = 55.85 × 190 = 1.1 × 10 4
L · mol-1 · cm-1
或
摩尔吸光系数表示吸光物质对某一波长光的吸收能力，也反映用分光光度法测定该物质（显色反应）的灵敏度。

ε 值越大，表示该物质对此波长光的吸收能力越强，方法的灵敏度也越高。

一般认为若ε<104，该方法的灵敏度较低；在104～5×104时，属于中等灵敏度；ε 在6×104～105时，属于高灵敏度；ε>105则属于超高灵敏度。

应该指出，溶液中有色溶液的浓度因离解等化学反应而改变，故计算ε 时，应知道有色物质的平衡浓度。

在实际工作中，常用被测物质的总浓度计算，这样所得的ε 值实为条件摩尔吸光系数。

朗白－比尔定律作为光吸收的基本定律，不仅适用于有色溶液，也适用于其它一切均匀、非散射的吸光物质（气体或固体），是光度分析法定量分析的理论基础。

但是应该注意，朗白－比尔定律的成立是有条件的，要求：①入射光为平行单色光，且垂直照射；②吸光物质之间无相互作用；③被测试物质不存在荧光或光化学现象等。

对于多组分体系，只要各吸光物质之间没有相互作用，朗白－比尔定律仍然适用，这时体系的总吸光度等于各组分吸光度之和，即
A总＝A1＋A2 ＋…＋A n
＝ε1 bc1＋ε2 bc2＋… ＋εn bc n
这一规律称为吸光度具有加合性，利用这种性质可进行多组分的测定。

2.3 标准曲线及偏离朗白－比尔定律的原因
在分光光度分析中，通常固定液层厚度和入射光的波长和强度，测量一系列标准溶液的吸光度，根据朗白－比尔定律可知：A =Kbc ＝K ' C ，即吸光度与吸光物质的浓度成正比。

当有色溶液符合朗白－比尔定律时若以吸光度 A 为纵坐标，标准溶液的浓度 C 为横坐标作图，得一条通过原点的直线。

称为校正曲线或标准曲线，如图7.4 所示。

在相同条件下测定试液的吸光度（A x），从标准曲线上可以查得试液的浓度（C x）。

图7.4 标准曲线及对朗伯- 比尔定律的
偏离
在实际工作中，特别是在溶液浓度较高时，常会出现标准曲线不成直线的情况。

这种现象称为偏离比尔定律。

偏离比尔定律的原因较多，主要是由来自仪器方面的和来自溶液方面的因素引起的。

2.3.1 物理因素
（ 1 ）非单色光引起的偏离严格的说，比尔定律只适用于单色光。

但目前分光光度计的单色器所提供的入射光并非纯的单色光，而是包括一定波长范围的谱带。

由于物质对不同波长光的吸光度不同，用复合光作入射光，就会导致对比尔定律的偏离。

实验证明，若能选用一束吸光度随波长变化不大又有较高灵敏度（较大的ε ）的谱带作入射光束进行测定，则由于ε 值随波长变化不大，所引起的偏离就较小，标准曲线基本上是条直线。

（ 2 ）非平行入射光引起的偏离朗伯- 比尔定律要求采用平行光束垂直入射。

若入射光为非平行光，可能导致光束的平均光程大于吸收池的厚度，从而产生正偏离。

（ 3 ）介质部均匀引起的偏离朗伯- 比尔定律要求被测溶液是均匀的、非散射的，若溶液混浊，将导致部分入射光散射损失，使测量的透射比减小，吸光度增加，从而产生正偏离。

2.3.2 化学因素引起的偏离
溶液中吸光物质因离解、缔合、配合物或者发生互变异构体等化学变化而导致浓度的改变，从而偏离朗白- 比尔定律。

例如将已知浓度的K2Cr2O7用水稀释配制一系列的标准溶液时，由于每个Cr2O72-分子会离解生成两个CrO42-，而它们对光的吸收有很大的不同（Cr2O72-的最大吸收波长λ max ＝350 nm, 而CrO42-的λ max ＝375 nm ），因此导致标准曲线发生弯曲。

但是，在稀释时控制溶液为强酸性，则可抑制其离解，使所有的Cr( Ⅵ) 都以Cr2O72-形式存在，则可以得到符合朗伯- 比尔定律的标准曲线。

另外，因朗白比尔定律未考虑溶液中各吸光物质质点间的相互作用，这对稀溶液是符合实际的，因此稀溶液符合朗白比尔定律。

在浓溶液中，由于各吸光质点间的距离缩小，彼此之间的相互作用增强，从而影响吸光能力。

浓度越大，对朗白比尔定律的偏离越大。

3 吸光光度法的其仪器
用眼睛观察，比较溶液颜色深度以及确定物质含量的方法称为目视比色法。

常用的目视比色法为标准系列法。

用一套（10 支左右）相同的平底玻璃管（称为比色管），将一系列不同量的标准溶液依次加入各比色管中，在相同实验条件显色，最后稀释
至同样体积，配成一套颜色逐渐加深的标准色阶。

然后通过比较待测溶液与这些标准溶液的颜色以确定其浓度。

目视比色法操作异常简便、快速，不需要复杂的仪器，常用于要求不高的常规分析中。

它的主要缺点是受眼睛观察颜色能力的限制，存在较大的主观误差，准确度不高。

利用分光光度计测量有色溶液对某波长单色光的吸光度及其浓度的方法，叫做分光光度法，简称光度法。

由于光度法采用光电仪器代替人眼来测量物质对光的吸收，并采用标准曲线来测定试液的浓度，其准确度和灵敏度都有了很大提高。

对于人眼无法观察的紫外和红外光谱区，其应用更加广泛，因此在现代分析方法中，光度法已基本取代比色法。

3.1 分光光度计的基本部件
尽管分光光度计的种类和型号很多，但基本上都是由光源、单色器、吸收池、检测系统和信号显示系统五个基本部件组成的：
3.1.1 光源
在可见分光光度法中，通常使用 6 －12V 的钨丝灯作光源。

钨丝灯发出的连续光谱，波长在360 －1100nm 范围内。

在近紫外区测定时，常采用氢灯或氘灯作光源，产生180 ～375nm 波长范围内的连续光谱。

光源的发光强度必须稳定，电源电压的微小波动会引起钨丝灯光强度的很大变化，因此在仪器内通常配有稳压电源使光源的发光强度保持不变。

3.1.2 单色器
将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置称为单色器。

单色器由棱镜或光栅等色散元件、狭缝和透镜组成。

此外，常用的滤光片也起单色器的作用。

图7.5 为棱镜单色器的原理图，光通过入射狭缝，经准直透射后成为平行光束，以一定角度投射到棱镜上，在棱镜的两个界面发生折射（不同波长的光折射率不同），将各种波长的平行光束按波长顺序分散成为单色平行光束，这一过程称为色散（wavelength dispersion ）。

色散后的单色平行光，被会聚透镜聚焦在一个微微弯曲并带有出射狭缝的焦面上。

转动棱镜或移动出射狭缝的位置，就可使所需波长的光通过出射狭缝照射到吸收池上。

单色光的纯度取决于棱镜的色散率和出射狭缝的宽度，狭缝越小，出射谱带越窄，单色光的纯度越高，但光强度减弱。

可见光区的分光光度计一般用玻璃棱镜，它对400 ～1000nm 波长光的色散率较大。

紫外分光光度计则须用石英棱镜（200 －400nm 光谱区，色散率较大。

）
光栅是利用光的衍射与干涉作用制成的一种色散元件。

它的优点是适用波长范围宽，色散均匀，色散率和分散率较大等，因而现在广泛用于各种分光光度计中。

通过光度计的出射光束中通常混有与仪器所指示波长很不一致的杂散光（stray light ），其来源之一是光学部件表面尘埃所引起的散射。

杂散光的存在，会影响吸光度的测量，因此应保持仪器光学部件的清洁。

3.1.3 吸收池
吸收池亦称比色皿，用于盛参比溶液和吸收试液。

在可见光区，可用无色透明、耐腐蚀的玻璃比色皿，紫外光区则采用石英比色皿。

大多数仪器都配有液层厚度为0.5 、1 、2 、3cm 等四种规格的比色皿。

为了减少入射光的反射损失和造成光程差，应注意使其透光面垂直于光束方向。

比色皿必须保持光洁，不要直接用手指接触其透光面。

3.1.4 检测系统
检测系统是测量光线透过吸光物质后光强度变化的装置。

测量吸光度时，并非直接测量透过吸收池的光强度，而是利用光电效应，将光强度转换成电流进行测量，这种光电转换器件称为检测器。

要求检测器对测定范围内的光有快速、灵敏的响应，更重要的是产生的光电流应与照射于检测器上的光强度成正比。

可见分光光度计常用的检测器有硒光电池，光电管和光电倍增管。

硒光电池光谱响应的波长范围为300-800nm ，但其最灵敏区（500 ～600nm ）与正常人眼的光谱响应曲线相似。

硒光电池具有坚固、价廉和不需外接电源等优点。

但由于它的内阻较小，所产生的光电流不能用一般直流放大器放大，故不适于十分微弱的光的测量。

光电池受强光照射或连续使用时间太长时，会出现“ 疲劳” 现象, 即照射光强度不变, 但产生的光电流会逐渐下降 . 如遇这种情况, 应暂停使用, 并将光电池置于暗处, 使之恢复原来的灵敏度。

光电池应注意防潮。

光电管是由一个阳极和一个半圆筒状的光敏阴极组成的真空二极管，阴极表面涂有碱金属或碱金属氧化物等光敏材料。

当它被有足够能量的光子照射时，能发出电子，两极间加上适当的电位差时，发射的电子就流向阳极而产生电流。

光电管比光电池灵敏，波长范围也宽。

虽然在相同光强度作用下，光电管所产生的电流大约只有硒光电池所产生的1/4 ，但由于光电管具有很高
的内阻，产生的电流容易放大，所以光电管比硒光电池更适于微弱光信号的测量。

光电倍增管是由光电管改进而成的，其灵敏度比光电管高200 倍，适用的波长范围为160 ~ 700nm 。

光电倍增管在现代分光光度计中被广泛使用。

3.1.5 信号显示系统
其作用是检测光电流的强度，并以一定方式记录下来。

以硒光电池为检测器的仪器，通常使用悬镜式光点反射检流计测量产生的光电流。

检流计刻度为百分透光度T% 和吸光度A ，测量时可以方便地读出 A 的数值。

采用光电管作检测器的分光光度计，光电管产生的信号放大后，可从表头上直接读出T% 和A ，也可经对数转换（T%→A ）后进行数字直读，或反馈至记录仪上自动记录吸光度。

现在很多光度计通常还配有数据处理系统，可以对采集到的数据进行处理，直接绘制吸收曲线、工作曲线等。

3.2 分光光度计的类型
分光光度计根据适用的工作波长范围分类，分光光度计可分为可见分光光度计、紫外- 可见分光光度计和红外分光光度计。

可见分光光度计及紫外一可见分光光度计主要用于无机物和有
机物定量分析，红外分光光度计主要用于结构分析。

根据仪器的结构又可分为单光束、双光束和双波长三种类型，其结构如图7.6 。

单光束光度计结构简单，价格低廉，在各级科研、教学、生产部门容易得到普及，如我国普遍适用的721 、722 、751 型光度计就是这种类型。

该类型光度计比较适合于固定波长下的定量分析，但是由于参比溶液和待测试液装入不同比色皿，分别在不同时间测量（通过手动拉杆将不同比色皿置于光路中），由此会因仪器不稳定而导致一定的测量误差。

此外，每次改变波长，都必须将参比溶液置于光路中对仪器重新调零，因此不适合于经常改变波长的定性分析。

双光束分光光度计中仪器对参比溶液的I 0 和试液的I t 几乎是同时测量的，因此补偿了因光源和检测系统不稳定而产生的影响，准确度和精密度得到提高；而且仪器具有“双光路”，在改变波长时，不用象单光束分光光度计那样改变比色皿位置，因此测量非常方便，可以连续变更入射波长，实现自动扫描以绘制吸收曲线。

就测量波长而言，单光束和双光束分光光度计都是单波长的，即让相同波长的光束分别通过参比和试液池，而双光束分光光度计则与此不同，见图7.6 （ c ）。

由光源发出的光通过两个单色器同时得到具有不同波长的单色光，它们交替通过同一溶液，
经过光电倍增管和电子控制系统。

由于两个波长的光通过同一比色池，因此可消除由于比色池的参数不同、位置不同、污垢以及制备参比溶液等带来的误差，而且两束单色光是由同一光源产生，因此仪器不稳定带来的影响也大大减小。

双波长分光光度计得到的信号实质上是两波长处吸光度之差?A （?A=A λ1 -A λ2 ），当两个波长保持1~2 nm 间隔并同时扫描时，得到的
将是试样的导数光谱（~λ ）。

用双波长分光光度计还可用于测量高浓度试样、多组分试样，甚至一般分光光度计不能测量的混浊试样。

4 吸光光度法分析条件的选择
4.1 显色反应与显色剂
大多数无机离子都是无色或者颜色很浅，没有足够的灵敏度（摩尔吸光系数ε小于104），因此在用可见分光光度法对这些物质进行分析时，首先要将被测组分转变为有色化合物，然后进行比色和吸光度测定。

将被测组分转变为有色化合物的反应叫显色反应，与被测组分形成有色化合物的试剂称为显色剂。

在光度分析中选择合适的显色反应，严格控制反应条件，是十分必要的。

将被测组分转变为有色化合物的反应很多，常用的显色反应主要是络合反应和氧化还原反应。

前者是最主要的显色反应，应
用最广。

有的显色反应是将形成络合物的反应和氧化还原反应结合起来，借以提高方法的灵敏度。

同一种物质可与多种显色剂反应，生成各种不同的有色化合物，因此，在选择显色反应时应考虑以下因素：
1 、显色反应的灵敏度光度法一般用于微量组分的测定，因此应选用灵敏度高的显色反应。

有色化合物的摩尔吸光系数的大小是显色反应灵敏度高低的重要标志，ε 值越大，灵敏度越高。

ε 达104～105时，可认为反应灵敏度较高。

2 、选择性好，干扰少所谓选择性好，就是希望所用显色剂只与被测组分发生显色反应，试液中其它共存组分不干扰测定。

这样可在其它组分共存下，不需分离即可直接测定。

应根据试液的情况，选用干扰较少或干扰容易消除的显色剂。

3 、生成的有色化合物的组分恒定（符合一定的化学式）且化学性质稳定，至少应保证测定过程中吸光度基本不变。

4 、显色剂的颜色（许多显色剂是有色的）与显色反应产物（待测物）的颜色要有较大差异，即“对比度要大”，一般要求二者最大吸收波长应相差60 nm 以上。

这样显色剂在测定波长处无明显吸收，可以提高测定的准确度。

显色剂有无机显色剂和有机显色剂两类。

多数无机显色剂与金属离子形成的配合物稳定性差，灵敏度和稳定性也不够理想，。