实验三营养缺陷型的筛选

实验三营养缺陷型的筛选
一、教学目标及基本要求
理解选育营养缺陷型突变株的选育原理，掌握营养缺陷型突变株的筛选方法。

二、实验原理
营养缺陷型是野生型菌株由于基因突变，致使细胞合成途径出现某些缺陷，丧失合成某些物质的能力，必须在基本培养基中外源补加该营养物质，才能正常生长的一类突变株。

其本质是一种减低或消除末端产物浓度，以解除反馈控制的代谢调控方式，使代谢途径中间产物或分支合成途径中末端产物得以积累。

营养缺陷型菌株广泛应用于氨基酸，核苷酸，维生素的生产中，也广泛应用于基因定位，杂交及基因重组等研究中的遗传标记制作。

三、实验材料
1. 菌种枯草杆菌（B.subtilis）。

2. 培养基
(1) 细菌完全培养基（CM）葡萄糖0.5%，牛肉膏0.3%，酵母膏0.3%，蛋白胨
1%，MgSO4·7H2O0.2%，琼脂2%，PH7.2。

(2) 细菌基本培养基（MM）葡萄糖0.5%，MgSO4·7H2O0.2%，柠檬酸钠0.1%，
(NH4)2SO40.2%,K2HPO40.4%,琼脂2%(处理琼脂)。

配制基本培养基的药品均用分析纯；使用的器皿要洗净，用蒸馏水冲洗2~3次，必要时用重蒸馏水冲洗。

(3) 无氮基本培养基在基本培养基中不加(NH4)2SO4和琼脂。

(4) 二倍氮源基本培养基在基本培养基中加入2倍(NH4)2SO4，不加琼脂。

(5) 限制培养基（SM）向配好的液体基本培养基中加入0.1~0.5%的完全培养基，加入2%琼脂。

3. 溶液
(1) 无维生素的酪素水解物或氨基酸混合液。

(2) 水溶性维生素混合液。

(3) 核酸水解液：取2g RNA，加入15ml 1mol/L NaOH；另取2g RNA，加入15ml
1mol/L HCl，分别于100℃水浴加热水解20min后混合，调整pH值为6.0，过滤后调整体积为40ml。

4. 其它：无菌小滤纸片，干净镊子，无菌移液管，培养皿，酒精灯等。

四、实验内容
1. 菌体前培养取新活化的的枯草芽孢杆菌斜面菌种1环，接入装有
20ml完全培养基的250ml三角瓶中，30℃振荡培养16~18h。

2. 对数培养取1ml培养液转接于另一只装有20ml完全培养基的
250ml三角瓶中，30℃振荡培养6~8h，使细胞处于对数生长状态。

3. 细胞悬浮液的制备
(1) 取10ml培养液，离心（3500r/min，10min）收集菌体，菌体用
生理盐水离心洗涤2次，最后将菌体充分悬浮于11ml生理盐水中，调整细胞浓度108个/ml。

(2) 取1ml菌悬液以倾注法进行活菌计数，测定细胞悬浮液的菌体浓
度。

4. 诱变处理取剩余的10ml细胞悬浮液于直径90mm培养皿中（带磁
棒），以紫外线照射60s。

5. 中间培养取1ml UV处理过的菌液于装有20ml完全培养基的
250ml三角瓶中，30℃振荡培养过夜。

6. 淘汰野生型（青霉素法）
(1) 取10ml中间培养液，离心（3500r/min，10min）收集菌体，菌体用生理盐水离心洗涤2
次，最后将菌体转入10ml无氮基本培养基中，30℃振荡培养6~8h。

(2) 将全部菌液转入10ml二倍氮源基本培养基中，30℃振荡培养1~2h，加入终浓度为100单
位/ml的青霉素（母液浓度为2000单位/ml），继续培养5~6h，使青霉素杀死野生型细胞，达到浓缩缺陷型细胞的目的。

(3) 取10ml菌液，离心收集菌体，将菌体用生理盐水离心洗涤1次，最后将菌体充分悬浮于
10ml生理盐水中。

7. 营养缺陷型菌株的检出
(1) 取0.1ml菌悬液，涂布于限制培养基平板上（3皿或更多），30℃培养48h，野生型形成
大菌落，缺陷型为小菌落。

(2) 制备完全培养基和基本培养基平皿各4皿，并在皿的背面划好方格（每皿以30个格为
好）。

(3) 用牙签从限制培养基平板上逐个挑取小菌落，对应点接在基本培养基和完全培养基上
（先点接MM平板，位置一定要对应）。

30℃培养48h。

将在完全培养基平板上生长，而在基本培养基平板上相应位置不生长的菌落，挑入完全培养基斜面，30℃培养24h，作为营养缺陷型鉴定用菌株。

8. 营养缺陷型菌株的鉴定（采用生长谱法）
(1) 取待测菌种斜面1环接于5ml生理盐水中，充分混匀，离心（3500r/min，10min）收集
菌体，将菌体充分悬浮于5ml生理盐水中。

(2) 取1ml菌悬液于平皿中，倾入约15ml融化并冷却至45~50℃的基本培养基，摇匀，待凝
固后即为待测平板。

(3) 将待测平板底背面划分为三个区域，在培养基表面三个区域分别贴上蘸有氨基酸混合
液、维生素混合液、核酸水解液的滤纸片，30℃培养24h，观察滤纸片周围菌落生长情况。

只有蘸有氨基酸混合液纸片周围生长的菌株，即为氨基酸缺陷型菌株。

五、结果与讨论
确定经UV诱变后获得的营养缺陷属三大类营养物质的哪一大类即可。

如果要对缺陷株的具体营养要素化学组成进行确定，通常也需采用生长谱法测定。

以氨基酸缺陷型菌株的营养要求的鉴定为例加以说明。

首先将属于氨基酸缺陷的突变株用基本培养基经倾注而制成待测平板。

将待测平板背面用记号笔划为六个区域，在其上六个区域分别贴上蘸有如表8所示的各组氨基酸混合液的滤纸片，培养后观察滤纸片周围微生物生长圈。

按表9所示的位置，确定该待测菌株对单一氨基酸营养的要求。