藏灵菇源酵母菌和乳酸菌降胆固醇蛋乳发酵饮料的研制

藏灵菇源酵母菌和乳酸菌降胆固醇蛋乳发酵饮料的研制
张晶;张红星;谢远红;刘慧
【摘要】利用藏灵菇中筛选的马克斯克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus) M3、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) KL1、嗜热链球菌(Streptococcus thermoptilus) Tx、乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis sub ctis) KS4混合发酵,以鸡蛋和牛奶为原料,研制降胆固醇蛋乳发酵饮料.利用KL1、Tx、KS4这3株乳酸菌进行一次发酵,再利用酵母菌进行二次发酵.采用3因素3水平正交试验优化发酵条件为发酵温度34℃,接种量1％,发酵时间24h.在优化条件下,蛋乳发酵饮料的降低胆固醇率为74.99％,显示藏灵菇源酵母菌M3菌株具有良好的降胆固醇作用.
【期刊名称】《中国酿造》
【年(卷),期】2013(032)009
【总页数】4页(P50-53)
【关键词】马克斯克鲁维酵母;优化发酵条件;降胆固醇;蛋乳饮料
【作者】张晶;张红星;谢远红;刘慧
【作者单位】北京农学院食品科学与工程学院,北京102206;农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室,北京102206;北京农学院食品科学与工程学院,北京102206;农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室,北京102206;北京农学院食品科学与工程学院,北京102206;农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室,北京102206;北京农学院食品科学与工程学
院,北京102206;农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室,北京102206
【正文语种】中文
【中图分类】Q93-335
随着生活水平的不断提高，人们对饮料产品的功效要求越来越高。

国内外已有蛋乳发酵饮料研制成功的报道，但大多利用普通酸奶菌种研制而成，并没有降低胆固醇的功效。

藏灵菇中含有60%～70%的乳酸菌，其他为酵母菌、醋酸菌等[1]。

人们直接将藏灵菇添加到经加热灭菌，冷却后的牛乳中，使之发酵而生成具有酸味和起泡性的酒精性保健饮料[2]，长期饮用该种饮料可以调节血清胆固醇水平，改善动
脉硬化，预防心脏病等病症。

刘慧等[2-6]研究表明，藏灵菇源马克斯克鲁维酵母
菌M3、干酪乳杆菌KL1、嗜热链球菌Tx、乳酸乳球菌乳酸亚种KS4菌株在体内、体外具有较强的降胆固醇功效。

有关利用藏灵菇源乳酸菌和酵母菌制备降胆固醇蛋乳饮料尚未见国内外文献报道。

降胆固醇蛋乳饮料是以鸡蛋和牛奶为原料，采用藏灵菇源乳酸菌和酵母菌进行二次混合发酵研制而成的，亚健康人群通过饮用该种饮料可达到预防高胆固醇血症的目的。

1 材料与方法
1.1 材料与试剂
菌种：马克斯克鲁维酵母菌（Kluyveromycesmarxianus）M3、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、Tx干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）KL1、乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus ctis）KS4，均从吉林藏灵菇中筛选得到，并鉴定为产生胆盐水解酶[7-9]，具有降低胆固醇功能的菌株。

材料：新鲜鸡蛋、蒙牛纯牛奶、绵白糖（市售）。

试剂：邻苯二甲醛、无水乙醇、冰醋酸、浓硫酸、甲醇、氯仿、胆固醇、氢氧化钠（分析纯）。

1.2 仪器与设备
BCD-301型冰箱：青岛海尔；LS-B5OL型立式压力蒸汽灭菌器：江阴滨江医疗设备厂；GHP-9160型隔水式恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；SW-LJ-IFD型洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；BS224S型分析天平：赛多利斯科学仪器有限公司；HZS-HA型水浴振荡器：哈尔滨市东明医疗仪器厂；DT-10d 型高精度循环恒温水浴槽：北京德天佑科技发展有限公司；22PC型可见分光光度计：上海棱光技术有限公司。

1.3 方法
1.3.1 发酵液的制备
（1）乳酸菌发酵液的制备
将活化好的KL1、Tx、KS4三株菌按2%的接种量分别移入灭菌牛奶三角瓶中，37℃培养12h。

一次发酵接种前将3株菌按1∶1∶1的比例混合使用。

（2）酵母菌发酵液的制备
将活化好的M3菌种按1%～2%的接种量移入灭菌牛奶三角瓶中，28℃培养
20h～24h备用。

1.3.2 饮料的工艺流程
1.3.3 降胆固醇蛋乳发酵饮料二次发酵条件确定
（1）发酵温度的选择：一次发酵（乳酸菌发酵）条件：3%总接种量，接种比例KL1∶KS4∶TX=1∶1∶1，43℃发酵8h。

二次发酵（酵母菌发酵）M3菌株接种量为2%，发酵时间为24h，发酵温度分别为26℃、28℃、30℃、32℃、34℃，每组3个重复。

将产品4℃后熟24h，以感官评分为试验指标确定发酵温度。

（2）发酵时间的选择：在上述试验结果基础上，M3菌株接种量为2%，发酵时间分别为20h、24h、28h、32h、36h，每组3个重复。

将产品4℃后熟24h，以感官评分为试验指标确定发酵时间。

（3）接种量的选择：在上述试验结果基础上，M3菌株接种量分别为1%、2%、3%、4%、5%，每组3个重复。

将产品4℃后熟24h，以感官评分为试验指标确定接种量。

1.3.4 正交试验优化二次发酵条件
选择发酵温度、发酵时间、接种量为试验因素，采用3因素3水平正交试验优化二次发酵条件，以后熟前后感官评分为试验指标确定降胆固醇蛋乳发酵饮料最佳发酵条件。

表1 蛋乳发酵饮料发酵条件优化正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of egg and milk beverage水平 A发酵温度/℃ B发酵时间/h C接种量/%1 2 3 30 32 34 20 24 28 1 2 3
1.3.5 试验指标测定方法
（1）酸度的测定
方法见参考文献[10]。

（2）感官评分标准
选经过训练的10人根据感官评分标准对产品进行感官评价。

评分标准（满分为20分）如下：
A、B、C、D四种指标，分别为色泽、口感、滋味、香气，每项满分5分，总共20分。

A色泽：色泽呈现出蛋乳的纯色4～5分，色泽过黄或偏白0～3分；B口感：口感细腻、幼滑4～5分，口感粗糙有结块0～3分；C滋味：酸甜适中、无涩味
4～5分，滋味偏淡、无明显特点2～3分，酸甜不适、有明显涩味0～1分；D香气：有明显醇香和奶香4～5分，醇香气味较淡0～3分。

（3）酒精度的测定
方法见参考文献[10]。

（4）胆固醇的测定
①胆固醇含量标准曲线的绘制：胆固醇及其脂类在硫酸作用下与邻苯二甲醛产生紫红色物质，此物质在波长550nm处有极大吸收，用比色法测定总胆固醇含量。

按表2操作加入各种试剂于比色管中，在20℃～37℃静置10min[11]。

以试剂空白调零，立即于紫外可见分光光度计波长550nm处测定吸光度值，并绘制标准曲线，建立胆固醇含量与A550nm值线性回归方程为y=0.0026x+0.0364
（R2=0.9943）。

表2 标准曲线溶液的配制Table 2 Solution preparation of standard curve项目 0 1 2 3 4 5 6 7 8胆固醇标准液/mL甲醇氯仿混合液/mL邻苯二甲醛/mL 混合酸/mL相当于总胆固醇量/（mg·100mL-1）0.00 0.40 0.20 4.00 A550nm
00 0.05 0.35 0.20 4.00 50 0.193 0.10 0.30 0.20 4.00 100 0.310 0.15 0.25 0.20 4.00 150 0.421 0.20 0.20 0.20 4.00 200 0.530 0.25 0.15 0.20 4.00 250 0.702 0.30 0.10 0.20 4.00 300 0.819 0.35 0.05 0.20 4.00 350 0.935 0.40 0.00 0.20
4.00 400 0.995
②邻苯二甲醛法测定蛋乳发酵饮料中胆固醇含量：试管中加入发酵蛋奶样品1.00g，然后加入2mL～3mL甲醇氯仿混合液，混匀，于45℃水浴加热15min，过滤于
具塞比色管，并补充甲醇氯仿混合液至10mL。

取上述样品处理液0.4mL，然后加入1000mg/L邻苯二甲醛0.2mL、混合酸4.0mL，在20℃～37℃静置10min。

以试剂空白（甲醇氯仿混合液0.4mL、邻苯二甲醛0.2mL、混合酸4.0mL）调零，于波长550nm处测定样品的吸光度值，根据线性回归方程计算样品胆固醇含量，
再计算胆固醇的降低率。

2 结果与分析
2.1 降胆固醇蛋乳发酵饮料二次发酵条件确定
2.1.1 发酵温度的确定
图1 发酵温度对产品感官品质的影响Fig.1 Effects of fermentation temperature on sensory quality of the product
酵母菌最适生长温度一般为25℃～28℃，不同发酵温度影响菌体产生的酒精含量，进而影响饮料感官指标[12]。

由图1可知，34℃时产品感官评分最高，口感细腻，酸甜适宜，醇香浓郁；30℃和32℃时产品口感粗糙，醇香过浓，感官评分较低；26℃和28℃时产品口味不协调，滋味偏淡，感官评分最低。

2.1.2 发酵时间的确定
图2 发酵时间对产品感官品质的影响Fig.2 Effects of fermentation time on sensory quality of the product
不同发酵时间影响酵母菌产生的酒精含量。

发酵时间过短时，产生的酒精含量较少；发酵时间过长时，会使菌体发生自溶，产生酵母臭味，导致产品风味变劣。

由图2可见，发酵24h的产品酸甜适中，醇香适宜，口味协调；20h时由于发酵时间太短，产品滋味、醇香气味较淡；28h、32h、36h时产品口感及风味较差。

2.1.3 接种量的确定
不同接种量影响酵母菌产生的酒精含量。

接种量过低，产生酒精含量较少；接种量过高，后期产生酒精含量过多，导致产品风味变劣。

由图3可知，接种量为1%时的饮料口感最好且香气怡人，接种量为2%～5%时产品口感及风味较差。

2.2 正交试验优化二次发酵条件
影响饮料感官指标的主要因素有发酵时间、发酵温度、接种量等，根据R值大小
可以直观分析试验因素的主次顺序，再利用方差分析进行检验。

由表3可知，RB
＞RA＞RC，RB'＞RA'＞RC'，即发酵时间是影响产品感官指标的主要因素，发酵
温度次之，接种量影响最小。

由表4、表5可见，不同发酵温度和发酵时间对产品感官指标影响极显著（p＜0.01），接种量对产品感官指标影响不显著。

由表4可知，KA3＞KB2＞KC1，KA3'＞KB2'＞KC1'，二次发酵条件最佳组合为A3B2C1，即发酵温度34℃，发酵时间24h，接种量1%。

在此最佳条件下，产品感官评分
为18分。

图3 接种量对产品感官品质的影响Fig.3 Effects of inoculum on sensory quality of the product
表3 蛋乳发酵饮料发酵条件优化正交试验结果与分析Fig.3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of egg and milk beverage注：表中数据均为n=3测定平均值；
k=K/9，k'=K'/9。

试验号 A B C 感官评价（满分20分）后熟前后熟后123456789 111222333 123123123 123231312 11.48 13.93 11.48 12.52
13.81 9.33 12.33 17.45 11.66 11.38 13.43 11.29 13.24 13.90 9.95 12.43
17.90 12.52后熟前K1K2K3 k1k2k3R 110.67 107.00 124.34 12.30 11.89
13.82 1.93 109.00 135.57 97.44 12.11 15.06 10.83 4.23 114.78 114.35
112.88 12.75 12.71 12.54 0.21 RB＞RA＞RC K1'K2'后熟后K3'k1'RB'＞ RA'＞RC'k2'k3'R'108.29 111.28 128.57 12.03 12.36 14.29 2.26 111.16 135.70 101.28 12.35 15.08 11.25 3.83 117.71 117.57 112.86 13.08 13.06 12.54 0.54 2.3 产品酸度测定
由图4可见，产品后熟前后的酸度变化不大，说明藏灵菇源乳酸菌后熟期间产酸
缓慢，有助于解决产品后酸化过快，导致乳品感官质量下降及保质期短等问题，从而保证产品质量。

表4 后熟前正交试验结果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal
experiments results before post-fermentation注：“*”表示影响显著，“**”表示影响极显著，下同。

变异源平方和自由度均方和 F值 F0.05 F0.01区组3.63 6.23 ABC误差22221 8 0.15 9.280 42.474 0.112 0.131＜1
70.84**324.23**0.855总变异0.300 18.559 84.948 0.224 2.35 125.1126
表5 后熟后正交试验结果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experiments results after post-fermentation变异源平方和自由度均方和
F值 F0.05 F0.01区组3.63 6.23 ABC误差22221 8 0.025 13.32 34.9 0.085 0.072＜1 185**484.72**1.181总变异0.05 26.64 69.80 1.70 1.29 122.5526
图4 产品后熟前与后熟后酸度对比Fig.4 Comparison of acidity between before and after post-fermentation
2.4 产品胆固醇和酒精度含量的测定
表6 产品胆固醇含量测定结果Table 6 Determination results of cholesterol content of the product胆固醇含量/（mg·100mL-1）胆固醇降低率/%胆固醇含量/（mg·100mL-1）胆固醇降低率/%一次发酵前149.10一次发酵后100.20一次发酵后32.81二次发酵后熟前42.10二次发酵后熟后37.30二次发酵后熟前71.77二次发酵后熟后74.99
表7 产品酒精度测定结果Table 7 Determination results of alcoholic content of the product酒精浓度/（g·100mL-1）二次发酵后熟前二次发酵后熟后
0.645 0.700
由表6可知，一次发酵前、一次发酵后、二次发酵后熟前后，胆固醇含量明显下降，说明藏灵菇源乳酸菌和酵母菌在发酵过程中代谢产生胆盐水解酶[13-15]，从
而降低了原料中的胆固醇。

由于酵母菌在二次发酵过程中代谢产生大量的胆盐水解酶，因而二次发酵后熟前比一次发酵的胆固醇含量降低了38.96个百分点；饮料
后熟后的胆固醇含量比后熟前又下降了3.22个百分点，说明低温有利于胆盐水解
酶的产生。

由表7可知，产品酒精度为0.5g/100mL～1.0g/100mL，且后熟前后酒精含量变化不大，适合众多人群饮用。

3 结论
3.1 发酵时间是影响产品感官指标的主要因素，发酵温度次之，接种量影响最小。

通过正交试验确定二次发酵最佳条件为发酵温度34℃，发酵时间24h，接种量1%。

3.2 通过乳酸菌一次发酵和酵母菌二次发酵，产品胆固醇含量的降低率分别为
32.81%和71.77%，二次发酵后熟之后的胆固醇含量降低率为74.99%，说明藏灵菇源酵母菌M3菌株具有良好的降胆固醇作用。

3.3 产品酒精度为0.5g/100mL～1.0g/100mL，且后熟前后酒精含量变化不大，
适合众多人群饮用。

产品色泽柔和，呈乳黄色，淡淡的奶香伴着醇香，口感酸甜适中，是一种集营养与保健为一体的功能性饮料。

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