丹参和川芎嗪对瘢痕成纤维细胞生长的体外抑制实验

·瘢痕的基础研究·丹参和川芎嗪对瘢痕成纤维细胞生长的
体外抑制实验
商庆新3　张涤生3　关文祥3　周慧君3
摘　要 增生性瘢痕是临床治疗难题之一,目前尚无有效的治疗方法。

为了探讨丹参和川
芎嗪对瘢痕成纤维细胞的抑制作用,取12例患者胸部增生性瘢痕组织,通过体外成纤维细胞培
养,探讨不同药物浓度、不同作用时间对成纤维细胞生长的影响。

结果表明,丹参、川芎嗪对体外
培养的瘢痕成纤维细胞具有剂量依赖和时间依赖两方面的抑制作用。

使细胞胸腺嘧啶核苷的摄
入值降低,分裂指数下降,生长增殖减慢甚至停止。

在低剂量时,药物对细胞的抑制是可逆的,丹
参在2.5mgΠml以上,川芎嗪在500μgΠml72小时以上,是不可逆的,药物对成纤维细胞的抑制作用
主要通过抑制DNA合成来实现。

为临床应用中草药治疗增生性瘢痕提供了理论依据。

关键词 丹参 川芎嗪 成纤维细胞 生长动力学
目前,国内外治疗增生性瘢痕的药物,均因其严重的副作用而影响临床应用。

中草药具有药源广泛、价廉和副作用小的特点,国内已有应用中草药治疗肝硬化成功的报道[1,2]。

受此启发,我们采用活血化瘀中草药丹参和川芎嗪,研靠其对体外培养的瘢痕成纤维细胞生长的作用,为临床应用副作用小的中草药治疗增生性瘢痕提供理论依据,为增生性瘢痕的药物治疗开辟一条新的途径。

1　材料与方法
1.1　主要试剂
3H-TdR(上海原子核研究所产品);丹参注射液(上海市新岗制药厂产品);磷酸川芎嗪注射液(广东利民制药厂产品)。

1.2　成纤维细胞培养
取材于胸部烧伤后增生性瘢痕,采用组织贴块法进行原代培养。

培养液为20%FCS2BME(20%小牛血清培养基,basalmediumeagle,美国Gibco公司产品),含最终浓度青霉素、链霉素各100UΠml和0.03%L2谷氨酰胺,在5%CO2,37℃,饱和湿度和
3　上海第二医科大学附属第九人民医院整复外科(上海, 200011)95%空气条件下培养。

细胞融合后采用胰酶消化传代。

我们的实验在细胞第4、第5代完成。

1.3　药物对细胞生长的作用
细胞以2×105Π4ml培养液接种于25ml,底面积为12cm2培养瓶内。

培养24小时后,换用实验培养液。

浓度为丹参1.25,2.5及5mgΠml;川芎嗪125, 250及500μgΠml。

作用时间为24,48和72小时。

各浓度组、各作用时间组在培养结束计数后,每瓶接种细胞1×105Π4ml培养液,以不含药物的培养液继续培养4天,观察药物作用后细胞生长的恢复情况。

每浓度组和作用时间组均取3瓶细胞行苔盼蓝染色排除法活细胞计数,每瓶重复计数二次,取平均值,绘制生长曲线。

1.4　药物对细胞DNA合成的作用
调细胞浓度为0.4×105Πml,分种于24孔培养板,1mlΠ孔,一式三孔。

培养24小时后,换用实验培养液。

浓度为丹参1.25,2.5,5,10和20mgΠml;川芎嗪125,250,500,1000和2000μgΠml。

同时加入3H2 TdR,1μCiΠ孔,继续培养24小时后收集细胞,用β2液闪计数仪测其cpm值。

1.5　药物对细胞分裂指数的作用
细胞以0.5×105Π1.5ml培养液接种于装有盖玻片的小圆瓶内。

培养24小时后,换用实验培养液。

丹参和川芎嗪浓度同药物对细胞DNA合成作用,作用时间为1天～6天。

每24小时取样,固定,Gimsa
染色。

显微镜下观察2000个细胞,计算有丝分裂指数。

1.6　统计学处理
对实验数据采用t检验处理。

2　结果
2.1　药物对细胞生长的作用
丹参、川芎嗪对瘢痕成纤维细胞生长有明显抑制作用。

各剂量组与对照组以及各剂量组间均存在显著差异(P<0.01)。

经药物作用不同时间后,细胞在不含药物培养液中培养96小时,除丹参5mgΠml组,川芎嗪500μgΠml作用72小时组其生长增殖无恢复外,其它各组均可恢复。

2.2　药物对细胞DNA合成的作用
丹参在1.25mgΠml、川芎嗪在125μgΠml浓度下,即可明显抑制成纤维细胞胸腺嘧啶核苷的掺入,并随药物剂量增大而抑制作用增强,有明显的剂量依赖关系(表1,2)。

2.3　药物对细胞分裂指数的作用
丹参、川芎嗪各剂量组细胞分裂指数均低于对照组。

丹参5mgΠml以上浓度分裂指数为0。

2.5 mgΠml和1.25mgΠml时,分裂指数在第2天为最大值,分别在第4和第5天降为0。

川芎嗪在1000μgΠml以上浓渡时,分裂指数为0,其余浓度在第2天为最大值,均在第6天下降为0。

见图1～6。

图1　丹参对细胞生长作用曲线图　图2　丹参作用后细胞生长恢复改变示意图　图3　
丹参对细胞分裂指数作用曲线图
图4　川芎嗪对细胞生长作用曲线图　图5　川芎嗪作用后细胞生长恢复改变示意图　图6　川芎嗪对细胞分裂指数作用曲线图
表1　丹参对成纤维细胞3H2TdR掺入的影响(mgΠml)
药物浓度 cpmΠ孔 平均值　SE
20%FCS2BME 3802　4558　4736 5032 388
1.25 3440　3369　2979 3263 143
2.5 2237　2469　3291 2666 320
5.0 1200　1310　2174 1561 308
10.0 273 704 380 452 130
20.0 62 73 162 99 32
表2　川芎嗪对成纤维细胞3H2TdR掺入的影响(μgΠml)
药物浓度 cpmΠ孔 平均值　SE
20%FCS2BME 5802　4588　4737 5032 388
　125 3623　3632　3518 3519 37
　250 3432　3103　3144 3226 104
　500 2793　2869　2351 2671 161
1000 1899　1916　1661 1825 82
2000 387 455 683 505 91
3　讨论
增生性瘢痕和瘢痕疙瘩是现代医学的难题之一,尤其在治疗方面是临床上十分棘手的问题,国内外在此方面的基础研究和临床探索较多,但均未取得突破性的进展和令人满意的效果。

传统的治疗方法如手术切除、抗代谢药物、免疫抑制剂、类固醇激素和放射治疗等等,均因术后易复发或严重的全身性副作用而限制了临床使用。

张涤生等[3]将祖国医学中治疗瘢痕的黑布药膏处方予以改进,并结合锌氧软化膏的加压方法,创制了一种瘢痕软化膏,用于治疗增生性瘢痕,取得了较满意的疗效,且无明显的全身性副作用,说明采用中草药治疗增生性瘢痕,具有广阔的前景。

我们采用“活血化瘀”中草药制剂丹参和川芎嗪,探讨其对体外培养的瘢痕成纤维细胞的作用,证明上述药物可明显抑制瘢痕成纤维细胞的增殖。

3.1　药物作用的浓度效应
从细胞的生长曲线可以看出,药物在低浓度和高浓度时,对细胞的抑制效果不同。

在药物作用24小时,丹参 1.25mgΠml、2.5mgΠml和川芎嗪125μgΠml、250μgΠml均明显地抑制细胞增殖,但细胞数目与初始接种量相比仍有增加,说明对细胞尚无直接杀伤作用。

随着药物浓度升高,细胞数目进一步减少,甚至低于原初始接种量,说明高浓度时,药物对细胞有杀伤作用。

结合药物对细胞胸腺嘧啶核苷掺入的抑制作用,证明药物对成纤维细胞生长的抑制,主要通过影响细胞的DNA合成来完成。

3.2　药物作用的时间效应
药物对细胞增殖的抑制作用,有明显的时间效应关系。

随着药物作用时间的延长,抑制强度逐渐增强。

这在药物对细胞有丝分裂作用中尤为明显。

药物在浓度一定时,细胞分裂指数在第2天为最大值,随作用时间延长,分裂指数呈近乎直线下降,直至下降为0。

3.3　药物对细胞生长抑制作用的可逆性
丹参在较低浓度时对细胞的抑制作用是可逆的。

低于2.5mgΠml,在脱离药物环境后继续培养4天,细胞增殖开始恢复,而高于2.5mgΠml,则细胞的生长抑制作用是不可逆的。

在可逆剂量时,细胞生长的恢复还受到药物接触时间影响。

川芎嗪500μgΠml时,在药物作用24小时和48小时,细胞增殖可以恢复,而作用时间72小时,细胞增殖不能恢复。

增生性瘢痕的组织学特征是病变部位胶原的大量沉积。

虽然对这种改变的生物机制尚不清楚,但病变部位的胶原合成明显地高于正常皮肤[4,5]。

成纤维细胞是皮肤胶原的主要来源。

我们的实验证明,丹参和川芎嗪对体外培养的瘢痕成纤维细胞有明显地抑制作用,从理论上为临床采用中草药治疗增生性瘢痕提供了依据。

关于药物抑制瘢痕成纤维细胞生长的作用机制和中草药治疗增生性瘢痕的临床应用有待于进一步的探讨和研究。

4　参考文献
1　俞广声.桃仁治疗血吸虫病性肝硬化的研究.中医杂志, 1986;6(1):24
2　刘　成.人工冬虫夏草茵丝制剂治疗肝炎后肝硬化22例.上海中医杂志,1986;6(1):30
3　张涤生主编.整复外科学.上海:上海科技出版社,1979: 122～123
4　CohenIK.Cancollagenmetabolismbecontrolled:Theoretical considerations.JTrauma,1985;25(4):410
5　CohenIK,KeiserHR,SjoerdsmaA.Collagensynthesisinhu2 mankeloidandhypertophicscar.SurgForum,1971;23(2): 488
(收稿:1997208212　修回:1998208213)
THEINHIBITORYEFFECTINVITROOFSALVIAMILTORRHIZAANDTETRAMETHYL PYRAZINEONTHEGROWTHOFFIBROBLASTSΠShang Qingxin,Zhang Disheng,Guan Wen xiang et al.Department of Plastic Surgery,Shanghai9th People’s Hospital,Shanghai Second Medical University.Shanghai,P.R.China200011
Abstract Inordertoinvestigatetheinhibitoryeffectofsalviamiltiorrhiza(SM)andtetramethyl pyrazine(TP)onscartricialfibroblast,thehypertrophicscartissueofchestwaschosenforcultureoffi2 broblasts,andtheinfluenceofSMandTPonfibroblastswasobserved,Theeffectofthedrugsonthe growthoffibroblasts,onDNAsynthesisoffibroblastsandonmitosisindexoffibroblastswerealldeter2 minedquantitatively.Theresultsshowed:①SMandTPcouldinhibitsignificantlythegrowthofthefi2 broblasts,theinhibitoryeffectwasirreversiblewhentheconcentrationofthedrugsreached5mgΠmland 500μgΠmlrespectively;②SMandTPcouldinhibittheabsorptionof3H2TdRandthiseffectwascorre2 latedpositivelytothedosageofthedrugsand;③SMandTPcouldreducethemitosisindexoffibro2 blasts.ItwasconcludedthatSMandTPhaddefinitedepressiveeffectongrowthoffibroblastswhichwas correlatedpositivelywiththeconcentrationofdrugsanddurationofapplication.Theinhibitoryeffectof thedrugsonfibroblastswasmainlythroughinhibitionofsynthesisofDNA.
Keywords Salviamiltiorrhiza Tetramethylpyrazine Fibroblast Growthkinetics
第五届全国显微外科学术交流会和中青年优秀论文评选会
暨国际研讨会联合征文通知
中华医学会显微外科分会决定,于1999年10月在北京召开第五届全国显微外科学术交流会
和中青年优秀论文评选会暨国际研讨会。

现将征文有关事宜通知如下。

征文内容和论文要求:
1.显微外科的有关解剖和实验研究。

2.显微外科在外科各相关学科(脑、颌面、眼、耳鼻喉、烧伤整形、骨科、手外、泌尿、普外、妇科
等)临床应用研究。

3.请寄全文及400～600字的摘要(包括目的、方法、结果、结论)各一份。

摘要不符合要求者恕
不受理。

内容应是最新学术研究成果,力求科学性强、数据可靠、观点鲜明、论据充分、文字精练。

16开稿纸撰写(或打印均可)。

自留底稿。

4.来稿请寄北京复兴路28号解放军总医院骨科王　岩收,邮编100853,电话(010)66939436。

5.论文截止时间1999年6月1日。

6.凡参加中青年优秀论文评选者请在论文右上角注明“优”字样。

年龄在45岁以内,1954年
以后出生。

论文的第一作者必须是中青年医师本人。

有关会议的其它事宜,收稿后另行通知。

中华医学会显微外科分会
1998208 。