一种肠道菌群样本常温保存液及其制备方法和用途[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711482107.4
(22)申请日 2017.12.29
(71)申请人 深圳谱元科技有限公司
地址 518000 广东省深圳市福田区笋岗西
路3004号
(72)发明人 覃俊杰　杨仁涛　付志聪　
(74)专利代理机构 深圳市精英专利事务所
44242
代理人 张慧
(51)Int.Cl.
C12N 1/04(2006.01)
C12R 1/01(2006.01)
(54)发明名称一种肠道菌群样本常温保存液及其制备方法和用途(57)摘要本发明属于分子生物学肠道菌群领域，具体涉及一种肠道菌群样本常温保存液及其制备方法和用途。

包括如下组分：卡松防腐剂、乙二胺四乙酸二钠、Tris-HCl缓冲液、氯化锂、乙醇和无菌水；卡松防腐剂质量份数为0.2-1‰；乙二胺四乙酸二钠的摩尔份数为1-10mM；Tris-HCl缓冲液的摩尔体积份数为5-20mM；氯化锂的摩尔体积份数2mol/L；乙醇的体积份数为95％；无菌水的体积分数为0-3％。

所述的保存液可常温保存、运输肠道菌群样本；将采集的肠道菌群样本浸没在保存液中，常温条件下能维持样本中微生物结构组成的稳定。

因此可由受检者在任何时候都可完成样本采集和保存，
同时也方便样本的常温运输。

权利要求书1页 说明书10页 附图2页CN 108192827 A 2018.06.22
C N 108192827
A
1.一种肠道菌群样本常温保存液，其特征在于，所述保存液包括如下组分：卡松防腐剂、乙二胺四乙酸二钠、Tris-HCl缓冲液、氯化锂、乙醇和无菌水；所述卡松防腐剂占所述保存液总质量份数为0.2-1‰；所述乙二胺四乙酸二钠的摩尔份数为1-10mM；所述Tris-HCl缓冲液的摩尔体积份数为5-20mM；所述氯化锂的摩尔体积份数2mol/L；所述乙醇的体积份数为95％；所述无菌水的体积分数为0-3％。

2.如权利要求1所述保存液的制备方法，其特征在于，所述保存液的制备工艺如下：分别称取相应质量份的卡松防腐剂、和相应摩尔分数的的乙二胺四乙酸二钠和Tris-HCl缓冲液的氯化锂溶于对应体积的乙醇，混合均匀，再加入无菌水，常温保存，得到所述保存液。

3.如权利要求2所述保存液的制备方法，其特征在于，所述卡松防腐剂原液的浓度为
2.5％。

4.如权利要求3所述保存液的制备方法，其特征在于，所述乙二胺四乙酸二钠的PH为8.0。

5.如权利要求4所述保存液的制备方法，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液原液的浓度为1mol/L。

6.如权利要求5所述保存液的制备方法，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液的液体温度为25℃。

7.如权利要求1所述保存液和如权利要求1-6任一项所述方法在生物保藏领域中的用途。

权　利　要　求　书1/1页CN 108192827 A
一种肠道菌群样本常温保存液及其制备方法和用途
技术领域
[0001]本发明属于分子生物学肠道菌群领域，具体涉及一种肠道菌群样本常温 保存液及其制备方法和用途。

背景技术
[0002]肠道菌群，即人体肠道微生物的总称。

肠道不仅是人体消化吸收的重要 场所，同时也是最大的免疫器官，在维持正常免疫防御功能中发挥着极其重 要的作用。

人体肠道为微生物提供了良好的栖息环境，成人肠道内的微生物 数量高达10^14个，接近人体体细胞数量的10倍；质量达到1.2kg，接近人 体肝脏的质量；其包含的基因数目约是人体自身的100倍，具有人体自身不 具备的代谢功能。

这些微生物与人体共生，以人体摄入的食物以及肠道分泌 物为食，合成必须氨基酸，维生素，短链脂肪酸等重要物质进入人体，促进 宿主健康；相反，其中一些病原菌也分泌有害物质进入体内，损害宿主的健 康。

由于肠道菌群的复杂和多样性，人类对其结构多样性和功能重要性一直 缺乏足够的认知。

直至近几年，随着第二代测序等技术的发展，人们可以对 整个肠道菌群作为一个整体，对它所包含的所有基因进行分析。

这个基因的 大集合，就被称作宏基因组。

根据研究，这个基因组所包含的基因多达数百 万，是人类基因组的100倍之多，其中包含多个与物质代谢、免疫、信号相 关的基因群体。

通过对肠道菌群宏基因组的研究，有助于进一步挖掘肠道菌 群功能，更深层次的探究肠道菌群和人体健康的关系。

进一步研究发现，肠 道微生物与大量的疾病直接相关，甚至在许多疾病中扮演了病因的角色。

并 且，其中大量的疾病，例如肥胖，糖尿病，动脉粥样硬化，炎症性肠炎等都 是高发病率重要公共卫生问题。

[0003]由于肠道微生物寄居在人体的肠道内，因此最便捷，也是目前采用的最主要的 方式是研究人体排出的粪便的微生物，以此代表大肠内的共生微生物。

粪便采集之 后，通过提取细菌的总DNA，扩增核糖体16S rRNA可变区并测序，经过一系列生 物信息学分析，可以了解粪便中的细菌构成，进一步研究其和人体健康疾病之间的 关系。

[0004]粪便排出后，环境发生了极大的变化。

无氧环境转变成有氧环境，其中的部分 细菌还保持了活性，继续维持代谢和生长，而由于环境的变化，不同细菌其增长与 死亡的速率已经不同于排便前。

因此，为了保证样本采集的准确性，需要对粪便进 行一些保存措施，尽量将其中微生物的总量、组成、相对丰度等固定在刚刚离体时 的状态，从而最好的代表大肠中的共生微生物。

[0005]目前采用的保存方法为采集粪便后立即冻存于-20℃或者-80℃的冰箱中，且一 般认为-80℃可长期有效保存菌群样品。

由于细菌在低温状态下代谢速率极大的降 低，因此可以在一段时间内维持粪便中细菌的构成。

此种保存方法最大的缺陷，就 是所要求冻存条件在很多情况下难以实现。

如受检者自行采样，在样本采集完成后 到样本冻存这一段时间，由于保存条件、物流环境等因素，样本中菌群结构及丰度 可能已经发生很大变化，样本再用于检测实验已经无法保证准确性。

发明内容
[0006]为此，本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术的瓶颈，从而提出 一种保存液配方，使用此保存液，将采集的肠道菌群样本浸没在保存液中， 常温条件下能维持样本中微生物结构组成的稳定。

因此可由受检者在任何时 候都可完成样本采集和保存，同时也方便样本的常温运输。

[0007]为解决上述技术问题，本发明公开了一种肠道菌群样本常温保存液，所 述保存液包括如下组分：卡松防腐剂、乙二胺四乙酸二钠、Tris-HCl缓冲液、 氯化锂、乙醇和无菌水；所述卡松防腐剂占所述保存液总质量份数为0.2-1 ‰；所述乙二胺四乙酸二钠的摩尔份数为1-10mM；所述Tris-HCl缓冲液的 摩尔体积份数为5-20mM；所述氯化锂的摩尔体积份数2mol/L；所述乙醇的体 积份数为95％；所述无菌水的体积分数为0-3％。

[0008]本发明还公开了所述保存液的制备工艺如下：
[0009]分别称取相应质量份的卡松防腐剂、和相应摩尔分数的的乙二胺四乙酸 二钠和Tris-HCl缓冲液的氯化锂溶于对应体积的乙醇，混合均匀，再加入无 菌水，常温保存，得到所述保存液。

[0010]优选的，所述卡松防腐剂原液的浓度为2.5％。

[0011]优选的，所述乙二胺四乙酸二钠的PH为8.0。

[0012]优选的，所述Tris-HCl缓冲液原液的浓度为1mol/L。

[0013]更为优选的，所述Tris-HCl缓冲液的液体温度为25℃。

[0014]本发明还公开了所述保存液和任一项所述方法在生物保藏领域中的用 途。

[0015]本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：本发明所述的保存 液，可常温保存、运输肠道菌群样本；将采集的肠道菌群样本浸没在保存液 中，常温条件下能维持样本中微生物结构组成的稳定。

因此可由受检者在任 何时候都可完成样本采集和保存，同时也方便样本的常温运输；具有极大的 市场前景和经济价值。

附图说明
[0016]为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施 例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
[0017]图1是实验例所述阴性质控及阳性质控的提取示意图；
[0018]图2实验例中加入保存液的样品对核糖体16S rRNA基因第四可变区扩 增的影响示意图；
图3实验例汇总两份测序样本不同时间点物种分布结果(属)对比图。

具体实施方式
[0019]实施例1本实施例公开了一种肠道菌群样本常温保存液，所述保存液包 括如下组分：卡松防腐剂、乙二胺四乙酸二钠、Tris-HCl缓冲液、氯化锂、 乙醇和无菌水；所述卡松防腐剂占所述保存液总质量份数为0.5‰；所述乙 二胺四乙酸二钠的摩尔份数为5mM；所述Tris-HCl缓冲液的摩尔体积份数为 15mM；所述氯化锂的摩尔体积份数2mol/L；所述乙醇的体积份数为95％；所 述无菌水的体积分数为2％。

[0020]所述保存液的制备工艺如下：
[0021]分别称取相应质量份的卡松防腐剂、和相应摩尔分数的的乙二胺四乙酸 二钠和Tris-HCl缓冲液的氯化锂溶于对应体积的乙醇，混合均匀，再加入无 菌水，常温保存，得到所述保存液。

[0022]所述卡松防腐剂的原液的浓度为2.5％。

[0023]所述乙二胺四乙酸二钠的PH为8.0。

[0024]所述Tris-HCl缓冲液原液的浓度为1mol/L；所述Tris-HCl缓冲液的液 体温度为25℃。

[0025]实施例2本实施例公开了一种肠道菌群样本常温保存液，所述保存液包 括如下组分：卡松防腐剂、乙二胺四乙酸二钠、Tris-HCl缓冲液、氯化锂、 乙醇和无菌水；所述卡松防腐剂占所述保存液总质量份数为0.2‰；所述乙 二胺四乙酸二钠的摩尔份数为10mM；所述Tris-HCl缓冲液的摩尔体积份数 为5mM；所述氯化锂的摩尔体积份数2mol/L；所述乙醇的体积份数为95％； 所述无菌水的体积分数为3％。

[0026]优选的，所述保存液的制备工艺如下：
[0027]分别称取相应质量份的卡松防腐剂、和相应摩尔分数的的乙二胺四乙酸 二钠和Tris-HCl缓冲液的氯化锂溶于对应体积的乙醇，混合均匀，再加入无 菌水，常温保存，得到所述保存液。

[0028]所述卡松防腐剂的浓度为2.5％。

[0029]所述乙二胺四乙酸二钠的PH为8.0。

[0030]所述Tris-HCl缓冲液0.05mol/L。

[0031]所述Tris-HCl缓冲液的液体温度为25℃。

[0032]实施例3本实施例公开了一种肠道菌群样本常温保存液，所述保存液包 括如下组分：卡松防腐剂、乙二胺四乙酸二钠、Tris-HCl缓冲液、氯化锂、 乙醇和无菌水；所述卡松防腐剂占所述保存液总质量份数为1‰；所述乙二 胺四乙酸二钠的摩尔份数为1mM；所述Tris-HCl缓冲液的摩尔体积份数为5 mM；所述氯化锂的摩尔体积份数2mol/L；所述乙醇的体积份数为95％；所述 无菌水的体积分数为0.1％。

[0033]所述保存液的制备工艺如下：
[0034]分别称取相应质量份的卡松防腐剂、和相应摩尔分数的的乙二胺四乙酸 二钠和Tris-HCl缓冲液的氯化锂溶于对应体积的乙醇，混合均匀，再加入无 菌水，常温保存，得到所述保存液。

[0035]所述卡松防腐剂的浓度为2.5％。

[0036]所述乙二胺四乙酸二钠的PH为8.0。

[0037]所述Tris-HCl缓冲液0.05mol/L。

[0038]所述Tris-HCl缓冲液的液体温度为25℃。

[0039]实施例4本实施例公开了实施例1-3任一所述保存液和制备方法在生 物保藏领域中的用途。

[0040]使用注意事项：
[0041]采样之前，在无菌采样管中加入适量保存液；
[0042]采样过程中务必避免尿液对粪便的污染，因此，在排便前请先排尿。

[0043]为避免由于局部采样造成的误差，建议从中后段粪便进行分点采样(一般不少 于3个采样点)，并且尽量刮取粪便的中间部分。

[0044]使用采样棒采集样本后，立即放入采样管中，震荡混匀，使所有样本均浸没在 保存液中。

[0045]核酸提取前，14000rpm离心5min，去上清收集沉淀，后续可按照相应提 取实验操作标准流程执行。

[0046]实验例
[0047]效果测试实验
[0048]8.1样品选择
[0049]用无菌采样杯采集2份不同人足量的粪便样品，快速冻存。

[0050]8.2实验流程
[0051]8.2.1样品预处理
[0052] a.取出采集的粪便样品解冻，使用灭菌手术刀片切开，去除表面部分；
[0053] b.每份样品随机取20个点，每点取出0.2g粪便样品，低温冻存；
[0054] c.为测试随不同时间点此保存液的保存效果，设置5个时间点：0d、1 d、3d、7d、9d，每个时间点4个重复，0d即为在分装好的样品中加入1000 ul保存液，震荡混匀后立即低温冻存，1d即为加入1000ul保存液后常温放 置24h再低温冻存，以此类推、
[0055]8.2.2核酸提取
[0056] a.按照宏基因组DNA提取标准操作流程，对经预处理后的各时间点样品，另加 入4份未加入1000ul保存液的样品作为对照，提取实验中设置阴性质控及阳性质 控；提取结果如表1和图1、图2所示：
[0057]表1
[0058]
[0059]
[0061]通过表1和图1、图2结果表明，各时间点各重复样本在使用此保存液后， 对核酸提取实验无影响，成功率、纯度、总量均可保证。

其中测试样本1较2提取 浓度低，是由于样本间差异。

标记为M为分子量标记，其中各亮带对应不同DNA分 子大小。

[0062] b.提取完成后的DNA稀释至一定模板浓度。

[0063]8.2.3扩增建库
[0064] a.针对所有样品及质控样品扩增16S第四可变区(V4)，扩增实验中设置阴性 质控及阳性质控；
[0065] b.将所有样品构建测序文库。

[0066]扩增结果如表2和图3所示：
[0067]表2
[0068]
[0070]通过表2和图3结果表明，各时间点各重复样本在使用此保存液后，对核糖体 16S
rRNA基因第四可变区(V4)扩增实验无影响，成功率、纯度、总量均可保证。

其中，有亮色条
带并且位置在300bp-400bp左右，则表示成功扩增了核糖体16S rRNA基因第四可变区(V4)引物对应的目的片段。

标记为M为分子量标记，其中 各亮带对应不同的DNA分子大小。

[0071]8.2.4测序
[0072]所有样品同一次run测序，测序平台为illumina Miniseq。

[0073] 6.3数据分析
[0074]所有样本数据下机后，按照16S标准生物信息分析流程分析，得出分析结果。

[0075]对科属做了测试
[0076]两份测序样本不同时间点物种分布结果(属)上述结果表明：
[0077]1)从科、属水平上，两份测试样本在保存液中各时间点均能保持很好的稳定 性。

[0078]2)图1表示在科水平上物种结果，柱状图中每一根柱表示其中一份样品某一 时间点，经鉴定得到的所有肠道菌群的物种分布，每一种颜色表示一个属。

每个时 间点的4个重复标记为A到D。

由此可见，不同样本之前差异较大，同一份样本在 不同时间点无显著差异。

[0079]3)基于属水平的细菌相对丰度构成如图2所示，每一个柱子代表的是其中一 份样品在某一个时间点鉴定得到的物种分布，若某一种细菌占的比例多，则其在柱 子中所占的比例就会更大。

[0080]4)基于细菌丰富度，菌群关系，以及菌属构成的分析，得知本发明所述保存 配方，其效果不亚于冻存处理的保存方案。

[0081]以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，并不用作对本发明 保护范围的限定。

[0082]显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式 的限定。

对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做 出其它不同形式的变化或变动。

这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。

而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之 中。

图1
图2
图3。