口服多烯紫杉醇纳米粒的制备及载药量测定

口服多烯紫杉醇纳米粒的制备及载药量测定
刘代莉;毛丽燕;路文娟;赵刚
【摘要】目的制备口服多烯紫杉醇纳米粒溶液并用HPLC法测定其载药量.方法采用乳化溶剂挥发法制备口服多烯紫杉醇纳米粒溶液,建立HPLC法测定纳米粒药物的含量,进行方法学验证并计算其载药量.结果多烯紫杉醇质量浓度在0.20～3.40 mg·mL-1 (r=0.999 8)范围内线性关系良好,仪器精密度良好.平均回收率为98.98％,RSD值为3.20％(n=5).平均载药量为3.84％,RSD值为2.27％.结论HPLC法可用于测定该纳米粒多烯紫杉醇的载药量.
【期刊名称】《西北药学杂志》
【年(卷),期】2019(034)004
【总页数】4页(P523-526)
【关键词】多烯紫杉醇;纳米粒;HPLC法;载药量
【作者】刘代莉;毛丽燕;路文娟;赵刚
【作者单位】济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院,济南250200;山东省医学科学院药物研究所,济南250062;国家卫生部生物技术药物重点实验室,济南250062;济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院,济南250200;山东省医学科学院药物研究所,济南250062;国家卫生部生物技术药物重点实验室,济南250062;济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院,济南250200;山东省医学科学院药物研究所,济南250062;国家卫生部生物技术药物重点实验室,济南250062;济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院,济南250200;山东省医
学科学院药物研究所,济南250062;国家卫生部生物技术药物重点实验室,济南250062;山东省罕少见病重点实验室,济南 250062
【正文语种】中文
【中图分类】R94
多烯紫杉醇(DTX，分子式C43H53NO14)是一种从欧洲紫杉中获得的半合成衍生物，系紫杉烷类抗肿瘤药物，广泛应用于乳腺癌、肺癌、卵巢癌和前列腺癌等治疗[1-3]，其作用机制是通过与游离的微管蛋白结合，促进微管蛋白装配成稳定的微管，同时抑制其解聚，能使细胞分裂处于G2/M期，从而抑制癌细胞的有丝分裂和增殖，进而抑制肿瘤细胞的生长。

多烯紫杉醇对肿瘤细胞的细胞毒性作用比紫杉醇高约2～4倍[4-5]，是一种BCS Ⅳ类药物，几乎不溶于水，肠道上皮细胞渗透性低，部分原因是P-糖蛋白(P-gp)介导的外排，还存在细胞色素P450介导的首过效应，这些因素限制了口服多烯紫杉醇的肠道吸收，并影响生物利用度 [6]。

目前，市场销售的多烯紫杉醇注射液中含有溶剂聚山梨酯-80，其作用是增强多烯紫杉醇的溶解度。

但具有明显的不良反应，如变态反应、体液潴留和外周神经毒性等[7-8]，另外，频繁的静脉注射不适用于慢性疾病的癌症患者。

口服给药通常优于静脉注射给药，可提高患者用药的安全性和顺应性，给药方便，患者依据医嘱准确调整剂量，满足临床个性化治疗要求，实现精准治疗，同时还可降低给药成本[9-10]。

多烯紫杉醇作为抗肿瘤一线用药，临床迫切需要将其研制成安全、有效的新型制剂。

1 仪器与试药
1.1 仪器 UltiMate3000高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)；FA2004N 万分之一电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；SK-1快速混匀器(金坛市国旺实
验仪器厂)；SK-250H医用超声仪(上海科导超声仪器有限公司)；SZ-93自动双重
纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)；数显高速分散均质机(上海标本模型厂)。

1.2 试药多烯紫杉醇对照品(成都植标化纯生物技术有限公司，批号160610)；纳
米粒(自制)；乙腈[色谱纯，霍尼韦尔贸易(上海)有限公司]；卵磷脂(上海艾韦特医
药科技有限公司)；二氯甲烷(分析纯)，无水乙醇，均为天津市富宇精细化工有限
公司；水为双重蒸馏水。

2 方法
2.1 多烯紫杉醇最大波长的选择称取20 mg多烯紫杉醇原料药，置于10 mL量瓶中。

加入流动相(乙腈∶水=55∶45)使其溶解并定容至刻度，混匀，即得质量浓度
为2 mg·mL-1的溶液。

量取1 mL质量浓度为2 mg·mL-1的溶液，稀释10倍，即得质量浓度为200 μg·mL-1的溶液。

量取4 mL质量浓度为200 μg·mL-1的溶液，置于10 mL量瓶中，用流动相定容，混匀，得到质量浓度为80 μg·mL-1的
溶液。

通过紫外可见分光光度计在200～400 nm波长范围内进行扫描，结果表明，在230 nm波长处多烯紫杉醇有最大吸收峰。

因此多烯紫杉醇检测波长选择230 nm。

2.2 口服多烯紫杉醇纳米粒溶液的制备口服多烯紫杉醇纳米粒通过乳化溶剂挥发
法制备。

油相为多烯紫杉醇原料药、槲皮素、卵磷脂(质量比为1∶1∶20)，多烯紫杉醇、槲皮素溶于无水乙醇，卵磷脂溶解于二氯甲烷，水相是20 g·L-1聚山梨酯-20溶液，在高速剪切的作用下，将油相缓慢匀速注入水相中。

挥发有机溶剂，经0.20 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.3 空白纳米粒溶液的制备空白纳米粒通过乳化溶剂挥发法制备。

精密称定槲皮
素和卵磷脂(质量比为1∶20)，槲皮素溶于无水乙醇，卵磷脂溶解于二氯甲烷，二者混合均匀作为油相。

以20 g·L-1聚山梨酯-20溶液为水相，在高速剪切的作用下，将油相缓慢匀速注入水相中。

挥发有机溶剂，经0.20 μm微孔滤膜过滤，即
得。

2.4 色谱条件流动相：乙腈∶水(55∶45)；色谱柱：TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；检测波长：230 nm；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL。

2.5 多烯紫杉醇储备液的制备用分析天平称取100 mg多烯紫杉醇，置于10 mL
量瓶中，加入流动相使其溶解并定容至刻度，混匀，即得质量浓度为10 mg·mL-
1的多烯紫杉醇储备液。

2.6 方法专属性考察按照2.4项下色谱条件对多烯紫杉醇原料药、空白纳米粒和载多烯紫杉醇纳米粒进行色谱分析，色谱图见图1。

图1 HPLC专属性色谱图
A.空白纳米粒；
B.多烯紫杉醇对照品；
C.载多烯紫杉醇纳米粒；1.多烯紫杉醇。

Fig.1 HPLC specificity chromatograms
A.blank nanoparticles;
B.docetaxel;
C.nanoparticles loaded with docetaxel；
1.docetaxel.
结果表明,理论塔板数>5 000。

在该色谱条件下，多烯紫杉醇对照品和载多烯紫杉醇纳米粒的保留时间均为9.517 min，表明原料药与载多烯紫杉醇纳米粒具有相同的保留时间，辅料不干扰多烯紫杉醇的测定，该方法专属性良好。

2.7 检测限和定量限将多烯紫杉醇原料药配制成不同质量浓度的溶液，进行色谱
分析。

在信噪比为3∶1时，最低检测质量浓度为1.0 μg·mL-1，信噪比为10∶1时，定量限质量浓度为5.3 μg·mL-1。

2.8 标准曲线分别精密量取多烯紫杉醇储备液0.2，1.0，1.8，2.6 和
3.4 mL，置于10 mL量瓶中，用流动相稀释并定容，混匀，得质量浓度分别为0.2，1.0，1.8，2.6和3.4 mg·mL-1的系列对照品溶液，按照2.4项下色谱条件进样分析，记录
峰面积。

以多烯紫杉醇质量浓度为横坐标(x)、以峰面积为纵坐标(y)，n=5，绘制
标准曲线。

多烯紫杉醇的线性方程为y=205.85x-0.696 5，r=0.999 9，结果表明，多烯紫杉醇质量浓度在0.20～3.40 mg·mL-1范围内，峰面积与质量浓度呈良好
的线性关系。

2.9 精密度考察分别量取2.5项下制备的多烯紫杉醇储备液0.2，1.0和1.8 mL，置于10 mL量瓶中，用流动相稀释并定容，混匀，得0.2，1.0和1.8 mg·mL-13个不同质量浓度的多烯紫杉醇溶液，3个质量浓度分别于一天内重复测量5次，连续测量5 d，记录色谱图，计算日内精密度和日间精密度。

见表1。

表1 多烯紫杉醇精密度实验结果
Tab.1 Results of docetaxel accuracy and precision tests (n=5)质量浓度
/mg·mL-1日内精密度x±sRSD/%日间精密度
x±sRSD/%0.245.28±0.080.1846.66±1.142.441.0200.16±0.620.31198.47±4.1 42.091.8346.22±0.440.13347.81±0.910.26
结果表明，低、中和高3个质量浓度的日内精密度及日间精密度的RSD值均小于5%，仪器精密度良好。

2.10 准确度考察精密量取200 μL 2.3项下制备的空白纳米粒溶液3份，分别加
入质量浓度为10.00 mg·mL-1的多烯紫杉醇对照品储备液30，60 和120 μL，
加入流动相稀释至1.00 mL，混匀，即得低、中和高3个质量浓度的待测溶液。

按照2.4项下色谱条件进行色谱分析，记录色谱图，计算回收率和RSD值。

见表2。

表2 加样回收率测定结果
Tab.2 Results of recovery tests (n=5)编号不同加入量(mg)的回收率
/%0.30.61.2199.7795.2199.662100.7595.12100.873100.7395.28101.614100. 7395.43101.355101.1595.61101.49x±s100.63±0.5195.33±0.19100.99±0.79R SD/%0.510.200.78
结果表明，低、中和高3个质量浓度的平均回收率为98.98%，RSD值为3.20%。

2.11 溶液稳定性考察配制质量浓度为0.4 mg·mL-1的样品溶液，分别在配制后
的第0，3，6，9和12 h取样，按照2.4项下色谱条件进样分析，记录峰面积，
计算RSD值为0.86%(n=5)，表明药物溶液在12 h内稳定性良好。

2.12 载药量测定按照2.2项下方法制备口服多烯紫杉醇纳米粒溶液，按照2.4项
下色谱条件进行色谱分析。

记录色谱图，按照外标一点法计算，用于检测多烯紫杉醇含量，按公式：载药量=(纳米粒中含药量÷纳米粒总质量)×100%，包封率=(包封的药物质量÷总的药物质量)×100%，计算载药量和包封率。

见表3。

表3 载药量测定结果
Tab.3 Drug loading measurement results (n=3)批号投入量/mg包封率/%载药量/%x±sRSD/%20180922-14.5486.003.903.84±0.0872.2720180922-
24.5485.593.8820180922-34.5482.513.74
结果表明，3批样品的载药量分别为3.90%，3.88%和3.74%，平均值为3.84%，RSD值为2.27%。

3 结论
本文采用乳化溶剂挥发法制备口服多烯紫杉醇纳米粒溶液[11-12]，结果表明，多
烯紫杉醇在230 nm波长处有最大紫外吸收波长，通过HPLC法进行色谱分析并
测定多烯紫杉醇的载药量[13-15]。

此方法专属性较好，其在检测范围(0.20～3.40 mg·mL-1)线性关系较好，日内精密度和日间精密度RSD值均小于5%，提取回收率平均值为98.98%(RSD<5%)，平均载药量为3.84%，RSD值为
2.27%(RSD<5%)，其数据良好。

因此，该方法准确、可靠，可用于多烯紫杉醇纳米粒的含量测定。

4 讨论
多烯紫杉醇的最大吸收波长为 230 nm，而纳米粒中的卵磷脂和槲皮素在相同波长
下也有吸收，因此不宜采用紫外分光光度法测定纳米粒中多烯紫杉醇的含量。

故选择专属性较高的HPLC法，以乙腈-水(55∶45) 为流动相，该流动相配比简单，色谱柱平衡迅速，操作简便，测量值准确、可靠。

口服给药是一种最广泛、简便、安全的给药途径，剂型主要是片剂、胶囊剂、混悬剂、溶液剂和乳剂等。

口服给药一般是经胃肠道黏膜和肠上皮细胞吸收，进入血液循环系统，所以口服给药基本上可发挥全身作用。

相对非口服给药而言，口服给药疼痛减少、患者用药方便，顺应性强、交叉感染风险低、成本低，可避免额外的程序 [16-18]。

注射给药的顺应性差，多数情况下不仅有疼痛感或不适感，而且需要医护人员帮助，注射给药后，药物瞬间达到体内，血药质量浓度可能超过治疗窗，造成毒性和不良反应，由于注射给药后药物直接进入组织液或者血浆，导致用药的不安全因素增加。

恶性肿瘤是阻碍社会经济发展的重大公共卫生问题[19]，多烯紫杉醇作为一线广谱的抗癌药物，具有良好的抗癌作用。

降低毒性、提高药效、用药方便、给药剂量准确是亟需解决的问题。

口服多烯紫杉醇纳米溶液制剂需要克服水溶性差、胃肠道渗透性低、胃肠道酶及细胞色素P450介导的首过效应等的主要障碍。

提高生物利用度，减少对胃肠道的刺激，使制剂给药更加安全、有效、方便，是口服多烯紫杉醇纳米制剂需要实现的目标。

目前临床上对于多烯紫杉醇迫切需要一种安全、有效的新剂型[20]。

本实验制备的口服多烯紫杉醇溶液制剂为治疗癌症提供了新途径。

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