基因工程克隆载体09

柯斯质粒载体
柯斯质粒载体
粘粒载体，由Collins和Hohn于1978年构 建末D质N端粒C特Ao位载的点sm点体c：oid的s:位质Mc质o点C粒s粒Ss和复、i。te质制选-是ca粒子择人rc（ 相 体 但r复、标yo工末外 不距sp制位记构l端包 产适a子点s建m宜酶装 生的及的id的，，子特包,含带c高代能殊装o有有效识s类位序λ粘转别型点列性染两的），个， ①具有质粒和λ噬菌体载体的双重特点 ②可以插入较大的外源基因（31～45kb）
基因工程中由于使用非接合型质粒，因 此质粒的转移需人工条件，一般是用化学 （氯化钙）、物理（电击）或其它方法 （脂质体）改变细胞膜通透性，使质粒 DNA进入细胞，该过程叫转化
质粒在自然条件下可从宿主菌中消失，组 质粒的丢失是非常不幸的事
可促使质粒丢失的因素：吖啶橙、结晶 紫、溴化乙锭、利福平、SDS、紫外线等
质粒载体的概念
质粒载体是以细菌天然质粒的各种组件 为基础，经人工改造、构建而成的特殊质 粒
外源基因的载体，是基因工程的工具
质粒的基本条件
1、复制起点：自我增殖，一个或两个 （shuttle ） 2、标记基因
标记基因
选择标记基因：用于鉴别目标 DNA （载体）的存在，将成功转化了载体的宿 主挑选出来
YAC 能容载长达900～1000kb片段。 缺点: 1) 存在嵌合现象(chimerism) ,即一个YAC克 隆中的插入子可能来自两个或多个不同的 片段,嵌合体的比例达到10 %～50 % ,这种 现象使染色体步行(chromosome walking) 和基因分离难度加大; 2) 稳定性差,插入片段存在重排和丢失现象; 3) 插入片段的分离和纯化困难; 4) 转化效率低。
单链噬菌体载体
单链噬菌体包括M13、f1、fd，均为丝状， 亲缘关系密切，长度均为6.4kb，单链环状正股 DNA分子
优点： 胞内为双链，胞外为单链。复制型为双链环 状DNA，可按细菌质粒使用。单链可用作测序、 制备探针、定点诱变。无论双、单链，均不需 包装即可感染大肠杆菌，体内包装不受DNA分 子大小限制
细菌人工染色体( BAC)
BAC载体系统是在大肠杆菌F 因子的基 础上发展而来的,F 因子具有稳定遗传的特 点,其复制是严紧型的,在每个细胞中仅有 1～2 个拷贝,减小了插入片段发生重组的机 率
容载能力一般为100～350kb
优点
1) 以大肠杆菌为寄主,转化率高,构建更容易; 2) BAC 载体以环型超螺旋状态存在,从大肠 杆菌中提取较方便 3) BAC 的复制子来源于F 因子,可稳定遗传, 嵌合及重组现象少 4) 克隆位点的两侧具有T7 和Sp6 聚合酶启 动子,可以用于转录获得RNA 探针或直接用 于插入片段的末端测序
常用质粒载体
克隆载体 克隆载体主要
用于扩增或保存 DNA 片段
pBR322系列
pUC系列
pUC18/19
pGEM系列：多 功能质粒载体是 由pUC质粒改建 而来。在多克隆 位点两侧多了两 个来自不同噬菌 体的启动子，即 T7和SP6启动子， 可用于克隆、表 达、转录及测序 等。
质粒载体的受体细胞
基因工程载体与受体细胞
Vector and host cell
目录
载体的概念 载体应具有的特性 载体的类型
载体的概念
目的外源基因分离后，是无法自主进入 到宿主细胞并进行复制表达的，必须有一 个运载工具将其运达宿主细胞，才能达到 复制、扩增和表达的目的
将外源目的基因带入宿主细胞并能与其 一起复制、表达的基因运载工具就叫做基 因载体或基因工程载体
筛选标记基因：用于将特殊表型的重组 子挑选出来
选择标记
氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance
gene, Ampr）
四环素抗性基因（Tetracycline resistance
gene,Tetr）
氯霉素抗性基因（chloramphenicol
resistance gene, Cmr, cat）
按照所需宿主细胞的类型分： 真核（表达）载体 原核（表达）载体 穿梭载体
质粒载体
Plasmid
质粒
定义：独立于染色体的自主复制的DNA 物质。编码非染色体控制的遗传性状
特性
1、复制 通常一个质粒含有一个与相应的顺式作
用控制要素结合在一起的复制起始区（整 个遗传单位定义为复制子）
复制子(Replicon)：Genome能独立进行 复制的单位，每个复制子都含有一个复制 起点
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基因工程中使用的菌株叫做工程菌， 都是经过人工筛选、改造的菌株
受体菌的人工改造是接受外源DNA和 阳性转化子筛选的基础，改造重点：R — （限制阴性）、M—（修饰阴性）、red — （重组缺陷型，即不能与外DNA发生重组） 及抗性，与载体的表型互补（LacZΔ M15）
（1）DH5α 具有α－互补作用，适用于多 种质粒载体 （2）HB101 无α－互补作用 （3）JM系列 具有α－互补作用
2、拷贝数
严紧型（stringent plasmid）:低拷贝
松弛型（ralaxed plasmid）：高拷贝
质粒
复制子
拷贝数
pBR322 及其衍生质粒
pMB1
15～20
pUC 系列质粒及其衍生质粒 突变的 pMB1
500～700
pACYC 及其衍生质粒 pSC101 及其衍生质粒
ColE1
p15A pSC101 ColE1
10～212 ～5
15～20
3．质粒的不相容性（plasmid incompatibility） 两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称
质粒的不相容性。不相容的质粒一般都利用 同一复制系统
4、生物学特性（分子标记） 质粒可以赋 于宿主细胞不同的表型，如抗药性、结合 转移特性、产肠毒素或溶血素等
质粒表型的表示法：F+/F-、Ampr/Amps、 Tetr/Tets、Ampr/Tets、 Kanr、Strr、Cmlr、 Neor
α-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基
因区段的突变体与带有完整的近操纵基因 区段的 β-半乳糖苷酶（β -galactosidase ， 由 1024 个氨基酸组成）突变体之间实现 互补 2. 插入失活 3. GFP
筛选标记
2. 插入失活 3. GFP
质粒的基本条件
3、若干限制酶单一识别位点 4、小的分子量、高的拷贝数
基因操作的核心工具
载体应具有的特性
在受体细胞中可以独立地进行自我复制。 因此，载体本身必须是一个复制单位即复 制子（replicon），具有复制起始点，而且 插入外源基因后不会影响载体自身的复制 能力。
能够带动一定长度的外源基因一起复制 易于引入宿主细胞
在宿主细胞中具有尽可能多的拷贝数， 以利外源基因扩增
pEMBL(f1与pUC8组成) pBluescript(f1与pBR322组成)。 pGEM-T Easy (3kb)，俗称“T载体” （pGEM与f1组成） pUC118/119(M13与pUC18组成)
噬菌体的受体菌
λ噬菌体的常用宿主菌均为大肠杆菌，但 不同性质的载体应选择不同遗传标记的菌株。 应查有关资料
野生型λ噬菌体基因组DNA 的MW为48Kb,所 以包装上限：105% ×48Kb=51Kb
必须区段28 Kb，所以克隆能力为51-28=23 Kb
λ噬菌体作为载体的优点： a. 可容纳较大的外源DNA片段 b.具有较高的感染效率 c.由于λ能裂解宿主细胞，容易提取λ载体 DNA或重组λD噬菌体载体
双链DNA噬菌体载体 单链DNA噬菌体载体
双链DNA噬菌体载体
噬菌体λ是一种双链DNA病毒，大小约 48 502bp ，在噬菌体颗粒中它是以线状 形式存在，线状分子的两端有一个12个核 苷酸的、5‘-端突起的、可互补的粘性末 端（Cohesive end site, COS）。当λ侵入 宿主细胞后，线状DNA分子借助粘性末端 连结成环状分子
5、质粒的转移和丢失（清除）
带有一个tra基因，可以自主地在宿主细胞间 通过控制细菌配对和结合而发生转移的质粒叫接 合型（conjugative）质粒，又叫自我转移性质粒。 无此基因而无此功能者叫非接合型或非自我转移 性质粒（no-conjugative plasmid）
非自我转移性质粒：R质粒、Col质粒 自我转移性质粒：F质粒及Ent质粒（可产生肠 毒素）
载体的类型
按其来源和本质可分为以下7种： 质粒载体(plasmid) 噬菌体载体 COS质粒（cosmid）。也叫粘粒载体。 是质粒与λ的组合 噬菌粒载体（phagemid）是质粒与f1的 组合 病毒载体 DNA病毒为主 人工染色体载体 穿梭载体（shuttle）
按功能区分： • 克隆载体：也叫转移载体，只起转运， 扩增作用 • 表达载体：带有表达功能，即有启动子， 可转录和/或翻译 • 测序载体：只产生单链DNA用于测序， 如M13、T载体、U载体 • 转录及调控载体
在质粒非必需区有供外源基因插入的多 克隆位点（multiple cloning sites, MCS）
具有一定的容纳外源基因的幅度，即容 量
具有合适的选择标记
载体的分子量要小：降低对转化率的影响； 利于容纳较大的外源基因；拷贝高；易于分 离；减少了不必要酶切位点
在细胞中稳定性高 易于从宿主细胞中分离、纯化和鉴定 质粒本身必须是安全的 最好具有广泛的宿主适应性、核酸序列背 景清楚
M13最常用的宿主菌为JM系列（JM101～ 110）
酵母人工染色体( YAC)
真正的人工染色体要在寄主细胞中稳定 地复制并遗传下去,必须具备三个元件: 复 制起始区(origin of replication) ,参与染色 体DNA 复制起始结构的形成;着丝粒 (centromere) ,负责染色体向子细胞的传递; 端粒(telomere) ,对染色体DNA 两个末端 起封口和保护作用
卡那霉素和新霉素抗性基因
（kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor）
蔗糖致死基因 SacB ：含蔗糖的培养基上 sacB 基因的表达对大肠杆菌来说是致死的，因
此该基因可用于插入失活筛选重组子
筛选标记
1. α-互补（α-complementation）
噬菌粒（phagemid, phasmid）
质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的 载体
优点：分子量小（3.0Kb）、克隆能力大 （>10Kb）、稳定遗传以及用来制备单链 或双链DNA（有辅助病毒存在时，载体就 以噬菌体的模式增殖，产生单链DNA。若 无辅助病毒存在，则以质粒的形式复制， 产生双链DNA）等