稳定细胞系建立学习

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收稿日期：２００８１１１３修回日期：２００８１２１１电子信箱：ｗｅｉｈｕｌａｉ＠ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ通讯作者，
置于３７℃、５％ＣＯ当孔内贴壁细２的孵箱中培养过夜，胞达到９０％～９５％时进行转染。在加入脂质体包被的ＤＮＡ前２ｈ，６孔板中细胞培养液换为无血清培养基继ｅｐＧ２细胞孵育期间，用ｐＨ７．２续培养。在待转染的Ｈ的ＤＭＥＭ分别将４μ ｇ的ｐＣＩｎｅｏｍｄｒ１和１０ｌ的脂质 ? ? μ 体（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）各稀释至２５０ｌ，轻柔混合后，室温下 μ
［３］
，同时，首次发现胰
［４］
ｄｒ１／Ｐｇｐ表达增高岛素抵抗的肝癌细胞ｍ ?
。藉此，本
研究将携带人类全长ｍｄｒ１ｃＤＮＡ重组表达质粒ｐＣＩ ? ｎｅｏｍｄｒ１转入人肝癌ＨｅｐＧ２细胞，成功地筛选出高效、 ? ｅｐＧ２／ｍｄｒ１，稳定且耐药机理明确的多药耐药细胞株Ｈ并测定了其生长曲线、ｍｄｒ１ｍＲＮＡ和Ｐｇｐ的表达及Ｐ ? ? ｇｐ的功能等生物学特性，为进一步研究肝癌细胞耐药ｇｐ的关机制及其逆转，以及肝癌细胞胰岛素抵抗与Ｐ ? 系提供理想的细胞模型。
１材料与方法
１．１材料１．１．１重组质粒与细胞人肝癌细胞株ＨｅｐＧ２细胞由兰州大学医学实验中心保存，携带有人类全长ｍｄｒ１ＣＩｎｅｏｍｄｒ１由四川大学医学中心ｃＤＮＡ的重组质粒ｐ ? ? 构建和惠赠。１．１．２试剂ＬｉｐｏｆｅｃｔＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ、质粒提取２３（Ｒｈ１２３）、低糖试剂盒购自北京天根公司；罗丹明１ＤＭＥＭ培养基购自Ｓｉｇｍａ公司；阿霉素（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ，
中图分类号Ｑ８１３肝癌的综合治疗中化疗是目前最重要的方法之一，但多药耐药现象的产生是影响其疗效的瓶颈
［１．２］
ＡＤＭ）为浙江海正药业股份有限公司产品；Ｔｒｉｚｏｌ为Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品；ＡＭＶ、ＰＣＲ试剂盒、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ两步法ＲＴＰＣＲ实时荧光定量试剂盒和ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ ? 购自ＴａＫａＲａ公司；ｍｄｒ１、ａｃｔｉｎ引物由ＴａＫａＲａ公司合 β ? 成。其余试剂均为进口或国产分析纯。１．２方法１．２．１ｐＣＩｎｅｏｍｄｒ１重组质粒的提取与纯化用携带 ? ? 有人类全长ｍｄｒ１ｃＤＮＡ重组表达质粒ｐＣＩｎｅｏｍｄｒ１转 ? ? 化感受态细胞ＪＭ１０９后，涂布在含有氨苄青霉素的ＬＢ平板上，挑取单个的阳性菌落接种于含有氨苄青霉素的ＬＢ中，震荡培养过夜。提取、纯化质粒，经ＰＣＲ鉴定为阳性，并测定其浓度的质粒溶液置于－２０ ℃备用。１．２．２ＨｅｐＧ２细胞的培养及ｐＣＩｎｅｏｍｄｒ１的转染复苏 ? ? ｅｐＧ２细胞转于含１０％新生牛血清的低糖ＤＭＥＭ完后的Ｈ全培养基中，在３７ ℃、５％ＣＯ、饱和湿度条件下培养，每周２传代２～３次，取对数生长期的细胞用于试验。转染前１ｄ，取生长状态良好的ＨｅｐＧ２细胞，常规消化后，用无抗生素的完全培养基稀释至浓度为１×
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中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｖｏｌ．２９Ｎｏ．５２００９
静置２０ｍｉｎ，形成脂质体／ＤＮＡ混合物后。按比例依次加入６孔板的相应孔内，轻轻摇晃混匀后。于３７ ℃孵育２４ｈ后，消化传代。１．２．３ＨｅｐＧ２／ｍｄｒ１细胞的筛选与传代将上述转染后的细胞消化传代于含１５％血清的完全培养基中培养２４ｈ后，即转染后的第２ｄ，换为含有１２００μ ｍｏｌ／ＬＧ４１８的完全培养基中培养；而转染后的第３ｄ，弃细胞培养Ｈ７．２的ＰＢＳ洗涤２次后，加入９００μ ｍｏｌ／Ｌ液，用ｐＧ４１８完全培养基继续培养４ｄ，中间用同样的方法换液ｄ，通过有限稀释法获取单克隆细一次；直至转染后第７胞，在筛选培养基中Ｇ４１８的浓度降至正常培养时的维持浓度，即６００μ ｍｏｌ／Ｌ，每隔２ｄ更换培养液一次，持续筛选２０ｄ时，细胞开始稳定生长、分裂。继续培养３ｄ以便扩大细胞。扩大培养后的细胞按照常规方法消化传代，培养４１８的终浓度为６００μ ｍｏｌ／Ｌ；为促进转染细胞的液中Ｇ生长，在所用的培养液中均加入２５％经过滤处理的回收培养液。为保持持续稳定的Ｇ４１８活性，每隔４８ｈ更ｅｐＧ２／ｍｄｒ１细胞系，换一次培养液。直至形成稳定的Ｈ取对数生长期细胞用于后续实验。１．２．４ＨｅｐＧ２／ｍｄｒ１细胞形态学观察及生长曲线测定将ＨｅｐＧ２／ｍｄｒ１和ＨｅｐＧ２细胞分别接种于６孔板ｅｐＧ２／ｍｄｒ１细胞的培养液中含有终浓度为中，其中Ｈ６００μ ｍｏｌ／Ｌ的Ｇ４１８，待细胞完全贴壁，开始正常的分裂生长后，在倒置相差显微镜（ＯｌｙｍｐｕｓＩＸ８１）下观察其形态学的变化。取生长状态良好的ＨｅｐＧ２／ｍｄｒ１细胞和ＨｅｐＧ２细胞，接种于９６孔板（Ｃｏｓｔａｒ）中，培养１ｄ后每２４ｈ用ＭＴＴ法测定５７０ｎｍ的吸光度值（Ａ值），连续测７ｄ。以培养Ａ值为纵坐标，绘制其生长曲线。时间为横坐标，１．２．５ＨｅｐＧ２／ｍｄｒ１细胞Ｐｇｐ表达的检测ＨｅｐＧ２／ ? ｍｄｒ１细胞在培养液中Ｇ４１８的终浓度为６００μ ｍｏｌ／Ｌ的０代时，取对数生长期的情况下，连续传代至第２ＨｅｐＧ２／ｍｄｒ１细胞和正常传代的ＨｅｐＧ２细胞，分别常规消化后收集细胞。用ｐＨ７．２的ＰＢＳ洗涤并稀释至１× １０个／ｍｌ单细胞悬液后，分别加入抗Ｐ? ｇｐ抗体ＭＲＫ１６，混匀，室温下孵育１５ｍｉｎ；１０００ｒ／ｍｉｎ离心洗涤１次后，加入ＲＰＥ标记的羊抗鼠ＩｇＧ２ａ单抗，轻轻混匀后室温下避光孵育１５ｍｉｎ。用流式细胞仪（ＦＣＭ，ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒＥｐｉｃｓＸＬ）检测细胞Ｐｇｐ蛋白表达阳 ? ? 性率和平均荧光强度（ＭＩＦ）。１．２．６实时荧光定量ＰＣＲ检测ＨｅｐＧ２／ｍｄｒ１细胞中
mdr1的转染复苏后的hepg2细胞转于含10新生牛血清的低糖dmem饱和湿度条件下培养每周传代2转染前1d取生长状态良好的hepg2细胞常规消化后用无抗生素的完全培养基稀释至浓度为1单细胞悬液在6孔板中每孔加入2ml细胞悬液置于375co的孵箱中培养过夜当孔内贴壁细胞达到9095时进行转染
中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（５）：１７～２２
６１０单细胞悬液，在６孔板中每孔加入明，在肿瘤细胞多药耐药的机理中，其产物Ｐ糖蛋白（Ｐｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，Ｐｇｐ）过度表达是最主 ? ? ? 要的因素之一。研究表明，抑制ｍｄｒ１基因的表达可提高耐药细胞对化疗药物的敏感性
６
ｍｄｒ１ｍＲＮＡ的表达变化分别收集对数生长期的第２０代ＨｅｐＧ２／ｍｄｒ１及对照ＨｅｐＧ２细胞，Ｔｒｉｚｏｌ提取总ＲＮＡ。以 β ａｃｔｉｎ为内参、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ为指示剂，利用 ? ｍｄｒｌ引物的上、下游序列分别为：５ ′ 所设计的引物（ ? ＣＣＣＡＴＣＡＴＴＧＣＡＡＴＡＧＣＡＧＧ? ３ ′ 和５ ′ ＧＴＴＣＡＡ ? ３ ′ ，扩增片段长度为１５７ｂｐ；ＡＣＴＴＣＴＧＣＴＣＣＴＧＡ ? β ? ａｃｔｉｎ引物的上、下游序列分别为：５ ′ ＧＣＴＣＣＴＣＣ ?ＴＴＧＡＧＣＧＣＡＡＧＴＡ３ ′ 和５ ′ ＣＣＡＣＡＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡ ? ? ３ ′ ，扩增片段长度为７９ｂｐ），按照４２ ℃１ｈ；ＧＧＴＧＧＡ ? ９５ ℃１５ｓ，９５ ℃５ｓ，６０ ℃３０ｓ，进行４０个循环后６５ ℃１５ｓ的程序在ＲＯＴＯＲ? ＧＥＮＥ３０００型定量ＰＣＲ仪分别对ｍｄｒｌ和β ａｃｔｉｎ基因的部分片段进行扩增。采用比较域 ?
ＨｅｐＧ２／ｍｄｒ１稳定细胞系的建立及特性研究
张巨程杰陈静易娟孙静魏虎来
（兰州大学基础医学院医学实验中心兰州７３００００）
摘要将已构建好的含有人多药耐药（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ＭＤＲ）全长基因的真核表达质粒ｐＣＩｎｅｏ ? ｍｄｒ１，应用脂质体导入人肝癌ＨｅｐＧ２细胞，应用Ｇ４１８筛选出人肝癌多药耐药细胞株ＨｅｐＧ２／ｍｄｒ１。 ? 通过对ＨｅｐＧ２／ｍｄｒ１细胞形态学的观察和生物学特性的研究，成功地建立了高效、稳定的ＨｅｐＧ２／ｍｄｒ１细胞系；为深入研究肝癌的ＭＤＲ及其逆转提供了理想的细胞模型，并为探索建立肝癌ＭＤＲ细胞株提供新的方法和思路，同时为研究肝癌细胞胰岛素抵抗与ＭＤＲ的关系提供了模型细胞。关键词多药耐药人肝癌ＨｅｐＧ２细胞转染ｐＣＩｎｅｏｍｄｒ１重组质粒 ? ?
－Ｃｔ Δ Δ ２，Ｃｔ值值法分析基因表达的量，目的基因的量＝
为荧光达到荧光域值的循环数，Ｃｔ＝（Ｃｔ Δ Δ 目的基因 ? Ｃｔ（ＣｔＣｔ可直接得到目的管家基因）实验组 ? 目的基因 ? 管家基因）对照，基因相对于管家基因的定量。照此获得ＨｅｐＧ２／ｍｄｒ１细胞中ｍｄｒ１ｍＲＮＡ的表达变化。１．２．７ＦＣＭ检测ＨｅｐＧ２／ｍｄｒ１细胞对阿霉素的蓄积０代ＨｅｐＧ２／与排出分别消化收集对数生长期的第２