真菌镜检的实验室操作课件
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微生物检验常用技术与方法—临床真菌检验技术与方法(微生物检验课件)
临床真菌检验 技术与方法
掌握真菌的检验方法。 熟悉真菌标本采集及注意事项； 熟悉真菌的鉴定程序；真菌药物 敏感试验方法。
第一节 真菌形态检验技术
一、标本的采集和处理
1. 标本的采集—— 根据真菌感染部位采集不同的标本。 浅部真菌感染 取毛发、皮屑、指（趾）甲等标本
深部真菌感染
取痰液、脓汁、血液、脑脊液等标本
培养基用途 真菌的常规培养 真菌的常规培养 观察白假丝酵母菌的厚膜孢子 观察真菌菌落色素，用于鉴别 生化反应鉴别培养（红色癣菌和石膏样癣菌） 深部真菌培养 真菌的培养与鉴定
第二节 真菌培养技术
显色鉴定培养基
代谢基质 产色基团
原
真菌的酶
理
分解代谢基质
真菌特异性酶的 底物（无色）
产色基团游离 （显色）
4. 病理组织检查 用于深部真菌感染的诊断。
5. 核酸检测
用于真菌的分型鉴定。
有ELISA、生物学方法、薄层层析法、高效液相
6. 真菌毒素的检测 色谱法等多种方法。
7. G试验
用于念珠菌、曲霉菌等深部真菌感染的早期诊断。
返回章内容
第四节 真菌检验G试验、GM试验
应用背景
• 侵袭性真菌病临床表现不典型，确 诊通常需要侵入性的组织标本，因 此有较高的漏诊率。目前国内大多 数医院都在开展非侵袭性实验室技 术如G试验和GM试验，成为真菌 感染的诊断标准之一，以提高真菌 感染的阳性率。
同化氮源试验
• 检测真菌对氮源利用能力的试验，主 要用于鉴定酵母菌。
明胶液化试验
• 某些真菌具有明胶酶，可分解明胶蛋 白，使其失去凝胶性质而不能凝固。
尿素分解试验
• 某些真菌具有尿素酶，可分解尿素。
第三节 真菌的鉴定方法
掌握真菌的检验方法。 熟悉真菌标本采集及注意事项； 熟悉真菌的鉴定程序；真菌药物 敏感试验方法。
第一节 真菌形态检验技术
一、标本的采集和处理
1. 标本的采集—— 根据真菌感染部位采集不同的标本。 浅部真菌感染 取毛发、皮屑、指（趾）甲等标本
深部真菌感染
取痰液、脓汁、血液、脑脊液等标本
培养基用途 真菌的常规培养 真菌的常规培养 观察白假丝酵母菌的厚膜孢子 观察真菌菌落色素，用于鉴别 生化反应鉴别培养（红色癣菌和石膏样癣菌） 深部真菌培养 真菌的培养与鉴定
第二节 真菌培养技术
显色鉴定培养基
代谢基质 产色基团
原
真菌的酶
理
分解代谢基质
真菌特异性酶的 底物（无色）
产色基团游离 （显色）
4. 病理组织检查 用于深部真菌感染的诊断。
5. 核酸检测
用于真菌的分型鉴定。
有ELISA、生物学方法、薄层层析法、高效液相
6. 真菌毒素的检测 色谱法等多种方法。
7. G试验
用于念珠菌、曲霉菌等深部真菌感染的早期诊断。
返回章内容
第四节 真菌检验G试验、GM试验
应用背景
• 侵袭性真菌病临床表现不典型，确 诊通常需要侵入性的组织标本，因 此有较高的漏诊率。目前国内大多 数医院都在开展非侵袭性实验室技 术如G试验和GM试验，成为真菌 感染的诊断标准之一，以提高真菌 感染的阳性率。
同化氮源试验
• 检测真菌对氮源利用能力的试验，主 要用于鉴定酵母菌。
明胶液化试验
• 某些真菌具有明胶酶，可分解明胶蛋 白，使其失去凝胶性质而不能凝固。
尿素分解试验
• 某些真菌具有尿素酶，可分解尿素。
第三节 真菌的鉴定方法
真菌实验室技术课件
方块法
小钢圈法
平皿培养
试管培养
方块小培养法
钢圈小培养法
真菌病病理检查法
标本切片的制作 标本组织染色法 真菌在组织中的形态
真菌病血清学检查法
真菌抗原检测
隐球菌乳胶凝集试验（隐球菌荚膜多糖抗原） G试验（β-1,3-葡聚糖试验）
主要检测念珠菌、曲霉侵袭性感染，及一些少见真菌（如镰 刀菌、毛孢子菌等）感染。
菌的检测困难
真菌药敏试验的方法
微量液体稀释法
是多量液体稀释法的改良，将试管改为96孔 微孔板，标本及试剂体积减少至0.2ml，培养时间 也缩短至24小时，并以肉眼或分光光度计判断终 点。
优点：简单易行，省时，损耗少 缺点：终点难以确定，标准化问题， 对丝状真菌的检测困难。
微量液体稀释法
琼脂扩散法
ROSCO纸片法
真菌药敏试验的方法
E试验（E-test）法
为一种琼脂扩散法的改良，采用标准培养基，将
待测菌液涂抹于培养基表面后，臵入含有以梯度浓度 排列的药液条，经孵育后观察药液条周围出现的椭圆
形抑菌区，以达到抑菌的最小药物浓度为MIC终点。
优点：简单易行，判断抑制终点清晰，可以进行 定量测定
合成培养基（如察氏培养基）
常规培养基：沙氏琼脂（SDA）、改良沙氏琼脂（SAB）、
脑心浸膏琼脂（BHIA）、脑心浸膏肉汤（BHIB）、
马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）等
抗生素：常用氯霉素（50μg/ml）、放线菌酮（500 μg/ml）
真菌培养鉴定
培养方法
试管培养 平皿培养（大培养） 小培养 玻片法
缺点：价格昂贵
E-test 法
真菌直接镜检法
真菌直接镜检法
取病变处的皮屑、毛发、甲屑放玻片上，加10%-20%的KOH，覆盖片，放火焰上微加温，直接镜检。
在弱光下先低倍镜，再高倍镜观察，可找到菌丝或孢子。
常见真菌形态分布如下：1．皮屑可见细长的分枝分节菌丝或分隔菌丝及成串的孢子。
2．甲屑标本可见有成串小孢子或由孢子排列成的链状菌丝。
3．毛发内或发外周围可见有小孢子成链状排列，孢子可呈卵圆形或圆形镶嵌状包绕毛干可密集成群。
有的发内可见较粗的菌丝，与毛发长轴一致，发内常有大小不一的气泡。
《真菌检验》PPT课件
❖ 糠秕马拉癣菌主要寄居在人体皮肤和毛干的最表层，可 在健康人皮肤上分离到，为条件致病菌。
❖ 侵入表皮后，在皮肤角质层外2/3处生长、繁殖，引起一 种慢性、无症状或轻微症状的皮肤斑疹，呈灰白色、褐 色或淡黄色，上面附着细小糠皮样鳞屑，有时可融合成 片，似汗渍斑点，俗称汗斑即花斑癣（tinea versicolor） 。皮损最常见于胸、背、臂的上半部皮脂腺丰富部位。 病程缓慢，多年不愈，对健康无碍，但影响美观。油性 皮肤易感，而且与遗传、免疫缺陷等因素有关，诱发因 素为高温多汗。近年大量研究显示，糠秕马拉癣菌还可 引起毛囊炎，可能为脂溢性皮炎的重要发病原因之一。
❖ 4.鉴定 糠秕马拉癣菌的主要特征是：病损皮屑Wood’s灯 照射呈金黄色荧光，嗜脂性生长，酵母型菌落，腊肠样 菌丝，厚壁孢子。根据病发上结节的颜色、硬度、大小 ，即可对何德毛结节菌和白吉尔丝孢酵母菌初步诊断， 直接镜检看到子囊或子囊孢子，可确定为何德毛结节菌 。
，具有无性期和有性期两种形态。大多数从环境和人 体分离到的菌株处于无性期，属于丛梗孢科。按菌落 特征及大分生孢子的形态将皮肤癣菌分为3个属，即
毛癣菌属(Trichophyton )、 ❖ 小孢子菌属(Microsporum ) ❖ 及表皮癣菌属(Epidermophyton)。 ❖ 有性期属于裸囊菌科、节皮菌属(Arthroderma)。皮肤
❖ 组织
2009年3月
上海交通大学医学院
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真菌镜检PPT课件
9
瑞氏染色组织胞浆菌
10
PAS染色甲真菌病黄曲霉甲床病理
11
培养检查
可提高真菌检出率，并能确定菌种。 方法：标本接种于葡萄糖蛋白胨琼脂培养基
（Sabouraud agar/沙氏琼脂）上，置室温或37℃培 养1～3周。 必要时可行小培养协助鉴定。菌种鉴定常根据菌 落的形态及显微镜下形态判断。对某些真菌，有 时尚需配合其他鉴别培养基、生化反应、分子生 物学方法确定。
真菌镜检
.
1
一. 采集标本
浅部真菌的标本有毛发、皮屑、甲屑、痂等，标 本在分离前常先用75%乙醇处理。
深部真菌的标本可根据情况取痰、尿液、粪便、 脓液、口腔或阴道分泌物、血液、脑脊液、各种 穿刺液和活检组织，采集时应注意无菌操作。
2
二. 检查方法
直接涂片 墨汁涂片 染色 培养
12
真菌培养
13
谢谢！
14
3
直接涂片
最简单而重要的诊断方法 方法：取标本置玻片上，加一滴10%KOH溶液，
盖上盖玻片，在酒精灯火焰上稍加热溶解角质后， 轻轻加压盖玻片使标本透明即可镜检。 用于检查有无菌丝或孢子，不能确定菌种。
4
直接检测隐球菌及其它有荚膜的孢子 方法：取一小滴墨汁与标本（如脑脊液）混合，
盖上盖玻片后直接镜检。
6
墨汁涂片
7
涂片或组织切片染色
染色可更好地显示真菌形态和结构 革兰染色适用于白念珠菌、孢子丝菌等 瑞氏染色（美蓝-伊红Y 染料）适用于组织胞浆菌 PAS（Periodic Acid-Schiff stain ）染色（糖原染色 ）
常用于组织切片
8
革兰染色白色念珠菌
瑞氏染色组织胞浆菌
10
PAS染色甲真菌病黄曲霉甲床病理
11
培养检查
可提高真菌检出率，并能确定菌种。 方法：标本接种于葡萄糖蛋白胨琼脂培养基
（Sabouraud agar/沙氏琼脂）上，置室温或37℃培 养1～3周。 必要时可行小培养协助鉴定。菌种鉴定常根据菌 落的形态及显微镜下形态判断。对某些真菌，有 时尚需配合其他鉴别培养基、生化反应、分子生 物学方法确定。
真菌镜检
.
1
一. 采集标本
浅部真菌的标本有毛发、皮屑、甲屑、痂等，标 本在分离前常先用75%乙醇处理。
深部真菌的标本可根据情况取痰、尿液、粪便、 脓液、口腔或阴道分泌物、血液、脑脊液、各种 穿刺液和活检组织，采集时应注意无菌操作。
2
二. 检查方法
直接涂片 墨汁涂片 染色 培养
12
真菌培养
13
谢谢！
14
3
直接涂片
最简单而重要的诊断方法 方法：取标本置玻片上，加一滴10%KOH溶液，
盖上盖玻片，在酒精灯火焰上稍加热溶解角质后， 轻轻加压盖玻片使标本透明即可镜检。 用于检查有无菌丝或孢子，不能确定菌种。
4
直接检测隐球菌及其它有荚膜的孢子 方法：取一小滴墨汁与标本（如脑脊液）混合，
盖上盖玻片后直接镜检。
6
墨汁涂片
7
涂片或组织切片染色
染色可更好地显示真菌形态和结构 革兰染色适用于白念珠菌、孢子丝菌等 瑞氏染色（美蓝-伊红Y 染料）适用于组织胞浆菌 PAS（Periodic Acid-Schiff stain ）染色（糖原染色 ）
常用于组织切片
8
革兰染色白色念珠菌
临床常见真菌检验—浅部感染真菌(微生物检验课件)
第十五章
真菌及检验
真菌形态检验技术
一、标本采集
常见标本类别
◆浅部感染：毛发、皮屑、指甲等 ◆深部感染：脓、痰、血液、脑脊液、宫颈分泌物等
一、标本采集
注意事项 ◆标本来源适宜 ◆用药前采集标本 ◆严格无菌操作 ◆标本量充足 ◆立即送检
一、标本采集 检验程序
二、直接镜检
镜检的意义： ①有诊断意义，如浅部真菌病等； ②通过真菌的形态，可确定某些致病性真菌
一、浅部感染真菌
标本： 病变部位标本。 检验方法：
直接镜检 分离培养 荧光检查
微生物检验
心脑浸液葡萄糖血琼脂
培养基用途
真菌的常规培养 真菌的常规培养 观察白假丝酵母菌的厚膜孢子 观察真菌菌落色素，用于鉴别 生化反应鉴别培养（红色癣菌和 石膏样癣菌） 深部真菌培养
二、培养方法
分离培养
平皿 培养法
分离培养；观察菌落
斜面培 养法
保存菌种
小培养法 观察结构、生长发育过程
二、培养方法 小培养法：
的属或种, 如假丝酵母菌的厚膜孢子等。
镜检的局限性： ①阴性结果不能排除真菌感染； ②有假阳性结果。 因此，对直接镜检可疑结果应作复查或用
其他检验方法鉴定。
菌菌丝或孢子存在时，即 可初步判定为真菌感染。
常用方法：
标本
加热
KOH溶液
菌丝
镜检
孢子
鉴定
1. 生化反应鉴定
糖(醇)类发酵试验 同化碳源试验 同化氮源试验 明胶液化试验 尿素分解试验
2. 免疫学检查
3. 其他鉴定试验
鉴定
芽管形成试验 : 待检菌 → 动物血清 → 37 ℃、2~4h → 镜检观察芽管
厚膜孢子形成试验：待检菌 → 吐温-80玉米粉琼脂 → 37 ℃→ 观察厚膜孢子
真菌及检验
真菌形态检验技术
一、标本采集
常见标本类别
◆浅部感染：毛发、皮屑、指甲等 ◆深部感染：脓、痰、血液、脑脊液、宫颈分泌物等
一、标本采集
注意事项 ◆标本来源适宜 ◆用药前采集标本 ◆严格无菌操作 ◆标本量充足 ◆立即送检
一、标本采集 检验程序
二、直接镜检
镜检的意义： ①有诊断意义，如浅部真菌病等； ②通过真菌的形态，可确定某些致病性真菌
一、浅部感染真菌
标本： 病变部位标本。 检验方法：
直接镜检 分离培养 荧光检查
微生物检验
心脑浸液葡萄糖血琼脂
培养基用途
真菌的常规培养 真菌的常规培养 观察白假丝酵母菌的厚膜孢子 观察真菌菌落色素，用于鉴别 生化反应鉴别培养（红色癣菌和 石膏样癣菌） 深部真菌培养
二、培养方法
分离培养
平皿 培养法
分离培养；观察菌落
斜面培 养法
保存菌种
小培养法 观察结构、生长发育过程
二、培养方法 小培养法：
的属或种, 如假丝酵母菌的厚膜孢子等。
镜检的局限性： ①阴性结果不能排除真菌感染； ②有假阳性结果。 因此，对直接镜检可疑结果应作复查或用
其他检验方法鉴定。
菌菌丝或孢子存在时，即 可初步判定为真菌感染。
常用方法：
标本
加热
KOH溶液
菌丝
镜检
孢子
鉴定
1. 生化反应鉴定
糖(醇)类发酵试验 同化碳源试验 同化氮源试验 明胶液化试验 尿素分解试验
2. 免疫学检查
3. 其他鉴定试验
鉴定
芽管形成试验 : 待检菌 → 动物血清 → 37 ℃、2~4h → 镜检观察芽管
厚膜孢子形成试验：待检菌 → 吐温-80玉米粉琼脂 → 37 ℃→ 观察厚膜孢子
真菌检验【送检】SOP--标本采集及处理课件
2h 内常温送检
4°C保存
24
眼(角膜刮片、玻璃体液等)标本采集及处理
. 角膜刮片或针吸玻璃体液。 . 15 分钟内常温送检。若不能及时送检，则常温保存。角膜刮片直接接种
至不含抑制剂的培养皿中，采用 X 或 C 型涂菌方式，玻璃体液离心后取
沉淀物接种。
15min 内常温送检
不含抑制剂的培养皿 接种培养
不能送检时，常温保存
19
无菌体液 (脑脊液、心包液、腹水和关节液) 标本处理二
. 标本大于 2ml，则 2000g 离心10 分钟，取沉渣接种。 . 若标本量少于 2ml，则将标本直接接种于培养基。
. 推荐使用细胞离心机对无菌体液进行涂片镜检。脑脊液可直接接种于血培养瓶。
离心10min
接种培养
涂片镜检
3
2. 最小抑菌浓度 MIC
按照标准操作规程进行体外真菌稀释法或连续浓度梯度稀释法药物敏感性 试验时，在特定培养时间及温度的条件下，能导致特定程度肉眼可见真菌 生长抑制的最低药物浓度。
4
3. 剂量依赖敏感 S-DD
. 给予高于常规给药剂量，且达到最大血药浓度时，临床有效。
4. 最低有效浓度 MEC
9
血液标本采集
. 推荐在抗真菌药物使用前，发热初期或寒颤期、采静脉血或骨髓液。 . 立即注入血培养瓶内并轻轻摇匀。至少采集 2 套。 . 标本与培养基比例为 1/10-1/5 (成人每瓶 8-10ml)、必须包括需氧瓶或
真菌瓶。
10
血液标本处理
. 2h 内常温送检。若不能及时送检，则常温保存。
2h 内常温送检
6
6. 消化液 lysis solution
. 粘液溶解作用，用于呼吸道标本等的前处理，常用N-乙酰-L-半胱氨酸、 5%草酸或二巯基苏糖醇等。
真菌感染实验室检测PPT课件
株数
119 56 46 20 11 22
%
44 21 16 7 4 8
19
2006~2012年念珠菌分布
60%
2006
50%
2007 2008
2009
40%
2010
2011
30%
2012
20%
10%
0%
白色念珠菌 热带念珠菌 光滑念珠菌 清酒念珠菌 中间念珠菌 近平无滑名念念珠珠菌菌
20
念珠菌药敏试验结果
3 2.2
2
1
0 1978～1982 1983～1987 1988～1992
Grool A, et al. Trends in the postmortern epidemlology of invasive fungal infections at a
university hospital. [J]. J Infect, 1996, 33(1): 23．
8
中国3347例尸检结果IFI发病率
7
6
P<0.01
5
6.06 5.23
4
3
2.77
2
1
1.04
0
1953-1962
1963-1972
1973-1982
1983-1993
北京协和医院对1953-1993年共计3447例尸检进行回顾性调查分析
9
人类最常见的深部真菌病
念珠菌病（监护中心、白血病、烧伤、肿瘤、AIDS、 SARS） 隐球菌病（AIDS、移植、SLE） 曲霉病（白血病、移植、AIDS、SARS ） 接合菌病（白血病、糖尿病、烧伤） 马内菲青霉病（自然疫源）
Pfaller MA，Diekema DJ．Epidemiology of invasive candidiasis：a persistent public health problem E [J]. Clin Mi1cr6obiol Rev, 2007, 20 (1): 133-163.
真菌感染实验室检测讲解PPT共62页
真菌感染实验室检测讲解
36、如果我们国家的法律中只有某种 神灵， 而不是 殚精竭 虑将神 灵揉进 宪法， 总体上 来说， 法律就 会更好 。—— 马克·吐 温 37、纲纪废弃之日，便是暴政兴起之 时。— —威·皮 物特
38、若是没有公众舆论的支持，法律 是丝毫 没有力 量的。 ——菲 力普斯 39、一个判例造出另一个判例，它们 迅速累 聚，进这是不 容忽视 的。— —爱献 生
66、节制使快乐增加并使享受加强。 ——德 谟克利 特 67、今天应做的事没有做，明天再早也 是耽误 了。——裴斯 泰洛齐 68、决定一个人的一生，以及整个命运 的，只 是一瞬 之间。 ——歌 德 69、懒人无法享受休息之乐。——拉布 克 70、浪费时间是一桩大罪过。——卢梭
36、如果我们国家的法律中只有某种 神灵， 而不是 殚精竭 虑将神 灵揉进 宪法， 总体上 来说， 法律就 会更好 。—— 马克·吐 温 37、纲纪废弃之日，便是暴政兴起之 时。— —威·皮 物特
38、若是没有公众舆论的支持，法律 是丝毫 没有力 量的。 ——菲 力普斯 39、一个判例造出另一个判例，它们 迅速累 聚，进这是不 容忽视 的。— —爱献 生
66、节制使快乐增加并使享受加强。 ——德 谟克利 特 67、今天应做的事没有做，明天再早也 是耽误 了。——裴斯 泰洛齐 68、决定一个人的一生，以及整个命运 的，只 是一瞬 之间。 ——歌 德 69、懒人无法享受休息之乐。——拉布 克 70、浪费时间是一桩大罪过。——卢梭
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1、疥疮
手缝、手掌、手腕屈侧（对应脚部）
2、水泡丘疹性皮损
皮损内侧（水疱型）、分泌物（毛囊炎）
3、毛囊虫
面部（鼻翼）背部（脊柱旁）
标本处理
10％-15％KOHθ溶解角质细胞 加盖玻片，压薄涂片
压片厚 角质未溶
如果有必要可酒精灯上微热促溶
THANK YOU
SUCCESS
2019/9/5
真菌镜检的实验室操作
----标本采集的质量控制及注意事项
河北医科大学第二医院皮肤科 郭兵申
2015年12月16日
真菌镜检的实验流程
采集标本 标本处理 真菌镜检 审核报告
标本的采集原则ຫໍສະໝຸດ 躯干一 般皮
四肢
损 的
选
头皮及毛发
取
创伤性采集
大小 新旧 位置
小 新 相对内侧
柔软细腻 避免摩擦
标本的采集方法
第一步：消毒
要点：
1、醋酸白试验并非HPV感染的特异性试验，有假阳、阴性。
（非特异性龟头包皮炎、上皮增厚、外伤擦伤、尿道口炎）
2、醋酸白试验的特异性及敏感性尚未确定
醋酸白试验
结果判读 阳性结果：
涂抹处白色均匀 白色部位界限清楚 临近正常皮肤对比
阴性结果：
排除患者中途部位变化 不能排除HPV感染
北大真菌室开展项目
真菌培养 真菌鉴定
梅毒TPHA 梅毒RPR
真菌药敏 真菌-D-葡聚糖检测（G试验）
支、衣原体、淋球菌检测 醋酸白试验
真菌半乳甘露聚糖检测（GM试验）HPV分子学诊断
THANK YOU
SUCCESS
2019/9/5
THANK YOU
SUCCESS
2019/9/5
真菌镜检
THANK YOU
SUCCESS
2019/9/5
审核报告
真菌镜检的报告为临床定性实验 镜下只有糠秕孢子无菌丝的标本应慎重 痰类标本应判断“痰标本是否合格” 口腔标本应排除长杆菌及放线菌的干扰
醋酸白试验
方法：
用5％冰醋酸水溶液涂抹待检部位，3-5分钟观察，尖锐湿 疣病变处可观察到均匀的白色，以此作为一种筛查试验来鉴别 不典型病变及亚临床的皮疹。
采集刀 采集部位 特殊部位
二次消毒（采集前、后）
1、防止采集部位感染 2、预防交叉感染 3、确保真菌培养环境
生理盐水（黏膜部位、创伤较大处）
第二步：采集
皮损界限清楚 皮损界限模糊 （腹股沟、手掌、脚掌、指/趾甲）
头皮及毛发
1、断发 2、结痂 3、鳞屑 4、脓液
发内、外孢子、菌丝、糠秕孢子
创伤性采集