狗牙根（CynodonL.）组培再生体系的建立

狗牙根(Cynodon L.)组培再生体系的建立
生命科学学院生物技术专业 刘奕雯
学号2002041077
【摘要】以MS培养基为基本培养基，添加四种不同激素配比的生长素（2，4-D）和细胞分裂素（6-BA），对老鹰草(Tifeagle)茎节段进行愈伤组织的诱导，以选择出最佳的脱分化激素配比，结果表明在MS+2,4-D2mg/L，6-BA0.02mg/L培养基上，茎节的脱分化率最高。

在最佳激素配比（2,4-D2mg/L，6-BA0.02mg/L）条件下，以不同的基本培养基对Tifeagle茎节段进行愈伤组织的诱导，结果显示，改良的培养基 NMBG（N6大量元素，MS铁盐，B5微量元素，Gamborg维生素，谷氨酰胺0.5mg/L,脯氨酸0.5mg/L,水解酪蛋白0.5mg/L,肌醇0.1mg/L，）相对于MS培养基能诱导出更多的愈伤组织。

进一步将愈伤组织置于含有5种不同浓度的6-BA的培养基上进行芽的分化诱导，结果表明0.02mg/L的6-BA浓度较有利于芽的分化，当6-AB浓度大于0.1mg/L时出现褐变。

【关键词】狗牙根；Tifeagle；茎节；愈伤组织诱导；芽的分化
【教师点评】目前高尔夫球场草坪的建设普遍都会因其大量的耗水、施用农药与肥料等而与人类竞争使用水资源、给生态环境带来威胁。

通过分子育种方法，经转基因获得抗旱、耐盐、耐病虫的草坪草是解决这一问题的重要途径之一。

然而，进行植物转基因，首先得要建立一个转基因的技术平台即组织培养技术平台。

该研究通过对高尔夫球场果岭常用草狗牙根老鹰草的茎节进行脱分化和再分化诱导，筛选出了利于其茎节愈伤组织诱导的最佳激素配比和适宜的基本培养基，使愈伤组织的形成率突破了90％，这在国内外的报道中均属罕见。

研究还对愈伤组织的再分化进行了初步探索。

为建立完整的组培再生体系及之后的分子育种奠定了基础。

该研究是深圳市科技计划项目“草坪草狗牙根离体再生系统的建立和耐旱转基因新品种的培育”的一部分，是目前草坪草研究方面的前沿性工作。

该学生在实习过程中踏实肯干，能广泛收集资料，善于思考；所得数据资料详实；论文层次清楚，逻辑严密，结构完整。

是篇优秀的毕业论文。

点评教师： 唐玉林 博士 副教授 The Callus Induction and Plant
Regeneration of Cynodon L.
【Abstract】To find the suitable hormone condition for nodal dedifferentiation of bermudagrass, the embryogenic calli from nodal segments of hybrid bermudagrass cultivar ‘Tifeagle’ were cultivated in MS medium with 4 different ratio of 2, 4-D and 6-BA . Data shows that 2mg/L of 2, 4-D and 0.02mg/L of 6-BA are the best hormone condition for callus induction. The nodal segments were placed in 2 types of basic medium on the same hormone condition for induction of callus. Compared to the MS substrate, the NMBG is better for callus induction. The callus, which came from previous process, were transferred to the regeneration medium with 5 different concentrations of 6-BA. Result shows that 0.02mg/L of 6-BA is better for the bud formation, while high levels of 6-BA (>0.1mg/L) make the callus brown.
【Key words】 Bermudagrass； Tifeagle； Nodal； Callus induction； Regeneration of bud
1. 引言
狗牙根属(Cynodon L.)植物属于禾本科(Gramineae)虎尾草亚科(Chloridoideae)，是暖季型草坪草[6]，被广泛用于高尔夫球场果岭、发球台、球道、运动场、园林绿化和固土护坡。

因其良好的耐践踏性及恢复能力，常可提供一个良好的击球表面。

我国地形复杂，气候多变，草种在引进时存在原种地与引进地气候的差异，许多引进品种都在引进后表现出不适应。

因此，获得适应性强的品种成为人们追求的目标。

长期以来，草坪草的品种选育主要是通过传统杂交育种和引种驯化技术进行的[7]，但这些传统方法耗时长，费用高，而且可利用的遗传资源十分有限。

通过转基因进行分子育种则能大大缩短育种时间，可以打破种属中的生殖隔阂。

但要进行植物转基因，首先得要建立一个转基因的技术平台即组织培养技术平台。

而狗牙根的组织培养技术仍不成熟，这限制了转基因技术在改造其新品种中的应用。

组织培养的大量实验已证明，已分化有结构的成熟组织，如根、茎、叶、花、果及其他组织，在离体条件下都可以脱分化为无组织形态、无细胞极性的愈伤组织。

国内已有成功从狗牙根诱导出愈伤组织，并再生为完整植株的例子。

卢少云[1]等以狗牙根的茎节为材料诱导出了愈伤组织并再生出完整植株；谢海燕等[2]以狗牙根颖果为外植体成功诱导出愈伤组织及完成其再生；胡张华等[5]在百慕大成熟胚的组织培养及植株再生方面进行了系统的研究；Ahn[9,10]建立了狗牙根花絮的愈伤组织培养体系；Chaudhury[11]报道了BA、花絮长度对狗牙根愈伤组织诱导的影响。

目前，商业生产中大量应用不育的杂交狗牙根[4],造成基因单一,变异小,对逆境抗性小,容易受新出现的病原微生物的袭击。

由此，建立狗牙根植株再生系统，利用转基因技术将目的基因有效地导入，可获得转基因的目的植株。

如将抗旱耐盐基因转入狗牙根可获得高抗旱或耐盐的狗牙根新品种，从而可减少用于灌溉的水量，或改用含盐分较高的非饮用水灌溉，这将很好的解决因大量频繁灌溉造成水资源浪费的问题。

而将抗病虫基因转入狗牙根，则可减少由于病虫害而大量使用农药对生态环境造成的破坏，同时这类品种的改良亦将创造巨大的经济效益。

本实验将通过采用不同的培养基对狗牙根茎节段进行脱分化和再分化的诱导，找出最佳的方案，为进行狗牙根的转基因，改造新品种提供一技术平台。

为找出更佳的实验方案，从而提高脱分化率及植株的再生频率，本实验设立了4种激素配比的脱分化培养基，以次找出最佳配方，并在此最佳配比下比较不同基本培养基对愈伤组织的诱导，然后将由此产生的愈伤组织转入设定的含有5种不同6-BA浓度的培养基中，观
察其对植株再生频率的影响。

2. 材料与方法
2.1实验材料
本实验所用老鹰草Tifeagle( Cynodon dactylon × C. transvaalensis )由高尔夫学院李教授提供，为美国进口的Tif系列的狗牙根，具有耐剪性，一般的果岭草只能剪至3.5毫米左右，而这种老鹰草却能剪到2.6毫米，而且草叶生长密集，没有什么空隙，外观形态上，其节间距离比以往品种较短，叶片长度较短，叶面较宽。

截取生长健壮的Tifeagle植株的茎段约6-7cm（包含2-3个茎节），去叶后消毒，用作愈
伤组织诱导的外植体。

2.2实验方法
2.2.1 外植体的准备
将截取的茎段剥去叶片，用水冲洗2遍后再用蒸馏水冲洗2遍，75%乙醇浸泡1min, 蒸
馏水洗两遍，0.1%升汞浸泡3min，蒸馏水洗5遍，在离茎尖（节）1~2mm 处截下，用于接种。

2.2.2 MS 培养基的配置
按表1配置MS 培养基，加入0.7％琼脂，3％蔗糖，调pH5.8-6.2。

表1. MS 培养基配置表 母液种类
成分 规定用量（mg ∕L） 扩大倍数 称取量（mg）母液定容 体积（ml） 配1L MS 培养基吸取量/ml NH 4NO 3 1650 33000 KNO 3
1900 38000 KH 2PO 4
170 3400 CaCl 2·2H 2O
440 8800 大量元素
MgSO 4·7H 2O 370
20 7400 1000 50 FeSO 4·7H 2O 27.8
5560 铁盐 Na 2-EDTA 37.3
200 7460 1000 5 盐酸硫胺素（Vit
﹒B 1）
0.1 20 盐酸吡多素（Vit
﹒B 6）
0.5 100 烟 酸
0.5 100 肌醇
100 20000 有机元素 甘氨酸
2.0 200 400 1000 5 Na 2MoO 4·2H 2O
0.25 50 CuSO 4·5H 2O
0.025 5 CoCl 2·6H 2O
0.025 5 MnSO 4·4H 2O
22.3 4460 ZnSO 4·7H 2O
8.6 1720 H 3BO 3
6.2 1240 微量元素 KI 0.83 200 166 1000 5
2.2.3 NBMG 培养基的配置
按表2配置NMBG [1]
（N6大量元素，MS 铁盐，B5微量元素，Gamborg 维生素，谷氨酰胺
0.5mg/L,脯氨酸0.5mg/L,水解酪蛋白0.5mg/L,肌醇0.1mg/L，后称“NMBG”，如表1-2)培养
基，培养基中同样加入0.7％琼脂，3％蔗糖，调pH5.8-6.2。

表2. 改良培养基配置表 母液种类 成份 规定用量 mg/L
扩大倍数 称取量 mg 母液定容体积/ml 配500ml 培养基吸
取量/ml
硝酸钾KNO 3 2830 28300 硫酸铵(NH4)2SO4 463 4630 磷酸二氢钾 KH2PO4 400 4000 硫酸镁MgSO4·7H2O
185 1850
大量元素 N6 氯化钙CaCl2·2H2O 166 20 1660
500
25 Na2_EDTA 37.3 3730 铁盐
MS
FeSO4·7H2O 27.8 200 2780 500 2.5 硫酸锰(MnSO4·7H2O) 10 5000 硫酸锌(ZnSO4·7H2O) 2 1000 硼酸(H3BO3) 3 1500 钼酸钠(NaMoO4·2H2O)
0.25 125 硫酸铜(CuSO4·5H2O)
0.025 12.5
氯化
钴(CoCl 2·6H2O) 0.025 12.5
微量元素
B5 碘化钾(KI) 0.75
1000
375 500
0.5 谷氨酰胺 0.5 125 脯氨酸 0.5 125
水解乳蛋白 0.5
125 其他 肌醇 0.1 1000 25
250 0.5 盐酸硫胺素(VB1) 10 2500 烟酸 1.0
250 Gamborg
维生素 盐酸吡多醇(VB6) 1.0 1000 250
250 0.5 2.2.4 脱分化培养基的配置
以MS 为基本培养基配置A （2,4-D 2mg/L ), B (2,4-D 2mg/L ,6-BA 0.02mg/L ),
C(2,4-D 2mg/L ,6-BA 0.1mg/L ), D(2,4-D 2mg/L ,6-BA 1mg/L ) 四种脱分化培养基。

分别以MS和NMBG为基本培养基配置含2，4-D2mg/L,6-BA0.02mg/L的脱分化培养基。

2.2.5 分化培养基的配置
分别以MS和NMBG为基本培养基配置含6-BA浓度为 0mg/L, 0.02mg/L, 0.1mg/L, 0.5mg/L, 1.0mg/L 的10种不同的脱分化培养基。

2.2.6 培养条件
脱分化培养条件为24°C，暗培养。

分化培养条件为10h光照交替[5],光照强度为40%，温度24°C。

3.结果分析
3.1 不同激素配比对愈伤组织的诱导
取生长健壮的Tifeagle植株的茎节段约6-7cm（带2-3个茎节），剥去叶片并灭菌后，于离茎节处约1mm处截下，分别置于4种含有不同浓度的2,4-D, 6-BA的MS培养基上进行脱分化诱导培养。

每种培养基上接种64个茎节，培养条件为24°C，暗培养。

在培养4天后茎节处开始出现膨大，随后膨大逐渐明显，形成愈伤组织。

愈伤组织部分呈米黄色或乳白色，表面粗糙(图1) 。

A: MS+2，4-D2mg/L B: MS+2，4-D2mg/L+6-BA0.02mg/L
C: MS+2，4-D2mg/L+6-BA0.1mg/L D:MS+2，4-D2mg/L+6-BA1mg/L
图1.以MS培养基为基本培养基时，不同激素配比对愈伤组织诱导的影响
在未经过继代的情况下，20d后对愈伤组织的诱导情况进行统计，由表3可见，各培养
基在产生愈伤组织的数量上存在差异，在2，4-D含量不变的基础上，低浓度的6-BA含量
有利于节段的脱分化。

结果显示，当6-BA : 2,4-D为1:100时，即B（MS+ 6-BA0.02mg/L+
2,4-D2mg/L) 的脱分化率为最高，高达89.3%。

图2更清楚直观地展示了四种不同激素配比的培养基上的节段脱分化情况。

表3.四种激素配比对Tifeagle愈伤组织的诱导
D
C
B
A
接种培养皿数8 7 8 7
总共接种茎节数64 56 64 56
愈伤组织产生数44 49 40 25
脱分化率68.8% 89.3% 62.5% 44.6%
6-BA : 2,4-D 0 1:100 1:20 1:2
图2. 四种激素配比对Tifeagle 愈伤组织的诱导
图中 A： MS+2，4-D 2mg/L ， B： MS+2，4-D 2mg/L +6-BA 0.02mg/L ，
C: MS+2，4-D 2mg/L +6-BA 0.1mg/L D: MS+2，4-D 2mg/L +6-BA
1mg/L 3.2 在相同激素配比下不同基本培养基对愈伤组织的诱导
为了进一步对脱分化培养基进行优化，在筛选获得最合适的愈伤组织诱导的激素配比（2,4-D 2mg/L, 6-BA 0.02mg/L ）后，利用培养基NMBG 添加相同的激素配比，对Tifeagle 的茎节段进行了脱分化诱导。

4天后茎节开始膨大，膨大逐渐明显，后生成愈伤组织（图3）。

图3. 不同基本培养基在6-BA:2,4-D为1:100时的脱分化结果。

上图为反面，下图为正面。

同样在未经继代的情况下，20天后对其脱分化率进行统计。

表4所示NMBG + 6-BA0.02mg/L+2,4-D2mg/L的脱分化率为95.8%，较MS+6-BA0.02mg/L+2,4-D2mg/L的脱分化率87.5%高出7个百分点。

从诱导愈伤组织的数量上看，以NMBG为基本培养基相对较好。

但愈伤组织诱导的最终结果是产生胚性愈伤组织，本实验并没有对其内部细胞结构进行观察，这在以后的实验中将进行进一步鉴定。

表4. Tifeagle在不同基本培养基下的愈伤组织的诱导
基本培养基接种茎结数愈伤组织产生数脱分化率
MS 72 63 87.5% NMBG 72 69 95.8%
3.3 6-BA对分化的影响
选取生长较结实的愈伤组织，去掉原茎段部分，置于含有不同6-BA浓度的分化培养基上培养。

分化培养条件为10h光照交替[5],光照强度为40%，温度24°C。

7天后，6-BA浓度为0.1mg/L, 0.5mg/L, 1mg/L培养基上的愈伤组织出现褐变，第12天，6-BA浓度为0mg/L 的培养基上有少数愈伤组织长出细根，0.02mg/L培养基上的愈伤组织出现绿色小点并长出细根，0.1mg/L、0.5mg/L及1mg/L的褐变情况较为严重（如图4）。

在含0.02mg/L 6-BA培养基上产生绿色小点的愈伤组织并没有继续分化为芽，19天后，绿点消失或部分分化为根组织。

MS+6-BA0mg/L MS+6-BA0.02mg/L
MS+6-BA0.1mg/L MS+6-BA0.5mg/L
MS+6-BA1mg/L
图4. 5种6-BA浓度对芽分化的影响
4. 讨论
大部分草坪草在较高浓度的生长素及较低浓度的细胞分裂素的固体培养基上可以诱导出愈伤组织，其基本培养基也对脱分化率有一定的影响，对于狗牙根来说，本实验的结果显示在NMBG+2，4-D2mg/L+6-BA0.02mg/L的情况下的脱分化率较高。

本实验没有成功完成植株的再生，这与是否诱导出了胚性愈伤组织，及诱导出愈伤组织后的培养条件密切相关。

首先，能否诱导出胚性愈伤组织与外植体的年龄、生理状态、培养基的组成、激素的种类和浓度、培养条件等有关；其次，胚性愈伤组织在不适宜的激素配比浓度的培养基中有可能失去其胚性[8]，因此，在继代培养时须将胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织分别转入到不同的培养基中。

从形态学上看，胚性愈伤组织的结构紧密，细胞较小，内容物丰富，而非胚性愈伤组织结构疏松，细胞巨大，内含一大液泡，几无细胞器[2]。

已有从茎节诱导出愈伤组织并完成植株再生的例子[1]，其分化培养基6-BA浓度高达2.5mg/L, 但我们的实验结果显示6-BA大于0.1mg/L时出现褐变，分析其原因，估计一是由于培养基内细胞分裂素物质有增进酚氧化酶活性的作用，在培养基产生并积累了酚、醌类深褐色的细胞代谢物质，这些物质产生毒害作用，抑制愈伤组织的生长；另一种原因可能是实验采用是琼脂固体培养基，愈伤组织只能吸收其周围的营养物质和激素，从而导致愈伤组织缺乏营养而变褐，此时应进行继代以解决褐化问题。

然而文献中的继代的次数及愈伤组织改造的具体操作不祥，无法作进一步的比较。

亦有研究报道指出，胚性愈伤组织在连续继代2次后发生褐变、胚性消失[8]。

这与本实验在分化时出现的现象相似，6-BA浓度较低的培养基上的愈伤组织有绿点出现，但是后来并没有继续分化为芽，而是部分消失，部分转化为根组织。

综合文献资料与实验结果，往后的实验可以在继代次数及添加其他激素辅助方面稍作尝试。

有关文献指出，在水稻细胞培养中加入外源IAA可促进水稻愈伤组织胚性细胞的形成[14]，使用低浓度的外源IAA来诱导胚性愈伤组织的形成。

水稻悬浮细胞培养中胚性细胞出现是由于2，4-D促进了细胞内源IAA含量从而诱导胚性细胞的形成，并认为内源IAA含量的上升或维持在较高水平是胚性细胞出现的一个共同标志。

另外，在草坪草的愈伤组织诱导中，添加ABA或提高内源ABA含量有助于胚胎晚期的蛋白质合成和淀粉的积累以及体胚的成熟。

提高培养基中ABA含量，有利于增加培养基的渗透势，使体细胞处于逐渐脱水状态，对于疏松无定型、呈果冻状或棉絮状的愈伤组织，添加ABA是很必要的，从而使愈伤组织转变为结构致密的胚性愈伤组织，一般结构致密的胚性愈伤组织具有较强的再生绿色植株的能力。

胡张华等[5]研究亦指出，在蔗糖浓度为60mg/L，琼脂浓度为12g/L, 2,4-D 0.5mg/L, 6-BA 0.5mg/L，KT 0.5mg/L, ABA 2mg/L, CH 400mg/L的继代改造培养基上，百慕大胚性愈伤组织的发生率为60.8%，分化培养基为6-BA 2.0mg/L，KT 0.1mg/L, NAA 0.5mg/L 时分化率达42.8%。

然而添加其他激素的同时，必须考虑激素之间的相互作用关系，这在短时间内难以实现，必须通过大量的实验设计不同的方案比较，并获得一定数量上的统计结果。

如果提供一个环境以使愈伤组织有一个适应激素水平变化的过程，即尝试在继代培养基中降低2，4-D的浓度并同时升高6-BA的浓度，然后再转入只含有6-BA的培养基上，或许也可以解决问题，但这些都只能留待往后的实验进一步研究。

另外，在愈伤组织的诱导过程中曾经对其进行继代，但是发现继代后的愈伤组织活力下降，表现为松弛和水化，并很快出现褐变，因而此后的几次实验中并没有对其进行继代，而是直接转入分化培养基。

关于外植体的影响因素有许多，对于Tifeagle来说，由于其为三倍体，难以利用颖果作为外植体用于愈伤组织培养，茎节相对而言是比较容易获得的实验材料。

本实验在起步阶段曾对茎尖及茎节的愈伤组织产生情况作了粗略的观察，在第4天时Tif419的茎节已经出现
膨大，8天后茎尖却仍未见有变化。

茎尖产生愈伤组织的能力在理论上应该是最高的。

而茎尖却比茎节容易受损，实验过程中，分离茎尖的同时很可能对其造成伤害，且由于需要处理的材料的数量较多，被分离出来的茎尖容易失去水分，再者，在消毒过程中，茎尖受酒精和升汞的破坏也可能导致茎尖组织的损坏，从而致使诱导的结果不理想。

茎尖部分随后置于培养箱内2月之久，没有进行继代，但其意外地长出了愈伤组织，且不断的增大，这些愈伤组织外观上呈米黄色，表面粗糙，在没有继代的情况下也没有出现褐变等情况。

但其产生的个数极少，而且似乎与激素配比没有明显的关系。

在第一批对Tifeagle以不同激素配比对愈伤组织进行诱导的同时，亦对其茎节位置（如第1、第2节）产生愈伤组织的效果进行了粗略的比较，总体看来，第一节或第二节产生愈伤组织的情况较为理想，在此简短提出仅供往后实验参考。

实验的结果显示茎节作为外植体诱导愈伤组织，在适宜的培养基上，其脱分化率也可达到90%以上，但就产生胚性愈伤组织而言，茎节也许不是最佳的选择。

有关研究指出，单倍体狗牙根未成熟花絮亦可用作外植体[15]，而且更容易产生胚性愈伤组织，但是容易出现褐变，须在诱导愈伤组织前对其进行预处理。

总的来说，本实验通过研究激素配比和基本培养基对脱分化的影响，最后选出的培养基配方对茎节的脱分化率高达90%以上，在数量上而言，这是一个比较理想的结果。

5．结论
1. 不同激素配比对愈伤组织诱导的结果
从实验结果可以看出，在以MS为基本培养基时，四种激素配比均能诱导出愈伤组织，但MS+2，4-D2mg/L+6-BA0.02mg/L的脱分化率明显高于其他，达到90%左右。

2. 不同基本培养基对愈伤组织诱导的结果
在相同激素配比条件下，NBMG+2，4-D2mg/L+6-BA0.02mg/L的脱分化率(87.5%)略高于MS+2，4-D2mg/L+6-BA0.02mg/L(5.8%)，但差距并不明显。

3. 5种6-BA浓度对芽分化的影响
6-BA浓度大于0.1mg/L时，愈伤组织出现褐化，浓度为0.02mg/L时，愈伤组织在初期出现绿点，但并没有最终分化为芽，而是部分消失，部分转化为根组织。

6．展望
Tif系列的狗牙根为4倍体狗牙根和2倍体狗牙根杂交后获得的三倍体后代，由于其花粉不育，难以用常规方法进行育种和改良，由此，建立起组织培养再生体系对其在以转基因手段改造品种上有着重大意义。

本实验已从愈伤组织诱导初步统计得到数量上占优势的培养基配方，但其是否为胚性愈伤组织及其如何生成完整植株仍有待日后的实验进行进一步研究。

同时，国内关于转基因技术在改造狗牙根新品种中的应用尚未见报道。

完成其再生体系的建立，把目的基因成功导入并获得改良品种，将成为其日后的研究方向。

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