小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数实验报告-山东大学

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⼩⿏脾脏细胞原代培养及观察计数实验报告-⼭东⼤学
⼩⿏脾脏细胞原代培养及观察计数
【实验⽬的】
1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体⽅法,并对⼩⿏脾细胞进⾏原代培养;
2.掌握⽆菌操作的具体过程及⽆菌操作台的使⽤;
3.学习掌握染⾊法鉴别细胞的⽣死状态的原理及⽅法;
4.学习使⽤⾎球计数板对细胞总数及活细胞数进⾏计数;
【实验原理】
1.细胞培养
细胞培养指的是在⽆菌条件下,把动、植物细胞从组织中取出,在体外模拟体的⽣理环境,使离体的细胞在体外⽣长和繁殖,并且维持其结构和功能的⼀种培养技术。

动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。

从供体获得组织细胞,在⽆菌条件下,⽤胰蛋⽩酶消化或机械分散等⽅法,将动物组织分散成单个细胞开始⾸次培养长出单层细胞的⽅法称为细胞的原代培养。

当培养的动物细胞⽣长增殖达到⼀定密度,形成致密的单层细胞时,⽤胰蛋⽩酶将细胞消化分散成单细胞,从⼀个容器中以1:2或其他⽐例转移到另⼀个容器中扩⼤培养的⽅法,称为细胞的传代培养。

传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。

⾼等⽣物是由多细胞构成的整体,在整体条件下要研究单个细胞或某⼀群细胞在体的功能活动是⼗分困难的。

但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进⾏观察和研究,则要⽅便和简单得多。

被培养的动物细胞是⾮常好的实验对象和实验研究材料,对体外培养的活细胞进⾏研究可以帮助⼈类揭开⽣、⽼、病、死的规律,探索优⽣、抗衰⽼和防治各种疾病的途径和机制,也可以⼈为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性,使其向有利于⼈类健康长寿的⽅向发展。

因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分⼦机制⾮常重要的实验⼿段,被⼴泛应⽤于医学、⽣物技术、基因⼯程等研究领域。

细胞培养的意义:具有其他⽣物技术⽆可⽐拟的优点;培养条件易改变和控制,便于单因⼦分析;便于⼈们直接对细胞结构、细胞⽣长及发育等过程的观察;在⽣物学的各个领域(如分⼦⽣物学、细胞⽣物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等)已被⼴泛应⽤。

细胞培养的局限性:在脱离机体复杂环境下,细胞培养条件与躯体环境有⼀定距离;观察到的结果有时难以正确反映机体的状况;细胞培养得到的产物少。

培养细胞的条件有⽔的质量、⽆菌环境,最适温度、渗透压、⽓体条件、最适PH、营养条件和培养基质等。

2.细胞死活鉴定
细胞⽣死状态的鉴别⽅法主要是化学染⾊法和荧光染⾊法。

活细胞和死亡细胞在⽣理技能和性质上主要存在⼀下差异:
①细胞膜通透性的差异:活细胞的细胞膜是⼀种选择性膜,对细胞起保护和屏障作⽤,只允许物质选择性地通过;⽽细胞死后,细胞膜受损,其通透性增加。

基于此,发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺⿊、⾚藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化⼄啶等为染料鉴别细胞⽣死状态的⽅法,上述染料能使死亡细胞着⾊,⽽活细胞不被着⾊。

此外,应⽤植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的⽣死状态。

活细胞的原⽣质具有选择透过性,死细胞因其原⽣质的选择透过性已遭破坏,故与⾼渗透压溶液接触时不产⽣质壁分离。

②代上的差异:活细胞中新代作⽤强,细胞的酶具有较强的活性和还原能⼒。

基于此,发展处了以荧光素⼆⼄酸酯(FDA)、荧光素⼆丙酸酯、荧光素⼆丁酸酯或荧光素⼆苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞⽣死状态的⽅法,上述酯化的荧光素亲脂性提⾼,容易被细胞吸收进⼊,活细胞的酯酶具有较强的活性,可将酯化的荧光素分解⽽释放出能发荧光的荧光素,该物质不能⾃由透过活的细胞膜,积累在细胞,荧光显微镜下显⽰有明亮的绿⾊或黄绿⾊荧光;⽽死亡细胞的酯酶因失去活性,不能分解酯化的荧光素,荧光显微镜下显⽰不发光。

另外,可⽤亚甲基蓝为染料鉴定酵母细胞的⽣死状态。

亚甲基蓝是⼀⽆毒染料,氧化型为蓝⾊,还原型为⽆⾊。

活细胞因具有较强的还原能⼒,能使亚甲蓝从蓝⾊的氧化型变成⽆⾊的还原型,故活的酵母细胞在⽤亚甲基蓝染⾊后显⽰⽆⾊;死亡酵母细胞或代缓慢的衰⽼酵母细胞,因⽆还原能⼒或还原能⼒极弱,使亚甲蓝仍处于氧化态,故呈现蓝⾊或淡蓝⾊。

3.⾎球计数板的使⽤
⾎球计数板是⼀块特制的厚载玻⽚,载玻⽚上有4条槽⽽构成3个平台。

中间的平台较宽,其中间⼜被⼀短横槽分隔成两半,每个半边上⾯各有⼀个⽅格⽹(如图3)。

每个⽅格⽹共分9⼤格,其中间的⼀⼤格(⼜称为计数室)常被⽤作微⽣物的计数。

计数
室的刻度有两种:⼀种是⼤⽅格分为16个中⽅格,⽽每个中⽅格⼜分成25个⼩⽅格;另⼀种是⼀个⼤⽅格分成25个中⽅格,⽽每个中⽅格⼜分成16个⼩⽅格。

但是不管计数室是哪⼀种构造,它们都有⼀个共同特点,即每个⼤⽅格都由400个⼩⽅格组成(图4)。

每个⼤⽅格边长为1mm,则每⼀⼤⽅格的⾯积为1mm2,每个⼩⽅格的⾯积为1/400mm2,盖上盖玻⽚后,盖玻⽚与计数室底部之间的⾼度为0.1mm,所以每个计数室(⼤⽅格)的体积为0.1mm3,每个⼩⽅格的体积为l/4000mm3。

使⽤⾎球计数板直接计数时,先要测定每个⼩⽅格(或中⽅格)中微⽣物的数量,再换算成每毫升菌液(或每克样品)中微⽣物细胞的数量。

图1 ⾎球计数板的构造(a、平⾯图;b、侧⾯图)
【实验⽤品】
1.材料
⼩⿏脾脏;
2.试剂
PBS缓冲溶液、培养液、台盼蓝、伊红;
3.器材
解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培养⽫、纱布块、吸管、橡⽪头、烧杯、移液枪、注射器、针头、Eppendorf管(上述器具彻底清洗、消毒、烤⼲、包装好);
倒置相差显微镜、酒精灯、酒精棉球、试管架、解剖板等。

【操作步骤】
A.原代脾细胞培养
1、取材:
取⼩⽩⿏⼀只,采⽤断头法处死,清⽔洗净⼩⽩⿏并浸于75%酒精中灭菌3min,取出转⼊超净⼯
图2 ⾎球计数板⽹格的分区和分格
作台的解剖盘,⽆菌操作打开腹腔,取出脾脏,去除周围的脂肪组织,镊起脾脏⽤PBS 液⾃上⽽下冲洗1-2次,转⼊⽆菌玻璃培养⽫中,待⽤。

2、分离脾细胞:
⽤滴管先向上述⽆菌玻璃培养⽫中滴⼊PBS 液30滴,再⽤L 形针头注射器在⽫吸取PBS 液0.2ml ,然后将其沿脾脏长轴⽅向注射⼊脾,⽤针尖在脾脏上扎眼,并⽤L 形针头轻刮脾脏表⾯挤出脾细胞,⽤滴管吸⽫中的PBS 液冲洗脾脏并吹散挂出的脾细胞,稍微倾斜并静置1-2min ,吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部分放⼊Eppendorf 管,以3000转/分离⼼1-2min 。

3、培养脾细胞:
从超净⼯作台中区塑料培养⽫⼀个,⽤“枪(1ml )”加⼊细胞培养液2ml ,并在⽫上做记号,待
⽤。

取上述离⼼后的Eppendorf 管,在超净⼯作台打开弃去上清液,⽤“枪(200µl )”吸取塑料⽫中的培养液400ul ,加⼊弃去上清液的Eppendorf 管中,⽤枪头吹匀管底的脾细胞,然后吸取200ul 脾细胞悬液接种于上述塑料培养⽫中,混匀,然后放⼊37℃⼆氧化碳培养箱中培养。

B. 细胞死活鉴定
台盼蓝法:
1、试剂配制:
⽤⽣理盐⽔配置0.4%台盼蓝染液,备⽤。

2、细胞悬液制备:
将⽣长有贴壁型细胞的培养瓶(⽫)中的培养液倒⼊⼲净试管中,向培养瓶(⽫)中加⼊0.25%
胰蛋⽩酶/0.02%EDTA 混合消化液1-2ml ,静置3-5min ,待见到细胞变圆,彼此不连接为⽌,弃去混合消化液并将上述试管
中的培养液倒回培养瓶中,⽤滴管轻轻吹打细胞,制成细胞悬液。

3、染⾊制⽚:
取0.5ml 细胞悬液放于⼲净的试管中,加1-2滴(约0.1ml )染液,混合,2min 后制成临时装⽚,镜检。

4、染⾊结果:
死细胞染成蓝⾊,活细胞不着⾊。

C. ⽤⾎球计数板进⾏细胞计数
1、染⾊计数:
取上述步骤⼆所制备0.5ml 细胞悬液放于⼲净的试管中,加1-2滴(约0.1ml )染液,混合2-5min ,滴加少许染⾊后的细胞悬液于放有盖⽚的⾎球计数板的斜⾯上,使悬液⾃然充满计数板⼩室(注意:不要使⼩室有⽓泡产⽣,否则要重新滴加;在普通光镜10?物镜下计数四个⼤格的细胞数,压线者数上不数下,数左不数右)。

2、根据染⾊结果计算活细胞率:
依据死细胞染成蓝⾊、活细胞不着⾊的原则计数死细胞数和细胞总数,以如下公式计算细胞存活
率:
%100-%?=
细胞总数死细胞数细胞总数)活细胞率(
【实验结果】 A. 细胞原代培养结果:
(观察时未照下培养结果,之后培养⽫摇动导致细胞脱落⽆法观察到细胞。


B. 细胞死活鉴定结果:
C.细胞计数结果:
⽤⾎球计数板计数,分别计算了红细胞计数区域的五个⼩⽅格,计数结果如下:
项⽬ 1 2 3 4 5
细胞总数7 15 15 12 19
活细胞数 5 8 8 9 12
每个中格平均细胞总数为13
平均活细胞数为 8
活细胞率=活细胞数/细胞总数×100%=42/68×100%=61.8%
细胞密度=中格平均活细胞数×5×10000×稀释倍数
=8×5×10000×10
=4.0×10^6/ml
【注意事项】
1、⼩⿏⼀定要将⾎放⼲净并且在酒精中充分浸泡3min,防⽌杂菌污染⽆菌操作台;
2、为近⼀步保证⽆菌操作台的⽆菌环境,可在玻璃挡板⼝点⼀酒精灯,⼀般操作都在酒精灯⽕焰旁操作;
3、取⼩⿏脾时注意保持其完整,注⼊缓冲液要慢⽽准且适量,不要撑破脾脏,保证细胞分散游离出来,
也不能使游离的细胞中含有块⼉状物质;
4、培养液PH为7.0~7.4,其中加有酚酞,正常状况细胞⽣长过程代物使PH下降,培养液的颜⾊改变呈
黄⾊,因此可通过培养液颜⾊变化初步判断细胞⽣长状况;
5、⽣长状况良好的细胞膜和核完整,细胞质透明,⽽细胞质出现较多颗粒状或空泡证明细胞衰⽼。

除游
离期和衰退期外细胞⼀般贴壁⽣长。

游离期细胞⼀般圆形,折光率⾼,⽽衰退期细胞皱缩,透明度下降,⽴体感很差,较易区分;
6、倒置显微镜将物镜与载物台间的空间解放,可以允许连同培养⽫⼀同观察。

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