分子印迹技术用于模拟酶及分子反应器的研究进展

2009年第29卷
有 机 化 学
V ol. 29, 2009 第11期, 1744～1749
Chinese Journal of Organic Chemistry
No. 11, 1744～1749
* E-mail: m_zihui@yahoo.c
om
Received November 18, 2008; revised February 25, 2009; accepted April 29, 2009.
国家自然科学基金(No. 20775007)和教育部留学回国人员科研启动基金(No. 20070532001)资助项目.
N o. 11 娄忠良等：分子印迹技术用于模拟酶及分子反应器的研究进展1745
进入20世纪90年代后, M IT的三大特点——构效预定性、特异识别性和广泛实用性受到人们越来越多的关注, 而且分子印迹材料作为纳米反应器应用在立体、区域性选择性合成以及模拟酶催化等方面的应用也获得了迅猛发展[3～7]. 本文将就MIP模拟酶催化, 以及MIP作为分子反应器在有机合成反应方面的研究进展做一综述, 并简要介绍了我们课题组在相关领域里的一些初步研究结果.
1 MIP催化的常见有机合成反应
应用MIT能够得到更稳定的生物酶模拟物, 即分子印迹催化剂(M olecularly-imprinted catalyst, M IC). 在MIC的制备过程中一般都是用一个稳定的过渡态类似物(Transition state analogue, TSA)作为模版, 印迹中心具有催化活性, 通过降低反应的活化能实现催化作用. MIC即可用于间歇操作过程, 也可用于连续操作过程, 适应各种反应器. MIC目前已被用于催化多种有机反应, Wulff[8]在2002年就此做过详细的论述.
1.1 水解、醇解等交换反应
各类酯的水解反应是MIP模拟酶催化研究的热点, 对硝基苯的酯类化合物由于水解后生成的对硝基苯酚易检测, 因而被广泛用作催化反应的底物. 早在1994年, Ohkubo等[9]便制备出了能用于均相酯解反应的MIC, 研究了MIC对对硝基苯基乙酸酯水解反应的催化效率. 他们以磷酸酯衍生物的酯水解过渡态类似物为模板, 以4-(5)-乙烯基咪唑和Co2＋配位作为功能单体, 与非印迹聚合物相比, M IC使酯的水解速率得到了提高. MIC的催化效率和溶液的pH值有关, 在pH为7.0时, 反应速率常数与准一级反应速率常数之比即k obs/k uncat 的比值为6.7; 在pH为8.0时, k obs/k uncat比值仅为1.9. 另外交联剂的含量能影响该类催化剂的活性. 当对硝基苯基磷酸酯(PNP)∶乙烯基咪唑(VI)∶二乙烯基苯(DVB)的物质的量比为1∶10∶20时, k obs/k uncat达到最大值85. 通过米氏方程分析得到了pH 7.0时该催化反应的动力学参数, K m＝1.06×10－4 mol•dm－3, V max＝8.53×10－7 mol•dm－3•min－1, k2＝3.77×10－6 g－1•mol•min－1. 作者还分析了30 ℃时该反应的活化参数, 非催化过程的活化焓为80.2 kJ•mol－1, 表观反应过程为24.8 kJ•mol－1, 而催化过程为－6.2 kJ•mol－1. 非催化过程的活化熵为－74.8 J•mol－1•K－1, 表观反应和催化过程的活化熵分别为－250.4和－356.6 J•mol－1•K－1. 该MIC的催化活性较低, 其原因在于可能的TSA竞争抑制效应, 另外该催化过程的不利的活化熵值显示MIC的活性位点不能有效地降低短链底物水解反应过渡态的能量.
为提高水溶性底物的反应动力学, 提高底物的传质效率, Toorisaka等[10]利用表面分子印迹技术制备了模拟酶, 钴离子和烷基咪唑所形成的配合物在聚合物的表面形成了活性中心, 该活性中心可催化氨基酸酯的水解反应. M IC的活性较非印迹催化剂(Non-imprinted catalyst, NIC)活性高三倍. 表面印迹的效果也得到了模拟计算的支持, 他们用MD方法计算出了钴离子和烷基咪唑配合物的最低能量结构, 并模拟了印迹分子与功能单体间形成配合物的过程.
早期的MIC都是本体聚合物, 需要研磨成无定型的聚合物来使用. Takeuchi课题组[11]以atrazine为模版, 甲基丙烯酸和2-磺酸基乙基甲基丙烯酸酯为功能单体制备了具有催化活性的MIC, 在甲醇溶液中可以催化atrazine和其它的6-氯三嗪除草剂醇解转化为毒性更小的含甲基的物质, 催化活性较高, 但ametryn等结构类似物的存在会对MIC的活性产生阻抑作用. 为提高机械强度和实用性, Strikovsky等[12]则通过悬浮聚合法制备出了粒径在4～370 µm的球形的MIC. 他们用碳酸酯水解反应过渡态的类似物二苯基磷酸酯为模版, N,N'- diethyl(4-vinylphenyl)amidine为单体和交联剂, pH 7.3时, M IC可将碳酸酯的水解速率提高293倍, 氨基甲酸酯的水解速率提高160倍.
Wulff等[13]最近在羧肽没酶模拟物的研究中获得了可能是迄今为止催化活性最高的MIC, 碳酸酯水解反应的k cat/k uncat值高达410 000, 这一数值甚至远高于有催化活性的抗体. 所研究的MIC以一个稳定的TSA作模版, 具有准确空间取向的脒基和Cu2＋作活性基团. 通过1H NMR的研究和电位滴定, 选择合适的条件使功能单体同模版之间形成化学计量的非共价作用.
MIC合成条件的选择, 特别是单体和交联剂的选择往往依靠经验. M eng等[14]发展了一种半经验的分子模拟方法来优化用于催化醇解反应的MIC的组成, 以对硝基苯基乙酸酯为底物, 用Chem3D软件构建一个虚拟的酯交换反应的中间体, 使用半经验的MOPAC力场对不同的虚拟中间体进行能量最小化, 从而得到了虚拟中间体的生成焓, 生成焓越低, 中间体越稳定, 根据稳定中间体的组成所合成的MIC被认为应具有较高的转化数. 根据分子模拟的结果, 采用4(5)-乙烯基咪唑作催化单体, 衣糠酸作分子识别单体, 三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯为交联剂, 对硝基苯基乙酸酯为底物和模版, 所得的MIC的转化数为26.2, 对模版对硝基苯基乙酸酯酯解反应的催化活性较对硝基苯基水杨酸酯高6.5倍.
1.2 不对称催化合成
不对称合成是合成手性药物的关键技术, 是有机合成领域的研究热点. 由于MIT在手性识别领域里已经
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有了出色的表现, 利用MIC 催化不对称合成反应也引起了人们的关注. Locatelli 等[15]对酮的手性前体的均相氢转移还原反应进行了研究, Rh 同两个(1S ,2S )-N ,N'-二甲基-1,2-联苯基乙二胺配位形成了[Rh(I)-(N ,N'-二甲
基-1,2-联苯基乙二胺)2]活性中心, 将纯的(R )或(S )-苯乙醇钠同其共聚便得到了一种具有手性催化功能的MIC, 该MIC 可在2 d 将苯乙酮定量还原转化为(R )-苯乙醇, ee 值为70%. 如不使用MIC, 在一般的均相催化过程中同样的活性中心需要7 d 才能将苯乙酮定量转化为R -苯乙醇, ee 值为67%.
Hedin-Dahlstrom 等[16]研究的MIC 采用了共价型的分子印迹技术, 以(－)-薄荷酮为模版, 用LiAlH 4对聚合物进行衍生. 一般情况下, LiAlH 4可将(－)-薄荷酮还原为2∶1 的非对映异构体(－)-薄荷醇和(＋)-新薄荷醇, 如采用MIC 作还原剂, 这
一比例将变为1∶1, 说明所研究的MIC 对(－)-薄荷醇有对映选择性, 经测算MIC 上的对映选择性活性位点浓度为0.15 µmol/g 干树脂.
Sellergren 等[17]利用MIC 来模拟蛋白水解酶-糜蛋白酶的活性中心. 他们研究的MIC 对底物N -叔丁氧羰 基-对硝基苯基苯丙氨酸酯(BOC-Phe-ONP)的水解反应有手性选择性, 模版分子为D 构型时, M IC 可选择性催化D 构型的底物. 他们共评价了三种模拟酶, 这三种模拟酶采用不同的TSA 作模版, M IC 上含咪唑基活性位点, 同溶液中自由的咪唑基相比, M IC 可将反应速率提高10倍以上. 研究发现只有在酸性条件下MIC 才有催化作用, 在碱性条件下MIC 抑制该反应, 对过渡态的稳定性和催化效率间的关系尚未得到明确结论. 1.3 环加成反应
环加成反应也是一类重要的有机合成反应, 其中关于Diels-Alder 反应的研究比较透彻, 它们一般均具有可合成出的稳定过渡态, 该类反应是协同环加成反应, 有较大的熵阻, 因此一个具有底物选择性的“熵阱
” (entropy traps)对催化该反应就显得十分关键. Liu 等
[18]
认为MIC 可有效地创造出“熵阱”以催化双分子的Diels-Alder 反应, 在82 ℃的乙腈溶液中二氧化四氯噻吩和马来酸酐之间的Diels-Alder 反应速率被MIC 提高了270倍, M IC 的表观米氏常数K m 为42.5 mmol/L, 表观转化数k cat 为3.82×10－2
min －1
. 该MIC 的催化活性虽较一般抗体低两个数量级, 但其催化的反应是在有机溶剂中进行的(马来酸酐易水解), 抗体不能用于有机溶剂.
Santora 等[19]制备MIC 的策略是, 用金属催化提供活性, 用印迹环境控制选择性, 则用钛(IV)路易氏酸印迹的聚苯乙烯材料催化了以下的Diels-Alder 反应(Eq. 1), 其转化率为100%, 而且得到相当高的非对映选择性
(98∶2, endo ∶exo ). 反应速率同采用均相催化剂的溶液反应相当.
Brüggemann 等[20]报道了一种核壳型的MIC. 六氯内次甲基四氢邻苯二甲酸酐作为TSA 前体同功能化硅胶表面的氨基作用从而被固载, 加入单体、交联剂后, 聚合得到核壳型聚合物, 硅胶内核用氢氟酸除去后, 可用于催化有机溶剂中六氯环戊二烯和顺丁烯二酸的Diels-Alder 环加成反应(Eq. 2). 同NIC 相比, M IC 对底物体现了一定的专一性. 温度升高, M IC 的活性也随之升高, 作者发现MIC 可使反应的活化能从63 kJ•mol
－1
降至55 kJ•mol －
1. 反应的米氏常数K m ＝5.8 mmol•L －
1,
有效反应速率 v max,eff ＝0.4 µmol －
1•s －
1, 反应速率常数为k eff ＝1.1×10－
3 s －
1 .
Busi 等[21]以非极性结构的 TSA 4-(4-氨基苯基)-4-氮杂三环-[5.2.2.02,6]十一-8-烯-3,5-二酮作模版制得的丙烯酸树脂催化剂也可催化Diels-Alder 反应(Eq. 3), 底物为1-(4-氨基苯基)-3-吡咯啉-2,5-二酮. 这种所谓的“塑料抗体”(plastic antibody)所印迹的TSA 具有弱极性的bicycle[2.2.2]oct-2-ene 基团, 可催化具有弱极性过渡态的周环反应. M IC 内的活性空穴先先同极性二烯亲和物的对位氨基通过氢键发生相互作用, 然后二烯同二烯亲和物反应生成生成复合物. 二烯通过非极性作用被空间定位, 使得复合物同TSA 在构型上相似. 用抗体催化该反应时, V max 为81 µmol•L －
1•min －
1, 采用该MIC 催化时,
V max 为10 µmol•L －
1•min －
1, 虽然较抗体活性低, 但仍在
同一数量级上. 而且抗体催化只能发生水溶液中, 底物必须改性以引入极型性基团增加溶解性, 而MIC 则可用于有机溶剂, 因此适用范围更广范.
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1.4 C—C键的合成
C—C键的合成是印迹催化的难点, M atsui等[22]率先进行了这方面的尝试, 他们将dibenzoylmethane-Co2＋络合物印迹在4-乙烯基吡啶-苯乙烯-二乙烯基苯共聚物上, 制得了一种高分子模拟醛缩酶, 这个模拟酶可以选择性地催化苯乙酮和苯甲醛间的反应, 产物为chalcone(查尔酮), 这个模拟酶将反应速度提高了8倍, 并且耐受极端的反应条件, 在100 ℃的DMF中放置数周, 仍能保持80%～95%的初始反应活性.
2 MIP微结构及其在合成反应中的应用
2.1 MIP纳米催化剂
加氢还原是一类常见的有机合成反应, 这类反应常用的催化剂为无机多孔材料. Tada等[23]在常用的多孔无机催化材料Ox.50表面利用表面印迹技术, 制备了含Rh 二聚体活性中心的新型催化剂. SiO2基质内含有0.74 nm的微孔, 活性Rh二聚体中Rh—Rh键长为0.268 nm. 对所得材料用EXAFS, BET和29Si固体MASNMR进行表征. 实验证明, 通过印迹过程将该多孔催化剂催化烯烃的加氢反应速率提高了35～51倍, 反应过程中Rh—Rh键未断裂. 通过对八种不同尺寸和形状的烯烃的加氢反应速率的研究, 发现这种Rh二聚体印迹的催化剂不仅具有良好的活性和稳定性, 而且由于模板洗脱后产生的空腔对底物烯烃产生了尺寸和形状选择性, 尺寸较大的支链烯烃的活化能和活化焓比小尺寸的烯烃要小很多, 这可能意味着烯烃加氢反应的速率决定步骤有了变化. Tada等[24]还在以上工作的基础上, 研制了一种铑-氨配合物印迹的多孔硅材料, 该材料对α-甲基苯乙烯的有形状选择性, 可区分出一个甲基产生的差别, 以及苯环上不同位置的差别.
Zhang等[25]则利用1-(2-氨基苄基)-4-[1,2,3]三唑甲酸乙酯的MIP作纳米反应器, 对1,3-偶极的Huisgen环加成反应有局域选择性. 可选择性地催化丙炔酸甲酯、丙炔酸乙酯同苄基或2-叠氮苄胺的环加成反应, 产物为1-苄基-4-[1,2,3]三唑甲酸酯, M IP对产物的吸附率远高于参比聚合物, 对产物的类似物1-苄基-5- [1,2,3]三唑羧酸酯的吸附则无选择性.
2.2 分子反应器及其应用
在药物化学中, 通过组合化学合成先导化合物的方法已被广泛接受. 然而, 大多数组合化学的方法仍需要繁复的合成和筛选步骤. Sharpless等[26]提出的click chemistry, 以酶的活性中心为反应器选择building block 并合成其抑制剂, 活性中心的配体的协同定位会加快反应的进行. Sharpless的课题组以乙酰胆酯酶作为分子反应器从building block里选择性组装了三唑相连的二价抑制剂, 并开展了一系列的相关工作. 与Sharpless工作相对应, Mosbach等[27]也使用MIP或生物分子作为分子反应器合成了一系列酶抑制剂, 他们[28]以蛋白酶激态释放酶为模版合成了MIP, 利用该MIP合成的三嗪衍生物, 能够大大抑制酶的活性. 他们报道了两种新的分子反应器, 第一种是印迹了酶抑制剂的MIP, 洗去模版抑制剂后, 在MIP空穴中进行缩合反应, 缩合反应的产物与酶抑制剂具有相同的性质. 因此他们认为在MIP空穴中得到的产物是被双重印迹的“double imprinting”, 因为MIP 与生物一样都能生成反抗体释放免疫球蛋白, 他们称这种方法为“anti-idiotypic”方法. 第二种分子反应器是以酶为反应器, 直接在生物活性位点里加入building block, building block发生缩合反应后经洗脱得到新的酶抑制剂, 他们把这方法称之为“direct mold-ing”. Zhang课题组[25]还研究了可选择性催化1,3-偶极Huisgen环加成反应的MIP纳米反应器.
本课题组最近在MIP分子反应器的研究方面也取得了一定的进展. 在乙腈和三聚甲醛合成八元氮杂环的反应中, 常伴有六元氮杂环副产物, 分离十分困难. 我们通过机理研究发现六元氮杂环在形成过程中有一个稳定的中间体N,N-亚甲基二乙酰胺生成, 我们将该中间体的MIP加入反应液, 中间体被MIP富集捕获, 并在MIP形成六元环, 而反应液中则只有八元氮杂环产物生成, 有关结果正在整理中.
2.3 分子印迹的超分子体系
超分子体系的分子反应器的也是近年来的研究热点, Griebel和Maier[29]成功地合成了含有单一催化中心的超枝化聚酯. Breslow等[30]合成的聚酰胺-胺型(PAMAM)树状高分子, 以吡哆胺为核, 手性氨基基团为加帽基团(capping group), 可将α-酮酸转化为相应的手性氨基酸. Zimmerman等[31]则首次报道了分子印迹的树状高分子, 他们以卟啉为模版, 模版分子以共价键连接到树状高分子核心, 被印迹的树状高分子里还有发色团, 这种印迹树状高分子带有单一结合点, 可以选择性吸收卟啉[32,33].
环糊精作为超分子材料近几年已经成为研究热点. 环糊精可作为模拟酶催化多类酯的水解. 如果将环糊精作为功能单体应用在分子印迹技术中, 可以大大提高模拟酶及分子反应器的选择性. Hishiya等[34]以β-环糊精为单体合成的MIP, 对类固醇、氨基酸衍生物、抗体和手性二肽的选择性识别能力更高. Yang等[35]以β-环糊精为功能单体成功合成胆红素的MIP, 可选择性地从血液样品中可逆地吸附胆红素, 该MIP的特异性识别能力来源于β-CD桶状结构对目标化合物的包结作用和以及
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β-CD上的羟基同目标化合物间氢键作用的协同作用. Qin等[36]通过把β-环糊精和丙烯酰胺固载在硅胶上, 制备了表面分子印迹聚合物, 可以在水相中选择性地识别色氨酸.
2.4 分子印迹的微结构
Yan等[37]利用软光刻技术在硅片上构造MIP的微结构. 他们用2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)作模版, 在聚二甲基硅氧烷(PDMS)基质上构建了横截面尺寸为20 µm×20 µm的MIP微结构. Brazier等[38]用同样的方法制作了PDMS微通道, 用作分子印迹的光波导, 实现对目标化合物的荧光检测. 而Yang等[39,40]研制的表面印迹纳米线, 不仅可选择性地识别小分子氨基酸, 还可识别大分子的蛋白质. Conrad II等[41]利用立体微光刻技术制作出了分子印迹的3D微结构, 这些微结构将被用于先进的化学传感器和临床诊断应用.
3 其它
MIP由于其特异性的分子识别能力被广泛用于各种分离过程. 有机合成反应往往伴随着副反应的发生和副产物的生成, 某些副产物同主要产物结构类似, 因而难以同产物分开, M IP在产物的提纯和除杂方面已经体现了良好的应用前景. 克拉维酸是β-内酰胺酶抑制剂, 常同青霉素类抗生素一同使用, 克拉维酸由发酵合成, 该过程会产生副产物琥珀酰L-酪氨酸, 产品经精制纯化后, 仍有2%左右的该副产物, Yu等[42]用分子印迹技术制备了一个对琥珀酰L-酪氨酸具有选择性吸附能力的吸附剂, 该MIP可将克拉维酸中的副产物浓度降至2%以下. M IP在手性分离方面的研究也很多[43～48], 本文不作专门描述.
MIC制备最常用的方法是利用TSA作模版, 印迹在丙烯酸树脂和多孔硅材料上, 现在将模版分子通过冻干法印迹在酶等生物材料上的生物印迹(Bioimprinting)技术在提高生物活性物质的选择性上也体现出了一定的价值. Ohya等[49]首次用分子印迹对牛血清白蛋白(BSA)进行了改性, 用N-甲基-N-(4-硝基苄基)-6-氨基戊酸作模版, 被印迹的BSA可显著提高(4R,4S)-4-氟-4-(4-硝基苯基)-丁-2-酮脱HF的反应速度, 而以(4R,4S)-4-羟基-4-(4-硝基苯)-丁-2-酮为底物时, 被印迹过的酶的活性被完全抑制. 这种新颖的生物印迹和催化的原理如图1所示. Slade等[50]已采用这种生物印迹技术, 用N-异丙基-4-硝基苯基胺作为模版印迹了蛋白质, 该印迹蛋白质对4-氟-4-(对硝基苯基)丁烷-2-酮的脱HF反应有催化活性, 同非印迹的酶比, 它有更高的β-消去活性
. 图1 生物印迹牛血清白蛋白制备过程及催化反应原理示意图
Figure 1Schematic illustration of the preparation of imprinted bovine serum albumin (Imp-BSA) and the reaction catalyzed by the Imp-BSA
4 结论
分子印迹技术在用于样品制备的固相萃取领域已经实现了商品化, 但在催化有机合成反应方面离实际应用尚有较大差距, M IC的催化活性同天然酶相比仍有较大差距, M IC上也容易发生产物的阻抑作用, 从而影响了它的转化数. 发展具有“induced fitting”, 使MIC能及时释放产物, 是MIC走向实用化所必须解决的问题. 另外, 生物印迹、MIP分子反应器以及利用MIPs来改变化学平衡或调控反应中不同中间体的动态平衡, 从而降低副产物的生成今后也应受到一定的关注. References
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